CN1380418A - 蜘蛛丝基因的棉纤维细胞表达载体质粒 - Google Patents
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Abstract
将蜘蛛丝基因与棉花纤维细胞特异表达的启动子重组,构建成棉纤维特异表达蛛丝蛋白的载体质粒。将该质粒导入棉花后,可在棉纤维中表达蛛丝蛋白,从而改良棉花纤维特性。
Description
本发明涉及基因重组与表达调控,即将蜘蛛的丝蛋白基因与棉花纤维细胞表达的调控元件重组,构建成蛛丝的棉纤维细胞表达载体质粒。蜘蛛共含七种特化的腺体,Aciniform腺体分泌包裹猎物用的蛛丝;Cylindriform腺体分泌附着于卵表面的蛛丝;Pyriform腺体分泌附着及连接用丝;Major Ampullate腺体分泌拖丝及蛛网骨架结构用丝;Minor Ampullate分泌蛛网辐射状部分用丝,Flagiform腺体分泌俘获猎物用粘丝,Aggregate腺体分泌其它附着成分。其中拖丝(Draline silk)和粘丝(Flagiform silk)由于其特殊的强度与韧性,具有非常诱人的应用前景。
蛛丝蛋白的基因相当大,其mRNA约为15kb,而基因组DNA约为30kb左右。整个蛛丝蛋白的基因由13个外显子组成,其中3-12外显子的序列基本相同,为编码含有GPGGXn,GGX及Spacer区的高度重复序列;1-2外显子编码信号肽,作用于腺体细胞到腔内的分泌过程;13外显子除编码3-12所编码的重复序列外,还编码一段非常保守的C端序列。蛛丝蛋白在二级结构上形成β片层,并彼此平行形成空间上类似弹簧的结构,通过水桥连接从而形成弹性非常高的网状结构。
由于其广泛的应用前景,蛛丝的基因工程产业化研究受到高度的重视,至今利用的生物反应器有大肠杆菌、甲醇酵母、家蚕、山羊与小鼠的乳腺细胞,烟草与马铃薯等。但产量、溶解性及加工工艺等问题阻滞了该领域的发展与产业化。
棉花纤维是由胚珠外珠被表皮细胞在受精前后经分化突起、伸长和细胞壁增厚而形成的。其形成过程可分为4个时期,即细胞分化与伸长启动期、细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。至今已分离出10余个纤维细胞内特异表达基因的启动子,如纤维发育早期的E6、初生壁合成至次生壁合成前期H6S、Rac13,纤维伸长期的LTP、ACP、Expansin、CAP和Annexin,纤维发育后期的FbL2A。这些启动子可以调控它们的下游基因在棉花纤维细胞中表达。
本发明是将纤维细胞特异表达的启动子与蜘蛛丝基因进行基因重组,构建成蜘蛛丝在棉花纤维细胞内特异表达的重组质粒。将该质粒转化棉花,转基因棉花的纤维细胞中将含有蜘蛛丝蛋白,从而改变棉花纤维的强度与韧性。
本发明包括以下几种技术:
1.棉花总DNA的提取和检测
2.棉花纤维特异启动元件的克隆;
3.棉花纤维特异启动元件GUS表达载体的构建;
4.棉花纤维特异启动元件调控下蜘蛛丝基因的植物表达载体pBinTLADF3的构建;
附图图面说明
图1.pBITLADF3载体构建流程示意图:从pBlueADF3上切下蜘蛛丝基因ADF3片段,经过两步中间载体pUC19和pGEM-7Zf,将一端的XhoI酶切位点置换为SacI,然后连入载体pPTL221,最终得到载体pBITLADF3。
实施例1棉花总DNA的提取
(1)取新陆早7号棉花种子,经无菌处理接种在培养基上,待其长出叶片。
(2)称取4克新鲜叶片作为植物材料,在液氮中研成粉末,装入50ml离心管中,加入20ml冰浴的提取缓冲液,混合均匀。
(3)2,700g离心20分钟,取上清加入8ml裂解缓冲液,充分涡旋混合均匀,65℃温浴20-30分钟。
(4)加入10ml氯仿/异戊醇(24∶1),颠倒混匀,12000rpm离心5分钟,取上相转入一新离心管中。如此重复数次,直至分界面澄清为止。
(5)吸取上相到另一新Eppendof管中,加入2/3体积冰冷的异丙醇(约5.6ml),室温静置20-30分钟。
(6)6000rpm离心10分钟,收集沉淀物。
(7)加入1ml 70%乙醇温和振荡冲洗2~3次,吹干。
(8)加入500μl TE 65℃温浴10-30分钟,重悬沉淀。
(9)重悬沉淀后,10,000g离心5分钟沉淀多糖。然后将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管。
(10)溶解于TE的DNA可保存几周至数月。
(11)紫外检测结果浓度为300ng/ul,A260/A280的比值为1.89,凝胶电泳结果DNA大于20KB。
实施例2棉花纤维特异启动元件的克隆
(1)LTP12引物上游引物 5′-GC GGT ACC AAA CAA TTA AGT ATT GAT ACC AGA-3′下游引物 5′-GG CTT AAG GAC ATT GAG CTA GCC ATA
(2)PCR扩增:高保真PCR反应体系如下:无菌ddH2O 70.5μl;10×ExBuf(Mg2+free)10μl;dNTP Mixer 8μl;Mg2+ 6μl;ExTaq DNA Polymerase 0.5μl;引物12μl;引物22μl;模板(棉花总DNA)1μl。反应程序:预变性94℃ 3分钟-(94℃40秒-58℃ 60秒-72℃ 60秒)X30个循环-72℃ 10分钟。
(3)反应完成后,取20μl样品经1.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下用一次性刀片小心切下位于800bp左右的特异片段,用DNA片段回收试剂盒回收并纯化后溶于20μl ddH2O中,-20℃保存。
(4)将扩增片段连接到pGEM-T载体上,进行序列分析。
实施例3棉花纤维特异启动元件GUS表达载体(pPTL221)的构建
(1)取7μl PCR回收产物与1μl pGEMT载体连接,转化DH5α,测序鉴定得pGEMTPTL12。
(2)将pGEMTPTL12以PstI酶切补平后再以HindIII酶切,所得片段连接至经HindIII,BamHI双酶切BamHI补平的pBI101.3载体片段,转化鉴定,即得pPTL101。
(3)阳性克隆以HindIII、SmaI双酶切鉴定大小,pTL12大小为0.8KB左右。
(4)将pGEMTPTL12以SphI、PstI酶切所得LTP12启动子片段连接至SphI、PstI酶切的pUC19载体片段,得pUCPTL12。蓝白斑筛选阳性克隆经SphI,PstI双酶切鉴定,可见一条0.8kb左右条带,即LTP12启动子。
(5)pUCPTL12经SphI、XbaI双酶切所得LTP12启动子片段与SphI、XbaI双酶切pBI221载体片段连接,即得pPTL221。由于pBI221上35S启动子的大小与LTP12相近,鉴定中利用了pBI221上的另外一个位点PstI,因LTP12下游有一个PstI位点,鉴定中以PstI单酶切结果得大小为0.8kb左右条带,说明LTP12正确插入。pPTL221经PstI单酶切后,可见一条0.8kb左右条带,即LTP12启动子。
实施例4棉花纤维特异启动元件调控下ADF3的植物表达载体的构建pBINTLADF3:
(1)pBlueADF3以EcoRI、XhoI酶切所得ADF3片段连接至EcoRI、SalI酶切的pUC19载体片段得pUCADF3。经EcoRI,HindIII酶切鉴定得2kb左右条带,为ADF3。
(2)将pUCADF3以EcoRI、HindIII酶切所得ADF3片段连接至EcoRI、HindIII酶切的pGEM7Zf载体片段得pGEMADF3,蓝白斑筛选所得阳性克隆经EcoRI,SacI双酶切鉴定,可见一条2.0kb左右条带,即ADF3。
(3)将pBlueADF3以EcoRI酶切补平后再以SacI酶切所得ADF3片段连接至PstI补平的pPTL221经PstI,SacI酶切所得载体片段得pBITLADF3。阳性克隆经Smal,SacI双酶切并以pBI221酶切产物为对照,结果pBI221双酶切产物可见1条2.0kb左右条带为GUS片段;pBITL221双酶切产物明显变大,并且未切下2.0kb左右条带,说明ADF3已经成功插入。
(4)将pBITLADF3以EcoRI,KpnI酶切后所得pLTP12-ADF3-NOSt片段连接至pBIN19经EcoRI,KpnI酶切所得载体片段,转化筛选,得pBINTLADF3。经EcoRI,KpnI酶切鉴定得3.1kb大小片段,说明pLTP12-ADF3-NOSt成功插入。
Claims (8)
1.一种载体质粒,含有在棉花纤维细胞表达的启动子、蜘蛛丝蛋白基因、终止子和筛选标记基因,其特征在于将蜘蛛丝蛋白的基因重组到棉花纤维细胞表达的载体上。该质粒的转基因棉花纤维将含有蜘蛛丝蛋白。
2.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于含有高度重复序列的蜘蛛丝蛋白基因,其表达产物包括拖丝(Dragline silk)和粘丝(Flagiform silk)。蛛丝蛋白的重复部分由GPGGX/GPGQQ;GGX;poly-Ala/poly-Gly-Ala和Spacer区组成。
3.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞伸长期LTP、ACP、Expansin、CAP、Annexin的启动子。它们能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞伸长期表达。
4.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞发育后期FbL2A的启动子,它能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞次生壁增厚期表达。
5.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞初生壁合成至次生壁合成前期H6S、Rac13的启动子,它能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞伸长启动期表达。
6.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于蜘蛛丝基因的3’端组装了增强表达能力的nos终止子。
7.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于该质粒组装NPTII基因,作为转基因植物的筛选标记,可以用卡那霉素筛选。
8.根据权利要求1所述的载体质粒,其特征在于该质粒组装Bar基因,作为转基因植物的筛选标记,可以用除草剂Bastar筛选。
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