CN101624595A - 棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子序列或其片段。该启动子长2600bp，它们可以用来调控目标基因在植物体特殊的组织器官表达，进而调控该组织器官的生长发育，获得优良的农艺性状。

Description

棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体而言，本发明涉及油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子及其片段、含有该启动子及其片段的植物表达载体、由所述植物表达载体转化的转化体、以及含有上述启动子及其片段的转基因植物的制备方法。

背景技术

植物基因工程需要获得能调控功能基因在特定组织或部位表达的多种遗传因子。一种主要的调控因子是启动子，它能控制基因的转录起始。在植物基因工程中需要使用多种启动子。其中，在植物营养枝发生时期控制目的基因特异表达的启动子有利于控制植物的生长性状；启动子在植物花蕾和子房形成时期控制目的基因表达的特性可以用来调控植物的花蕾和子房的发育，从而调控植物的果实和种子的产量和品质；在棉花纤维发育时期控制目的基因表达的启动子有利于调控棉花纤维的生长发育。

在生产应用中，控制植物营养枝的发生具有重要的意义。例如，在棉花的种植过程中，需要多次去掉多余的营养枝，以保证棉花的品质和产量；在林木的种植过程中，需要去掉大部分侧枝，以保持主茎的生长优势，促进其及早成材。目前已经发现了多种基因参与植物营养枝发育的调控过程(如：IFL1/REV、SPS/BUS、CUC1/CUC2、AXR1-12、YUCCA、RMS1-5、Bi/TO、和LS等)，这些基因编码的产物包括了转录因子和植物激素合成与运输相关的酶和蛋白。用CaMV35S等强启动子增加或减少上述基因的表达水平，往往会影响植物正常的生长发育，产生较大的不利性状。

棉花纤维是由棉花胚珠表皮细胞极度伸长形成的，在棉花纤维的生长发育过程中，存在四个相互重叠的发育时期，即纤维起始分化期、纤维快速伸长期、次生壁合成沉积期、和脱水成熟期。在这些过程中，棉花纤维的生长发育也受到了多种基因表达的调控，如：植物激素合成酶基因、蔗糖合成酶基因、微管蛋白合成酶基因、和expansin蛋白基因等。在棉花纤维特定的发育时期调控这些基因的表达水平，可以用于改良棉花纤维的品质和产量。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子序列及其片段，该启动子是以棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因设计引物，经YADE法获得的该基因上游2600bp长的序列，其可在棉花营养枝发生时期和在棉花纤维中控制目的基因的特异表达。特别是，该启动子可以在新生芽的生长锥、花蕾和子房上以及在棉花纤维发育的次生壁合成期驱动报告基因的特异表达。

根据本发明的一个方面，棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列，通过对该启动子进行了序列缺失分析，得到了具有启动子功能的最低片段核苷酸序列，实验分析发现SEQ ID NO.1的第2025-2600位核苷酸片段以及第2135-2600位核苷酸片段不能驱动报告基因的转录，而第1488-2600位核苷酸片段能够正常驱动报告基因的转录。而且第1488-2600位核苷酸片段具有驱动基因表达的特异性，可以判断1488-2135位的核苷酸片段为GhDWF4启动子的核心区域，在该区域存在驱动基因表达特异性和表达水平的重要元件。此外，SEQ ID NO.1的第930-2600位核苷酸片段和第4-2600位核苷酸片段也能够正常驱动报告基因的转录，而且在正常的棉花栽种条件下，这两个启动子片段驱动基因表达的特异性与该启动子序列第1488-2600位核苷酸片段的驱动基因表达的特异性相同。因此作为启动子序列，其至少含有SEQ ID No.1的第1488-2600位核苷酸片段，也可以含有930-2600位核苷酸片段和第4-2600位核苷酸片段，启动子的全序列为如SEQ ID NO.1所示。

本发明的又一个目的在于提供含有GhDWF4基因启动子或其片段的植物表达载体。所述含有GhDWF4基因启动子或其片段的植物表达载体是采用基因工程方法，将GhDWF4基因启动子或其片段插入到适宜的表达载体中而获得。

根据本发明的一方面，构建了含有GhDWF4基因启动子及其片段的pBI121-D4P植物表达载体，其具有如图5所示的结构。

本发明的又一个目的在于提供含有GhDWF4基因启动子序列的转化体。将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。

根据本发明的一方面，采用电击法将含有GhDWF4基因启动子及其片段的植物表达载体pBI121-D4P转化到根癌农杆菌LBA4404中获得转化体。

本发明的又一个目的在于提供制备含有GhDWF4基因启动子及其片段的转基因植物的方法。用本发明的GhDWF4基因启动子及其片段构建植物表达载体pBI121-D4P，将所述植物表达载体转化宿主获得含GhDWF4基因启动子及其片段的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。所述转基因植物优选为棉花。

本发明的另一目的在于提供棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子的应用。所述应用包括控制植物营养枝的发生，调控棉花纤维的发育。

利用GhDWF4基因启动子，可以控制与营养枝发育相关的基因在特定组织部位表达或者抑制其表达，进而控制植物营养枝的发生。同时，由于GhDWF4基因启动子控制目的基因表达的组织特异性，可以最大限度的减少目的基因表达水平的增加或减少对植物生长发育造成的不利影响。

GhDWF4基因的启动子通过控制棉花纤维的生长发育过程中的多种基因的表达也可以用于改良棉花纤维品质和产量。

附图说明

图1、示出GhDWF4基因在棉花基本组织中表达水平的图表；

图2、示出GhDWF4基因在棉花胚珠和纤维的不同发育时期中表达水平的图表；

图3、示出GhDWF4启动子片段扩增示意图；

图4、示出GhDWF4启动子及GhDWF4基因的序列信息，其中黑体字母ATG表示翻译起始密码子，划线部分为GhDWF4基因编码区，浅灰标记部分依次为引物GhD4P5、GhD4P4、GhD4P3、GhD4P2以及GhD4P1的核苷酸序列，深灰标记部分为引物GhD4P的反向互补序列。

图5、示出pBI121-D4P载体结构图；

图6、示出pBI121-D4P载体构建图谱；图中所示的pBS-D4promoter载体代表pBS-D4P1、pBS-D4P2、pBS-D4P3、pBS-D4P4和pBS-D4P5五个载体，Ampr，氨苄青霉素抗性基因；ori，大肠杆菌复制起点；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，即CaMV35S启动子，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Nosterm，Nos终止子；Nosprom，Nos启动子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界；

图7、示出转基因棉花在顶芽、花芽、花蕾、子房和节等部位的GUS染色结果；

图8、示出转基因棉花在30dpa的棉花纤维和胚珠中的GUS染色结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明。除非另有说明，否则本发明实例中的试剂药品均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施例1、GhDWF4基因在棉花植株中的表达分析

1.棉花RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL 65℃预热的RNA提取液(2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L亚精胺(Spermidine)，2，0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)以及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。用70％的酒精漂洗沉淀一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。

2.cDNA第一链的合成

取约10μg总RNA加入到DEPC-处理的扩增管中，加入1μL2.5μmol/LOligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12μL，70℃水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入4μL5×反应缓冲液，2μL 10mmol/LdNTPs，1μL RNase抑制物(20U)，37℃处理5min。加入1μL AMV RTase(5U)后，保温程序为42℃，60min；70℃，5min；5℃，5min。程序结束后，于-20℃冻存产物。

3.Quantitative Real-time PCR分析GhDWF4的表达水平

用cDNA第一链合成试剂盒(MBI)合成不同组织和器官的RNA的第一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，上下游引物各5μmol/L和1μL第一链产物。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；预设循环数为35。用棉花Histone3基因作内标，Histone3的5’-上游引物是GhHIS1(SEQ ID NO：2)，3’-下游引物为GhHIS2(SEQ ID NO：3)。扩增GhDWF4基因的5’-上游引物序列为D4-500(SEQ ID NO：4)，3’-下游引物序列为GhDWF4-2(SEQ ID NO：5)。在运行Quantitative Real-time PCR前，用相同的引物和模板以相同的程序扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带。

如图1所示，GhDWF4在大部分组织中相对表达水平都很低，只在幼嫩茎、幼嫩叶片和节中相对表达水平较高。如图2所示，GhDWF4在开花后8-16天的棉花胚珠中表达水平较高，在开花后22天的棉花纤维中表达水平急剧升高。

实施例2、GhDWF4基因启动子序列的克隆

1.棉花基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法(肖月华和罗明，利用YADE法进行棉花基因组PCR步行.遗传学报2002.29：62-66)提取棉花基因组DNA。选取约0.5g幼嫩棉花叶片，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入10mL离心管，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀，65℃水浴30min，期间混匀2-3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，混匀静置30min。挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗3次，再用无水乙醇漂洗一次，风干，溶解于500μL TE溶液中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)，取上清，加2倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心10min，弃上清，用75％的乙醇漂洗沉淀，风干，溶解于200μL的TE溶液，-20℃保存。

2.利用YADE法克隆棉花GhDWF4基因的启动子序列

根据棉花油菜素内酯合成酶基因GhDWF4的cDNA序列(GenBank登录号：DQ996567)设计特异性引物D4Y1(SEQ ID NO：6)和D4Y2(SEQ ID NO：7)。

利用YADE技术(Y-shaped Adaptor Dependant Extension)(肖月华和罗明，2002)进行染色体爬行。具体步骤如下：

将2μg棉花基因组DNA用10U限制性内切酶按说明书的条件在20μL的体系中酶切过夜，酶切后，70℃灭活10min。10μL体系中加入2μL与所用内切酶切割位点匹配的接头短链(100μmol/L)，5U的多聚核苷酸激酶，1μL 10mmol/L的ATP。37℃保温30min，70℃灭活10min。在上述体系中再加入2μL10×退火缓冲液，2μL接头长链(SEQ ID NO：8)(100μmol/L)和6μL ddH₂O。65℃保温10min，缓慢冷却到室温，接头短链和接头长链退火形成接头。取制备好的2μL接头(10μmol/L)和5ng酶切产物，加5U的T4DNA连接酶，16℃连接过夜。

线性扩增：25μL体系中包含1μL的连接产物，1×ExTaq缓冲液(无Mg²⁺)，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl₂，200μmol/L特异性引物D4Y1，1U的ExTaq DNA聚合酶(94℃预变性时加入)。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min30sec，40个循环；72℃，10min。

指数扩增：25μL体系中包含1μL的线性扩增产物，1×ExTaq缓冲液(无Mg²⁺)，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl₂，200μmol/L特异性引物D4Y2，200μmol/L接头引物(SEQ ID NO：9)，1U的ExTaq DNA聚合酶(94℃预变性时加入)。扩增条件与线性扩增条件相同。

通过扩增获得约3.0kb的DNA序列。该序列进行TA克隆，连接到pBS-T载体上，重组子标记为pBS-GhDWF4。测序结果表明该片段长2870bp，在末端有214bp的碱基与GhDWF4基因cDNA的5’末端完全一致，表明所克隆的DNA片段是GhDWF4基因的上游调控序列，该上游调控序列包含了2600bp的启动子序列(SEQ ID NO：1)。

实施例3、GhDWF4基因启动子分析转基因棉花材料的获得

1.序列缺失启动子片段的获得

如图4所示，根据克隆的GhDWF4基因启动子序列设计特异性引物GhD4P(SEQ ID NO：10)、GhD4P1(SEQ ID NO：11)、GhD4P2(SEQ ID NO：12)、GhD4P3(SEQ ID NO：13)、GhD4P4(SEQ ID NO：14)和GhD4P5(SEQ IDNO：15)，以pBS-GhDWF4启动子载体为模板，扩增条件：94℃预变性5min，94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min30sec，30个循环；72℃，10min，PCR扩增获得5条不同长度的启动子序列片段。这5条启动子序列片段分别标记为D4P1(从2135到2600)、D4P2(从2025到2600)、D4P3(从1488到2600)、D4P4(从930到2600)和D4P5(从4到2600)。

2.序列缺失启动子融合GUS基因的载体构建

将扩增所得的5条启动子片段分别连接到pBS-T载体上，得到pBS-D4P1、pBS-D4P2、pBS-D4P3、pBS-D4P4和pBS-D4P5五个载体，统一记作pBS-D4promoter载体，分别对他们进行酶切与测序检测，结果均表明5’端靠近HindIII位点，3’端靠近EcoRI位点。这些载体都用XbaI酶于37℃处理约4h，再用HindIII进行部分酶切，37℃处理约15min。分别回收启动子序列片段并连接到用HindIII和XbaI酶切的pBI121载体中，即用不同长度的启动子片段分别替换了pBI121载体中的35S启动子，构建了GhDWF4启动子不同长度片段与GUS基因融合的植物表达载体，pBI121-D4P1::GUS、pBI121-D4P2::GUS、pBI121-D4P3::GUS、pBI121-D4P4::GUS、pBI121-D4P5::GUS。

3.转基因棉花材料的获得

按照Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上步构建的植物表达载体采用电击法分别转化根癌农杆菌LBA4404。用上述转化的农杆菌LBA4404，侵染暗培养萌发2-3天的冀棉14下胚轴，方法参照罗明等人的棉花遗传转化方法进行(Luo等人，2007，The Plant Journal.51：419-430)。筛选卡那霉素抗性转基因棉花植株提取基因组DNA，采用PCR的方法鉴定转化有不同表达载体的转基因植株。

实施例4、转基因棉花中GhDWF4基因启动子的表达特性分析

取转基因棉花材料和野生型材料的不同组织进行GUS组织化学染色，发现在根、茎、叶片、花和开花当天的棉桃各部位均未能观察到GUS活性。表明GhDWF4基因的启动子在大部分组织中表达水平极低或者不表达。结合GhDWF4基因在棉花不同组织中的表达分析，对转基因棉花的节和转基因棉花顶端的幼嫩茎进行了染色，发现在这些部位表现出GUS活性。

如图7所示，对这些部位作横切和纵切染色观察，发现GUS活性在侧芽原基中很强，在顶芽中的横切和纵切染色发现，GUS活性在顶端幼嫩茎的髓部和顶芽中活性很强。对棉花刚现蕾的花蕾和现蕾一周的花蕾做了GUS染色分析，发现在刚出现的花蕾中有很强的GUS活性，在现蕾一周的花蕾的子房中有较强的GUS活性，而在邻近的其他组织部位没有检测到GUS活性，表明GUS基因在这些部位特异性表达。

GhDWF4基因在棉花纤维的不同发育时期中的表达分析表明，GhDWF4基因在棉花纤维发育的后期表达水平较高。进一步观察了转基因棉花的不同发育时期的棉花纤维中GUS活性的变化。发现在开花后6-10天的棉花纤维中检测不到GUS活性，而在开花后30天的棉花纤维中GUS活性极强(如图8所示)。这些结果表明GhDWF4基因的启动子能够控制目的基因在芽的形成时期特异表达，和在棉花纤维发育的后期特异性表达。

对不同长度启动子的表达特性的比较发现，D4P1和D4P2材料在所有部位均没有表现出GUS活性，表明这两个启动子片段不能够驱动报告基因表达或者驱动报告基因表达的效率很低。而D4P3、D4P4、和D4P5三个启动子片段驱动GUS基因表达的组织器官特异性相同。

CQ302-09P103646.txt

序列表

<110>西南大学

<120>棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子及其应用

<130>CQ302-09P103646

<160>15

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2600

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium spp.)

<221>misc_feature

<222>(1)..(2600)

<400>1

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<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>Histone3的5’上游引物

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<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(19)

<223>Histone3的3’下游引物

<400>3

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<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>GhDWF4的5’上游引物

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<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>GhDWF4的3’下游引物

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<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列

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<222>(1)..(21)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>6

tgctggtgca tgaattcacc t             21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(21)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>7

gtaaggcctc aagtaaccga t             21

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(28)

<223>接头序列

<400>8

cggtaggatc ccgcagaacg acggccag      28

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(19)

<223>接头序列

<400>9

cggtaggatc ccgcagaac                19

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(21)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>10

tcttcaatcc tttcccactc c                    21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>11

ctttgactca tcgcatttgc                    20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>12

agaaaagggc tatcagtctg                   20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>13

aactaactac attcgagcac                  20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>14

tataccaact ttcgacctac                 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>根据GhDWF4设计的引物

<400>15

taggatcccg cagcaacgac                20

Claims (10)

1.一种棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子，其特征在于，其至少包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第1488-2600位核苷酸的片段。

2.权利要求1所述的棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子，其特征在于，所述启动子包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第930-2600位核苷酸的片段。

3.权利要求1所述的棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子，其特征在于，所述启动子包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第4-2600位核苷酸的片段。

4.权利要求1所述的棉花油菜素内酯合成酶GhDWF4基因的启动子，其特征在于，所述启动子为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.一种含有权利要求1-4中任一项所述的启动子的植物表达载体。

6.根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述载体具有如图5所示的结构。

7.一种转化体，包含权利要求1-4中任一项所述的启动子及宿主。

8.权利要求1-4中任一项所述的启动子在制备转基因植物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述转基因植物为棉花。

10.一种含有权利要求1-4中任一项所述的启动子的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：

(1)将所述启动子序列可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；

(2)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(3)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。

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