CN1356868A - 制备无病毒植物的方法 - Google Patents
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Abstract
在通过鳞茎或球根中的营养叶基部的培养形成的圆顶状组织中,活跃的细胞分裂进行。因此预期该组织无病毒。通过分离并培养该圆顶状组织可以获得无病毒植物。
Description
技术领域
本发明涉及制备以蒜为代表的葱属植物和其他经由鳞茎(scaly bulb)和球根(bulb)繁殖的植物的无病毒植物的方法。更具体地说，本发明涉及通过分离和培养通过培养营养叶基部获得的圆顶状组织(dome-shaped tissue)而制备无病毒植物的方法。
背景技术
属于葱属的植物包括大蒜、洋葱、大葱、小葱、分葱、韭葱、细香葱等。它们广泛地用作食用植物和调味品。自古时，已发现大蒜具有药用价值，还被用作摧欲药、恢复体力药等。葱属植物在包括日本的世界很多地方栽培。但是，近年来，病毒损害给它们的栽培带来严重的问题。作为蒜的这种病毒，例如已知的大蒜病毒(GarVs)、韭菜黄条纹病毒(LYSV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)、大蒜潜伏病毒(garlic latent virus，GLV)等。已知大蒜是通过营养繁殖生长的农作物，因此，一旦其被病毒感染，感染会遗传给后代，导致病毒污染的传播。类似的损害对属于葱属的非大蒜的其他植物也已知，亟需必要的方法来消除这样的病毒污染。
另一方面，最近建立起植物的组织培养方法，该方法的应用可以消除通过营养繁殖生长的多种植物的病毒。众所周知，即使被病毒感染的植物在苗端(分生组织)也没有病毒。因此，通过培养苗端并由此再分化植物，可以得到没有被病毒感染的植物(无病毒植物)。还已知通过培养植物组织以形成愈伤组织并再培养该愈伤组织，即可消除病毒。通过再分化来自无病毒愈伤组织的植物，可以得到无病毒植物。
对于以蒜为代表的葱属植物，前述方法已被用来消除病毒，并且事实上无病毒葱属植物已得到栽培。
然而，通过培养苗端以获得无病毒葱属植物的方法，一个苗端通常仅产生一个或少数几个植物。为了获得大量植物，必须摘取很多苗端。而且，由于苗端位于葱属小鳞片的基部，其大小约0.5毫米或更小，摘取苗端需在显微镜下操作。因此，摘取苗端的操作麻烦且工作效率低。
另一方面，在再分化愈伤组织以获得无病毒葱属植物的方法中，一旦愈伤组织被诱导，可能使愈伤组织大量生长。然而，因为愈伤组织培养期间经常遇到突变，因此很难获得同种遗传性状的葱属植物。
因此，开发了大量培养葱属植物的组织培养方法，其通过苗端培养使葱属植物无病毒，以及开发了利用营养叶基部制备再分化植物的方法，其使从少量材料生长大量无病毒植物成为可能(日本未审查的专利公开6-197650)。然而，这些方法自始至终需要无病毒植物作为材料，因此需要用网室(net house)将所述植物保持在离体培养中。
本发明的公开
本发明涉及从感染了病毒的植物的非苗端组织制备无病毒植物的培养方法。
通过培养营养叶基部，可以通过圆顶状组织诱导植物分化。本发明的发明者已经首次发现圆顶状组织进行活跃的细胞分裂，并且其中没有病毒存在，如在苗端中一样。因此，通过仅分离圆顶状组织并培养之，就可能制备无病毒植物。由于由一个小鳞片形成多个圆顶状组织，与常规的苗端培养方法相比，效率大大提高。
因此，本发明提供制备无病毒植物的方法，其特征在于分离并培养圆顶状组织，所述圆顶状组织通过培养外植体而形成，所述外植体包括经由鳞茎或球根繁殖的植物的营养叶基部。
优选地，该外植体是营养叶基部，且已经将苗端和营养叶从其去除，并且在无植物激素的存在下培养该外植体以形成圆顶状组织。
优选地，营养叶基部是营养叶基至其以下1-3毫米部分的区域。
经由鳞茎或球根繁殖的植物优选是葱属植物。
所述葱属植物优选是蒜。
附图的简要说明
图1是蒜的鳞茎的截面示意图。
实施本发明的最佳方式
(a)可应用的植物
本发明用在形成鳞茎、具有营养叶或球根的植物。这样的植物包括百合、水仙、郁金香等，最优选是葱属植物，尤其是蒜。
(b)外植体的制备
作为外植体，本发明使用营养叶基部。从鳞茎或球根摘取营养叶基部的方法包括，例如，用对植物细胞无直接作用的杀菌剂如次氯酸钠、苯扎氯铵和乙醇等将切成合适大小的鳞茎或球根灭菌，用无菌水适当清洗它们，从其去除贮藏叶以暴露营养叶基部，去除营养叶上部和苗端以后，将剩余的营养叶基部切成合适大小，例如约1-3毫米，将其进行培养(日本未审查的专利公开6-197650)。大蒜鳞茎中的营养叶基部的位置如图1所示。
(c)所用的培养基
作为培养基，任何含有植物生长所必需的成分，包括无机盐、有机盐如维生素、碳源、植物生长调节剂等的培养基均可使用。根据本发明，可以使用Murashige和Skoog培养基、Linsmaier和Skoog培养基等。
(d)培养
将如(b)中描述所制备的外植体植入上述培养基，在适合植物生长的温度(10-30℃，优选20-26℃)培养，光照为50-15000勒克斯，优选为3000-8000勒克斯(每天9-18小时，优选12-16小时)，在5-7天后形成圆顶状组织。当继续培养时，该圆顶状组织生长成植物。在该培养方法中，将圆顶状组织从外植体分离并培养。用刀片或解剖刀将在5-7天的培养后形成的圆顶状组织切下，并将其再次植入(c)中描述的培养基中。通过类似的方式培养，圆顶状组织变绿，并在约一个月后生长成小植株。当继续培养时，小植株生根。
(e)栽培
将在培养(d)中得到的生根的小植株植入含有合适的盆栽肥料(potting compost)的多盆(polypot)中，并生长到产生幼苗。将长好的小植株植入更大的盆或植入苗圃进行栽培。
(f)病毒检测
在主栽培(main cultivation)中得到的植物接受病毒检测以确证该植物无病毒。病毒检测可以通过为每种植物建立的方法进行。对于葱属植物，例如，使用抗病毒抗体的检测方法或通过PCR方法确证病毒基因的存在与否的检测方法(PHYTOPATHOLOGY，第86卷，第3期，第253-259页，1996)。
实施例
该实施例给出了使用葱属植物蒜制备无病毒植物的培养方法。
作为用于培养的材料，使用Fukuchi white种和北海道本地蒜。用一种病毒，韭菜黄条纹病毒(LYSV)或两种病毒，韭菜黄条纹病毒(LYSV)和洋葱黄矮病毒(OYDV)感染所用的Fukuchi white种株，用四种病毒，大蒜病毒(GarVs)、韭菜黄条纹病毒(LYSV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)和大蒜潜伏病毒(GLV)感染北海道本地株。
1.材料的灭菌
将大蒜鳞茎分解成小鳞茎，并去除外皮。然后用苯扎氯铵和水清洗后，将小鳞茎的基部切成1厘米立方块的部分。将该部分在70％乙醇中浸5分钟，然后用无菌水清洗。
2.外植体的制备
材料的灭菌后，去除余下的贮藏叶部分，以暴露营养叶。将营养叶上部切掉，以使营养叶约高0.5厘米。垂直劈开成四部分，将剩余的营养叶削掉，去除苗端。将剩下的基部切成2毫米厚，以制备外植体。
3.培养基
将未添加植物激素的Linsmaier和Skoog培养基(本文以下称为LS培养基)用于培养。
4.培养
将所制备的外植体植入LS培养基，并在每天光照16小时的条件下在25℃进行静置培养。
5.圆顶状组织形成和离体培养
培养开始后一周，直径约为0.5毫米的圆顶状组织在一些外植体上形成。每个鳞片上形成20到30个圆顶状组织。将圆顶状组织用解剖刀切开，并植入未添加激素的LS培养基，然后在25℃和每天光照16小时的条件下静置培养。圆顶状组织变绿，并在2-4周后生长成植物。大约100％的离体圆顶状组织以这种方式生长。将植物植入新的培养基，植物继续培养生根。将生根的植物植入填有土的多盆中栽培。
6.病毒检测
病毒检测所用的样品是通过圆顶状组织的离体培养获得的大蒜叶片。病毒检测通过RT-PCR进行，以部分病毒基因序列作为引物。
从叶片中提取RNA，用cDNA合成试剂盒从该RNA合成cDNA。以该cDNA做模板，使用病毒检测的引物进行PCR。基于感染大蒜的病毒的基因的碱基序列设计引物，从而得到对病毒特异性的扩增产物。为四种病毒中的每种设计特异性引物，四种病毒为大蒜病毒(GarVs)、韭菜黄条纹病毒(LYSV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)和大蒜潜伏病毒(GLV)，并进行PCR反应。PCR反应后，通过琼脂糖凝胶电泳来研究特异性扩增产物的存在，以检测病毒的存在。
作为结果，在Fukuchi white种和北海道本地种中的任何一个中，通过圆顶状组织的离体培养得到的植物没有发现指示病毒存在的扩增产物。指示病毒存在的扩增产物在没有分离大蒜材料和圆顶状组织的连续培养的植物中被确证。因此，确证可以通过营养叶基部的培养形成的圆顶状组织的离体培养获得无病毒大蒜。
用于病毒检测的引物如下：
表1
引物序列及要扩增的区域
病毒检测结果如下所示
| 病毒 引物序列 要扩增的区域 |
| GarVs-A、B C、D N-RT1：5′-CCTGCTAAGCTATATGCTGA-3′ (Seq ID No.：1)3′-末端ORF(常规) N-RT2：5′-GTAAGTTTAGCGATATCAAC-3′ (Seq ID No.：2)3′-非编码区 |
| LYSV 7-RT3：5′-AAGAGTCAACACTTGGTTTG-3′ (Seq ID No.：3)3′-非编码区7-RT4：5′-GGTCTCAATCCTAGCTAGTC-3′ (Seq ID No.：4)3′-非编码区 |
| OYDV OGP1：5′-GAAGCGCACATGCAAATGAAG-3′ (Seq ID No.：5)CP基因大蒜型 OGM1：5′-CGCCACAACTAGTGGTACAC-3′ (Seq ID No.：6)3′-非编码区 |
| GLV/SLV SLP1：5′-TATGCTCGAGCTCGTAGAGC-3′ (Seq ID No.：7)3′-末端ORFHRT2：5′-GGGTTTCACATTGTTACACC-3′ (Seq ID No.：8)3′-末端ORF |
| GCLV GCP1：5′-AATGGGTGTTCTAGGAGTGC-3′ (Seq ID No.：9)3′-末端ORFGCM1：5′-TTAAACCTTAGTCAAGCTATTC-3′ (Seq ID No.：10)3′-非编码区 |
| 蒜氨酸酶 C-AL5′： 5′-TCTGGTAGTCGATTTGGGTGGGCG-3′(Seq ID No.：11)NC3′-1： 5′-GCCGTAGCATTAGGATGTATG-3′ (Seq ID No.：12) |
表2
每种植物的病毒检测结果
| 植物 | 病毒 | |||
| GarVs | LYSV | OYDV | GLV | |
| Fukuchi white种(一种病毒种)(1)亲本(2)没有分离圆顶状组织的再生植物(3)通过分离圆顶状组织的再生植物(共11个植物) | --- | ++- | --- | --- |
| Fukuchi white种(二病毒种)(1)亲本(2)没有分离圆顶状组织的再生植物(3)通过分离圆顶状组织的再生植物(共5个植物) | --- | ++- | ++- | --- |
| 北海道本地种(1)亲本(2)没有分离圆顶状组织的再生植物(3)通过分离圆顶状组织的再生植物(共6个植物) | ++- | ++- | ++- | ++- |
根据本发明的制备无病毒植物的培养方法与苗端培养方法相比，可以得到更大量的无病毒植物。在常规苗端培养方法中，常见的是每个鳞片仅有一个或少数几个苗端，一个苗端只产生一个植物，因此难以得到大量的无病毒植物。相反，培养营养叶基部的方法产生多个植物：在大蒜的情况中，一个鳞片产生20-30个圆顶状组织。因此，易于无病毒植物的大规模繁殖。
序列表<110> 湧永制药株式会社<120> 制备无病毒植物的方法<130> 993730<160> 12<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 1cctgctaagc tatatgctga 20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 2gtaagtttag cgatatcaac 20<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 3aagagtcaac acttggtttg 20<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 4ggtctcaatc ctagctagtc 20<210> 5<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 5gaagcgcaca tgcaaatgaa g 21<210> 6<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 6cgccacaact agtggtacac 20<210> 7<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 7tatgctcgag ctcgtagagc 20<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 8gggtttcaca ttgttacacc 20<210> 9<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 9aatgggtgtt ctaggagtgc 20<210> 10<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 10ttaaacctta gtcaagctat tc 22<210> 11<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 11tctggtagtc gatttgggtg ggcg 24<210> 12<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><221><222><223> 引物<400> 12gccgtagcat taggatgtat g 21
Claims (5)
1.制备无病毒植物的方法，其特征在于分离并培养圆顶状组织，所述圆顶状组织通过培养经由鳞茎或球根繁殖的植物的营养叶基部而形成。
2.根据权利要求1的方法，其中在无植物激素的存在下，培养外植体以形成圆顶状组织，所述外植体包括营养叶基部，且苗端和营养叶已经从营养叶基部除去。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述营养叶基部是从营养叶基到其以下1-3毫米部分的区域。
4.根据权利要求1-3中的任一项权利要求的方法，其中经由鳞茎或球根繁殖的植物是葱属植物。
5.根据权利要求4的方法，其中葱属植物是蒜。
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