CN1334815A - 甲氨蝶呤衍生物 - Google Patents

甲氨蝶呤衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN1334815A
CN1334815A CN99815957A CN99815957A CN1334815A CN 1334815 A CN1334815 A CN 1334815A CN 99815957 A CN99815957 A CN 99815957A CN 99815957 A CN99815957 A CN 99815957A CN 1334815 A CN1334815 A CN 1334815A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mtx
group
compound
halogen
gamma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99815957A
Other languages
English (en)
Inventor
罗伯特·乔治·惠特克
克桑斯·E·韦尔斯
韦恩·杰勒德·赖利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO filed Critical Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Publication of CN1334815A publication Critical patent/CN1334815A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/06—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4
    • C07D475/08—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了分子式Ⅰ的甲氨蝶呤缀合物及其在治疗具有自体免疫成分的疾病和癌症中的用途。分子式(Ⅰ)的化合物的具体实例为甲氨蝶呤－γ－甘氨酸－Tris,分子式(Ⅰ)中M为甲氨蝶呤或其类似物;A=H、CX2－O－R2或卤素;B=H,CX2－O－R3或卤素;X独立地为H或卤素;n为0或者大于或等于1;Y为连接基团,且如果n大于1,各个Y相同或不同;R1、R2和R3相同或不同,且为氢、取代或未取代的甲基、乙基、饱和或不饱和的脂族酰基,附加条件是当n为0或1,A为CH2－O－R2和/或B为CH2－O－R3时,R1、R2和R3不选自脂族酰基;附加条件是当n大于或等于2,A为CH2－O－R2和/或B为CH2－O－R3,且至少R1、R2和R3之一为脂族酰基时,－[Y]n－不为－(AA)n－或－Y－(AA)n－1－,其中AA为氨基酸。

Description

甲氨蝶呤衍生物
技术领域
本发明涉及甲氨蝶呤(MTX)衍生物，含有该衍生物的组合物以及包括应用这些MTX衍生物的治疗方法。
背景
MTX可以结合到二氢叶酸还原酶(DHFR)的活性部位，并通过竞争性抑制阻断在DNA和RNA的生物合成中所需的四氢叶酸(THF)的形成。MTX还抑制其它叶酸依赖性酶。
已应用MTX抑制核酸合成的能力来治疗异常的细胞生长。由于活性增殖细胞对MTX更为敏感，因此它可用于选择性地削弱癌细胞的生长。MTX是用于治疗肿瘤疾病的广泛应用的抗癌药。MTX还用作抗增生剂和免疫调节剂，并且可以用在银屑病和类风湿性关节炎的治疗中。
口服MTX目前用于治疗中度或重度关节炎和顽固性银屑病。每周的剂量为2.5-25毫克。这种药物的应用受限于其毒性，主要的长期副作用是肝损害。在银屑病治疗中，通过局部应用MTX以减少毒性和改进功效的尝试很少或没有成功，原因可能是不良的皮肤穿透和药物在皮肤中的存留时间。
发明的公开
在第一方面，本发明提供
其中M为甲氨蝶呤或其类似物，
A＝H、CX2-O-R2或卤素；
B＝H、CX2-O-R3或卤素；
X独立地为H或卤素；
n为0或者大于或等于1；
Y为连接基团，且如果n大于1，各个Y相同或不同
R1、R2和R3相同或不同，且为氢、取代或未取代的甲基、乙基、饱和或不饱和的脂族酰基；
附加条件是当n为0或1，且A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3时，R1、R2和R3不选自脂族酰基；
附加条件是当n大于或等于2，且A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3，且至少R1、R2和R3之一为脂族酰基时，-[Y]n-不为-(AA)n-或-Y-(AA)n-1-，其中AA为氨基酸。
甲氨蝶呤类似物的实例在现有技术中被描述，参见例如A.L Jackman编著(1999)，“癌症治疗中的抗叶酸药”，Humana Press，Totowa，新泽西；Matsuoka，H和Mihara，M(1998)，“治疗类风湿性关节炎的新的甲氨蝶呤衍生物的合成和生物学评价”，Drugs of the Future 1998.23(9)；1015-1022；和Degraw，J等，(1995)“治疗癌症和关节炎的新的甲氨蝶呤类似物”，Current Medicinal Chemistry 2：630-653，这些文献引入本文作参考。
优选M为甲氨蝶呤。
用于本发明的连接基团的实例包括：
a)具有连接到M上的氨基和连接到NHC(A)(B)CX2OR1基团上的羧基的连接，如氨基酸或抗生素；
b)具有连接到M上的氨基和连接到NHC(A)(B)CX2OR1基团上的磺酸基的连接，如2-氨基乙磺酸(牛磺酸)；
c)具有连接到M上的羟基和连接到NHC(A)(B)CX2OR1基团上的羧基的连接。该连接可以是羟酸。该羟酸可以是氨基酸的类似物，其中该氨基酸的氨基被羟基取代。羟酸的实例包括乙醇酸(HOCH2COOH)、乳酸(HOCH(CH3)COOH)、4-羟基-丁酸HOCH2CH2CH2COOH、6-羟基己酸、10-羟基-癸酸、2-羟基-己酸、2-羟基丁酸、3-羟基-丁酸等。这些酸的应用允许Tris或Tris缀合物通过不稳定的酯键而不是通过更为稳定的酰胺键连接到药物上；
d)具有连接到M上的羟基和连接到NHC(A)(B)CX2OR1基团上的磺酸基的连接，例如2-羟基乙磺酸(羟乙磺酸)；
e)具有连接到M上的羟基和连接到NHC(A)(B)CX2OR1基团上的活性卤素基团的连接，例如2-氯乙醇；
f)具有羟基和醛基的连接，例如对羟基苯甲醛；
g)具有卤素基团和羧基的连接，例如2-氯乙酸；
h)具有两个活性卤素基团的连接，例如1，2-二溴乙烷；和
i)烯化氧，例如环氧乙烷。
该NHC(A)(B)CX2OR1基团可以连接到甲氨蝶呤化合物的α或γ羧基上。最为优选的是，该-NHC(A)(B)CX2OR1基团任选地通过连接基团连接到甲氨蝶呤化合物的γ羧基上。
如果Y为氨基酸，它可以是任何适宜的氨基酸，包括天然和非天然氨基酸及其类似物。优选氨基酸为甘氨酸。
优选R1、R2和R3各自为氢。
优选n在0-5的范围内。
在本发明的优选实施方案中，M为甲氨蝶呤，且-[Y]n-为-[AA]n-，其中AA为氨基酸。优选AA为甘氨酸，且n为1。当n≥2时，各个AA不需是相同的氨基酸。
优选的甲氨蝶呤衍生物为甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-TRIS(MTX-γ-GT)。
在第二方面，本发明提供了含有上述所定义的分子式I的化合物和药学可接受的赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在本发明的组合物的优选形式中，M为甲氨蝶呤，Y为甘氨酸，且n为1。
一种优选的甲氨蝶呤衍生物为甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-TRIS。
适于口服的组合物包括液体溶液剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂等。
本发明的组合物可以是包括常规片剂成分的片剂形式。
适于非胃肠给予的组合物包括含水或非水注射溶液剂或乳剂。
适于局部给予的配方可以是包括本发明组合物的乳膏剂、凝胶、糊剂、油膏剂、泥敷剂、鼻用喷雾剂、肺气雾剂或泡沫的形式。
本发明的组合物可以是栓剂、阴道栓、塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、洗剂、植入物、药贴或泡沫的形式。
本发明的组合物可以是植入物的形式。
本发明的组合物可以是肺部给予的液体气溶胶或粉末。
该药物组合物中本发明的MTX衍生物的剂量水平可以在选定的时间范围内足以引起预防或治疗反应。
本发明还提供了治疗患者中的癌症或具有自体免疫成分的疾病的方法，该方法包括给予预防或治疗有效量的上述分子式I的化合物。
因此，在第三方面本发明提供了一种治疗患者中的具有自体免疫成分的疾病或癌症的方法，该方法包括给予患者有效量的式II的化合物。
Figure A9981595700081
其中：
D＝H或CX2-O-R4或卤素；
E＝H或CX2-O-R5或卤素；
X如以上所定义；
n如以上所定义；
Y如以上所定义；且
R4、R5和R6相同或不同且为氢、取代或未取代的甲基、乙基或具有饱和或不饱键和的脂族酰基。
具有自体免疫成分的疾病可以是任何需要免疫抑制的症状。例如具有自体免疫成分的疾病可以是银屑病或类风湿性关节炎。
该具有自体免疫成分的疾病可以是患者中的炎症性肠病或局限性回肠炎。
在第三方面的方法中所用的化合物优选为分子式I的化合物。
可以通过任何适宜的途径实现本发明的治疗方法，例如口服、非胃肠、植入物和局部途径。
本发明的MTX衍生物的剂量水平取决于所治疗的症状的性质和严重性，但一般其给药量足以产生预防或治疗效果。本发明的药物组合物可以含有占该组合物约0.001％至约90％范围的MTX衍生物。口服形式的组合物，如片剂，可以含多达85％的MTX衍生物，优选约为口服组合物的2-60％。这里所述的浓度仅用于说明而不是用于限定。
为了使本发明更容易被理解，提供了以下的非限制性实施方案。
附图的简要说明图1为说明口服MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3在迟发型超敏
性脚板(footpad)水肿大鼠测试中的效果的框图。MTX-γ-GT和
MTX-γ-GTP1在该测试中与MTX一样具有活性。MTX-γ-GTP1在统计
学上比MTX更为有效(p＝0.021)。图2显示MTX和MTX-γ-GT在大鼠佐剂诱发的关节炎模型中的效果。该
结果表明两种较低剂量的MTX-γ-GT在延迟这种模型的关节炎的发作
方面与MTX等效。图3显示MTX-γ-GTP3对UVB照射之后表皮DNA合成的抑制效果。在
UVB照射之后，小鼠反应为最初的DNA合成抑制，接着在48小时之
后，DNA合成显著增加。MTX-γ-GTP3至少在抑制该合成脉冲方面与
MTX活性相同。图4显示MTX和MTX-Tris缀合物对UVB照射之后的表皮细胞有丝分裂
活性的抑制效果。图5显示来自SPA原理证据试验(proof-of-principle trial)的丝聚合蛋白
(filaggrin)表达。该图显示在局部MTX-γ-GTP3或MTX治疗后，相
对于用倍他米松的反应的总丝聚合蛋白表达。在右上区象限的患者对
倍他米松和0.5％的MTX-γ-GTP3均发生阳性反应(用*表示，患者1、
2、5、6和8)。患者5、9和10对倍他米松有反应，但对1.0％的
MTX-γ-GTP3不反应。MTX(圆圈)和1.0％的MTX-γ-GTP3(方块)
还以相同方式显示阳性患者。对倍他米松和MTX-γ-GTP3反应的联系
表明在该试验中存在两个主要组：反应者和不反应者。图6的框图显示口服MTX-γ-GTP3或MTX治疗与倍他米松治疗相比，SPA
患者的粒层中的丝聚合蛋白表达的累积结果。阳性对照倍他米松与其
赋形剂相比具有统计意义上的显著性效果。0.5％的MTX-γ-GTP3与其
赋形剂相比的边界显著性为0.08。图7显示用1.0％、0.5％的MTX-γ-GTP3溶液，0.5％的MTX和0.05％的倍
他米松戊酸酯霜剂治疗的患者的颗粒性：角化不全的比率。1.0％的
MTX-γ-GTP3显示具有斑块消散的早期标志的阳性结果。
实施本发明的方式缩写：AICAR          氨基咪唑甲酰胺核苷酸APA         4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酸DAHMP       2，4-二氨基-6-羟基甲基蝶啶DCC         1，3-二环己基碳二亚胺DCM         氯甲烷DECP        氰基膦酸二乙酯DMA         N，N-二甲基乙酰胺DMAP        4-二甲氨基吡啶DMF         N，N-二甲基甲酰胺Et2O       二乙醚EtN1Pr2   二异丙基乙基胺EtOAc       乙酸乙酯GT          甘氨酸-TrisGTP1        甘氨酸-Tris一棕榈酸酯GTP2        甘氨酸-Tris棕榈酸酯GTP3        甘氨酸-Tris三棕榈酸酯HOAc        乙酸HOSu        N-羟基琥珀酰亚胺MABA        N-甲基氨基苯甲酸MTX         甲氨蝶呤MTX-Y-GT    甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-TrisMTX-y-GTP1  甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris一棕榈酸酯MTX-y-GTP2  甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris二棕榈酸酯MTX-y-GTP3  甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris三棕榈酸酯OMe         甲酯P2O5      五氧化二磷PmCl        棕榈酰氯Pph3     三苯膦RM        反应混合物RT        室温tBu       叔丁酯tBuOAc    乙酸叔丁酯TFA       三氟乙酸TPPO      氧化三苯膦Z-GT      苄氧基碳酰甘氨酸-TrisZ-GTP1    苄氧基碳酰甘氨酸-Tris一棕榈酸酯Z-GTP2    苄氧基碳酰甘氨酸-Tris二棕榈酸酯Z-GTP3    苄氧基碳酰甘氨酸-Tris三棕榈酸酯甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris(MTX-γ-GT)的制备甘氨酸-Tris(GT)
Figure A9981595700121
C6H14N2O4
分子量178.19
将N-(苄氧基碳酰)-甘氨酸-Tris(Z-GT；美国专利5952499)(1.70克，5.44毫摩尔)溶于乙醇(60毫升)中，同时加热和搅拌。通过浸于冷水浴中将其冷却至室温后，加入碳载钯(10％，0.14克)，将该系统真空化并用氢气填充三次。将该混合物在氢气氛中于室温下剧烈搅拌19小时，然后通过两层玻璃纤维(GF/A)滤纸过滤(用新鲜的乙醇(大约10毫升)冲洗)。将滤液蒸发，留下白色固体GT(0.97克，100％)，1H n.m.r.(d6-DMSO)δ2.1，brs，NH2；3，1，s，NCH2CO；3.55，s，3xCH2O；5.0，brs，3xOH；7.95，br s，NH。MTX-α-tBu-γ-GT
Figure A9981595700131
                     MTX-α-tBu-γ-GT
                       C30H42N10O8
                     分子量：670.72
将甲氨蝶呤-α-叔丁酯(MTX-α-tBu；美国专利5952499)(0.438克，0.86毫摩尔)在搅拌下溶解于DMF(4毫升)中。加入HOSu(0.12克，1.03毫摩尔)并搅拌直至发生溶解。加入DCC(0.27克，1.29毫摩尔)并将所得的混合物在室温下于氮气下搅拌16小时。加入更多的DCC(100毫克)并将该混合物进一步搅拌一小时。加入在DMF(1.5毫升)中的GT(0.23克，1.29毫摩尔)并将所得的混合物搅拌54小时。通过玻璃棉过滤该混合物并将滤液蒸发。在硅胶上迅速色谱分离残留物。用在DCM中的15％甲醇洗脱得到黄色固体的标题化合物(0.33克，57％)1H n.m.r.(d6-DMSO)δ81.39，s，C(CH3)3；1.96，m，glu-β-CH2；2.24，m，glu-γ-CH2；3.21，s，Nme；3.52，d，J6 Hz，3xCH2OH；3.70，d，J6 Hz，gly NCH2CO；4.22，m，glu-α-H；4.69，t，J6Hz，3xOH；4.79，s，ArCH2n6.62，brs，NH2；6.82，7.72AA′BB′，J9Hz，ArH；7.14，s，tris NH；7.46，br s，NH2；8.10，t，J6Hz，gly NH；8.27，d，J7Hz，glu NH；8.56，s，H-7，质谱[电喷雾离子化，阳离子模式(ES(+))]m/z671(M＋1)MTX-γ-GT
Figure A9981595700141
                MTX-γ-GT
               C26H34N10O8
              分子量：614.62
将MTX-α-t-Bu-γ-GT(0.459克，0.68毫摩尔)搅拌下溶解于TFA(3毫升)中。将该溶液于室温下搅拌1.5小时并在真空下蒸发溶剂。将残留物溶于水中并用碳酸氢钠水溶液(1克溶于75毫升中)将溶液的pH(约2)调节到6。加入含水HOAc(10％)至pH4。将溶液冻干并用闪蒸色谱法然后用径向色谱法(两次)在硅胶上纯化残留物。用在3∶5的甲醇∶氯仿中的1-3％的水洗脱得到黄色固体的标题化合物(0.086克，21％)。1H n.m.r.(d6-DMSO)δ1.96，m，glu-β-CH2；2.14，m，glu-γ-CH2；3.19，s，Nme；3.5-3.7，m，3xCH2OH＋3xCH2OH；3.95，m，gly NCH2CO；4.41，m，glu-α-H；4.76，s，ArCH2N；5.37，brs，NH2；6.61，brs，NH2；6.84，7.62 AA′BB′，J9Hz，ArH；7.60，m，glu NH；7.71，s，tris NH；8.23，t，J6Hz，gly NH；8.57，s，H-7，ES(+)质谱m/z615(M＋1)，637(M＋Na)，659(M＋2Na)。甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris一、二和三棕榈酸酯(MTX-γ-GTP1、MTX-γ-GTP2、MTX-γ-GTP3)的制备
可以如在美国专利5952499所述的或通过以下过程制备标题化合物。2，4-二氨基-6-羟基甲基蝶啶(DAHMP)的合成
Figure A9981595700151
参考文献：Rosowsky等，J.Med.Chem.，1985，第28卷，第5期，660-667。反应剂：DAHMP盐酸盐(69.04克，0.30摩尔)HOAc(120毫升)H2O(1200毫升)过程：
将DAHMP.HCI溶于(同时加热到80℃)含水乙酸中。通过玻璃棉过滤该溶液并冷却至45℃。用浓氢氧化胺溶液将pH调节至5.3-5.6(用pH试纸监控)。将RM冷却至RT并过滤。将收集到的黄色/糖色固体用水洗涤两次，然后在真空烘箱内在P2O5上于80℃下干燥过夜×2，得到期望的金黄/褐色固体的DAHMP(游离碱)(52.90克，92％)。4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]-苯甲酸，或4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶啶酸(APA)
Figure A9981595700152
参考文献：Kralovec等，J.Med.Chem.，1989，第32卷，第11期，2426-
      2431。Rosowsky等，J.Med.Chem.，1985，第28卷，第5期，
      660-667。反应剂：DAHMP(15.00克，78毫摩尔)Br2(3当量，12.1毫升，37.53克，0.23摩尔)PPh3(3当量，61.44克，0.23摩尔)DMA(187毫升)MABA(13.57克，89毫摩尔)EtNiPr2(3当量，40.6毫升，30.1克，0.23摩尔)过程：
在氮气下，通过注射器缓慢地将Br2加到冰冷的于DMA中的搅拌着的混合物PPh3中。加入固体DAHMP(在RM下的氮“粉”)并在RT下将RM搅拌24小时。通过注射器加入胺，然后加入固体MABA(氮“粉”)。在RT下将RM搅拌67.5小时。将RM倾入氢氧化钠水溶液(0.33M，125毫升)中，滤出所得的沉淀并用含水乙酸(10％v/v)将滤液调节到pH5.5。收集沉淀，依次用水、冷乙醇和乙醚洗涤，并在40℃在真空烘箱中干燥4天得到黄色固体(25.79克)。为除去TPPO和MABA杂质，将粗产物在3∶2的甲醇∶乙醇(50毫升)中于RT下搅拌50小时，过滤，用Et2O(x2)洗涤，风干并蒸发得到黄色固体APA(24.48克，87％)。L-谷氨酸-α-tBu-γ-Me酯参考文献：Rosowsky等，J.Med.Chem.，1981，第24卷，第12期，1450-1455。反应剂：L-谷氨酸5-Me酯(17.54克，0.108摩尔)tBuOAc(200毫升)70％HClO4(10.9毫升，0.12毫摩尔)过程：
将HClO4缓慢地加到在tBuOAc中的底物的混悬液/部分溶液中(在加入酸期间，底物开始溶解)。在松散塞着的烧瓶中在RT下搅拌RM 40小时。用0.5N盐酸(2×200毫升，1×150毫升)萃取RM。在冰/盐/干冰浴(＞-5℃)中冷却水层，用固体碳酸氢钠中和(直到pH约为8且再没有碳酸氢钠溶解)，同时将溶液的温度保持在约-4℃。用乙醚萃取该混合物(RT，4x200毫升)，用盐水(100毫升)洗涤合并的有机层，干燥(硫酸镁)并蒸发(旋转蒸发仪，然后油泵，不加热)，得到几乎无色的在-20℃储存时部分固化的粘稠的油状物的产物(10.77克，45％)。
Figure A9981595700171
参考文献：(1)Rosowsky等，J.Med.Chem.，1981，第24卷，第12期，
   1450-1455。
(2)Kralovec等，J.Med.Chem.，1989，第32卷，第11期，
   2426-2431。反应剂：APA(8.56克，23.7毫摩尔)Et N1Pr2(9.0毫升，51.7毫摩尔)DMF(460毫升)DECP(7.20克，44.1毫摩尔)L-谷氨酸-a-tBu-γ-Me酯(7.26克，33.4毫摩尔)EtNiPr2(8.5毫升，48.8毫摩尔)过程：
10分钟内向在DMF(400毫升)中的DECP和EtN1Pr2(第一部分)中分批加入APA(颗粒状)。将该溶液浸入油浴(预热至80℃)中2分钟(内部温度达34℃)。从该浴中移出烧瓶并搅拌30分钟(内部温度22℃)。加入第二部分EtN1Pr2，然后加入在DMF(50＋10毫升洗剂(rinse))中的谷氨酸酯。室温下在氮气下搅拌RM14小时(过夜)。加入在水(60毫升)中的碳酸氢钠(1.80克，21毫摩尔)溶液，搅拌该混合物30分钟，然后蒸发(旋转/油泵，45℃)。将残留物溶于氯仿(大约400毫升)中并用水(300毫升)和5％碳酸氢钠水溶液(200毫升)洗涤溶液。用盐水(30毫升)洗涤有机层，干燥(硫酸镁)并蒸发。通过小的二氧化硅柱采用5％的在DCM中的甲醇过滤该残留物(棕色，粘稠的胶)以除去极性杂质，在硅胶上进行闪蒸色谱分离所得的产物，用在DCM中7-12％的甲醇洗脱得到亮黄色固体的三部分产物：1(痕量杂质)(2.17克，18％)；2(高纯度)(4.40克，36％)；和3(痕量杂质)(2.77克，22％)。MTX-α-tBu酯(它是与美国专利5952499—化合物IV相同的中间体)参考文献：Rosowsky等，J.Med.Chem.，1981，第24卷，第12期，1450-1455。反应剂：MTX-α-tBu-γ-Me二酯(5.00克，9.5毫摩尔)Ba(OH)2.8H2O(1.82克，5.8毫摩尔)乙醇(95毫升)水(110毫升)水(10毫升)中的Na2SO4·10H2O(1.93克，6.0毫摩尔)过程：
将前三种反应剂混合并在RT下于松散地塞着的烧瓶中搅拌19小时。加入在水中的硫酸钠并将该混合物搅拌几分钟(似乎立即形成BaSO4沉淀物)，然后通过在3或4号烧结玻璃上的2xGF/A滤纸过滤。用10％的在水中的HOAc调节滤液至pH5。将所得的混悬液(胶状沉淀物)冷冻30m，然后采用在烧结玻璃上的1号滤纸过滤收集固体。将收集的固体风干过夜(仍置于漏斗中的滤纸上)，然后抽干(油泵)得到亮橙/黄色固体的期望产物(4.41克，91％)。Z-GTP3(+Z-GTP2+Z-GTP1)
Figure A9981595700201
反应剂：Z-GT(50.00克，0.16摩尔)PmCl(108毫升，97.85克，0.356摩尔)Et3N(100毫升72.4克，0.72摩尔)DMF(450毫升)DCM(1.60＋0.20L)过程：
在5升的三颈圆底烧瓶内将Z-GT溶于DMF中。加入DCM(1.6L)并用冰-盐浴冷却搅拌着的溶液1小时。在2小时内逐滴加入在DCM(100毫升)中的PmCl溶液并将该浴温度保持在-13℃至-10℃。用DCM(100毫升)冲洗滴液漏斗。在相同温度下进一步搅拌RM2小时，然后在4℃下搅拌度过周末。真空除去溶剂(在除DCM之后将在蒸发过程中出现的沉淀过滤以有效地除去DMF)。用EtOAc(400毫升)，然后用DCM(800毫升)萃取残留物(EtOAC萃取的结果是在用盐水或水洗涤萃取液时产生沉淀)。用盐水洗涤合并的有机萃取液并干燥(硫酸镁)。真空下除去溶剂得到黄色蜡状的粗产物(133.48克)。HPLC分析表明是比例分别为8.8％、47.4％和23.8％的Z-GTP3、Z-GTP2和Z-GTP1的混合物。MTX-α-tBu-γ-GTP3反应剂：MTX-α-tBu酯(11.00克，21.5毫摩尔)DCC(1.2当量，5.50克，26.7毫摩尔)GTP3(1.1当量，21.32克，23.9毫摩尔)DMAP(0.1当量，258m克，2.1毫摩尔)DMF(86毫升)DCM(340毫升)过程：
将MTX-α-tBu酯在搅拌下溶于DMF中。加入DCM(200毫升)。加入DCC并将溶液搅拌20分钟。10分钟内逐滴加入在DCM(70毫升)中的GTP3。加入DMAP并于RT下在氮气下搅拌RM过夜(24小时)。将该RM过滤以从DCC中除去白色固体尿素副产物，浓缩(旋转/油泵，50℃)除去DMF。将残留物溶于DCM中，再过滤并蒸发。将残留物溶于EtOAc/DCM(150/20毫升)中，用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并蒸发。将残留物分成两等份，各部分在硅胶上进行闪烁色谱分离，用在DCM中的5％的甲醇洗脱第一部分，用在DCM中的3.7-4.4％的甲醇洗脱第二部分。再次色谱分离不纯的部分得到两部分的产物(亮黄色固体)，(1)(纯度＞95％)(17.18克，58％)和(2)(纯度90-95％)(4.83克，16％)。MTX-γ-GTP3
Figure A9981595700221
反应剂：MTX-α-tBu-γ-GTP3(0.86克，0.62毫摩尔)TFA(1.7毫升，22毫摩尔)DCM(5毫升)过程：
将TFA逐滴加入冰冷的，处于DCM中的底物的搅拌着的溶液中。将RM暖至RT，然后在氮气下搅拌5.5小时。将RM在4℃下放置过夜然后用DCM(25毫升)稀释并用碳酸氢钠水溶液(5％w/v，35毫升)(检查pH＞7)洗涤。加入HOAC(冰醋酸，1.8毫升)并振摇混合物(检查pH～4)。用水洗涤有机层(2×25毫升)(加入少量氯化钠和甲醇和新鲜溶剂涡旋并升温而破坏乳剂)，干燥(硫酸镁)并蒸发。将残留物在硅胶上闪蒸色谱分离，用于DCM中的8-30％的甲醇进行逐级梯度洗脱(3X4％；2X5％逐级)得到三部分产物：(1)(痕量高Rf副产物，187毫克)，(2)(高纯度，476毫克)和(3)(痕量低Rf副产物，79毫克)。所有部分均为黄色固体且具有非常高的纯度。部分(2)纯度-＞97.25％(通过HPLC测定)。收率＝742毫克，90％。
可以分别由Z-GTP1和Z-GTP2以类似的方式制备MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP2。体外DHFR抑制
二氢叶酸还原酶(DHFR)为MTX的靶酶。它催化以下反应：
可以根据NADPH氧化的速率在340纳米处在体外测得其活性。方法：
如ImbertAM，PignonT，LenaN(1983)“用离心分析仪(Cobas-Bio)进行的甲氨蝶呤的酶分析”Clin Chem，29(6)：1317-1318所述测得MTX、MTX-γ-GT和MTX-Y-GTP1的DHFR的抑制。结果：
MTX-γ-GT在与MTX相同的浓度下抑制DHFR(表1)。表1.MTX和MTX-γ-GT在2.86纳摩尔/升下对DHFR的抑制活性
化合物 ％抑制
MTXMTX-γ-GT 45.536.4
还测试了MTX-γ-GPT的抑制活性。导致50％的DHFR抑制所需的浓度为76纳摩尔/升。这比在4.8纳摩尔/升下导致50％的DHFR抑制的MTX的活性小16倍。
在这些条件下MTX-α-GTP1不抑制DHFR。
没有测试MTX-γ-GTP2和MTX-γ-GTP3，因为它们的溶解特征与该分析系统不相容。采用大鼠的延迟型超敏(DTH)反应研究MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3
延迟型超敏(DTH)是一种可以被用于评价各种治疗剂作用的免疫反应。它可以通过以下被表现：使个体对化合物致敏，然后用同一种化合物激发免疫反应，观察激发部位的水肿的发展，MTX具有减少水肿的免疫抑制作用，已采用DTH反应中的该减少来评价MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3的效力。方法：
剃去哥本哈根(COP)大鼠腹部的毛，应用3天100微升0.5％的于丙酮中的二硝基氟苯(DNFB)。同时，每天口服给予大鼠豆油、MTX(0.5毫克)或等量的MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1或MTX-γ-GTP3，给予5天。在第7天，用甲氧氟烷麻醉大鼠并在往左脚板加入25微升0.2％的于丙酮中的DNFB之前立即测定脚板的体积。在23小时在麻醉状态下测定脚板体积。采用实验室制造的器官体积测量器用体积描记法(通过观察浸没后体积变化而测量目标的体积)测定脚板的体积。从23小时的脚板体积减去0小时脚板体积而算得净余水肿。药物：豆油中的MTX(1毫克/毫升)豆油中的MTX-γ-GT-(1.4毫克/毫升)-(批号QY5-64MXS)豆油中的MTX-γ-GTP1-(1.88毫克/毫升)-(批号GB4-99 NB00077-p50)豆油中的MTX-γ-GTP3-(3毫克/毫升)-(批号QY 4-41 FP)对照-豆油结果：
图1显示了净余脚板水肿数据。
与对照组大鼠相比，用MTX、MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GT治疗的大鼠的平均净余脚板水肿明显较小，而MTX-γ-GTP3则不然(表2)。MTX-γ-GTP1治疗的大鼠的净余脚板水肿也显著性地小于MTX治疗的大鼠的净余脚板水肿(p＝0.021)。
表2：均值、SD和p值数据
 治疗     n 平均水肿(毫升)     SD 与对照组相比的p值
 对照MTXMTX-γ-GTP3MTX-γ-GTMTX-γ-GTP1     388221811     0.3630.2160.3270.1920.055     0.2540.1500.3250.2370.050     -0.044*0.590.0195*＜0.0001*
*统计意义上显著的讨论：
DTH是表现为在抗原激发免疫反应之后的炎症反应的体内T细胞依赖性免疫反应。因此这些结果表明MTX-γ-GT和MTX-γ-GTP1的免疫抑制作用至少等同于MTX或可能比MTX更为有效。体外细胞毒性
评价了MTX及其Tris-缀合物的抑制培养细胞增殖的能力。方法：
采用常规的细胞培养过程研究MTX和MTX-Tris缀合物对细胞增殖的作用。测定了以下细胞系：
JURKAT(人急性T-细胞白血病)
瑞士小鼠成纤维(3T3)细胞
CCRF-CEM(CEM)人体T细胞白血病
在药物的存在下培养JURKAT细胞64小时，在化合物的存在下将3T3和CEM细胞分别培养48小时和96小时。所有的研究在96-孔板和不含药物的对照孔中进行。然后采用MTX或MTT检测测定细胞增殖(D Marks，L Belov，MW Davey，RA Davey，A kidman.Leukemia Research 16，1165-1173.“用于在多药耐药性的人白血病细胞中细胞毒性测试的MTT细胞存活能力分析”。结果：
所有缀合物均抑制增殖但与母体化合物MTX相比对所有受试的细胞类型的毒性均较小。结果总结于表3中。表3 MTX和MTX-Tris缀合物对各种细胞类型增殖的作用。IC50＝与对照组生长相比细胞生长被抑制50％时的化合物浓度
化合物     IC50微摩尔/升
    3T3     JURKAT     CEM
MTX     0.0525     8.2     0.019
MTX-α-GT     -     -     35.9(1889)
MTX-γ-GT     无作用*     -     0.57(30)
MTX-γ-GTP1     -     -     0.21(11)
MTX-α-GTP2     -    10300(1256)     -
MTX-γ-GTP2  0.41(7.8)    1200(146)     0.40(21)
-未测试；*直到250纳摩尔/升未观察到作用；(n)缀合物：MTX比
活性降低可能是由于MTX在α-或γ-COOH上的修饰。在体内，MTX在γ-COOH上被多谷氨酰化(polyglutamylate)((glu)n的加上)，这是MTX毒性的重要方面。它增加了细胞内存留，因而导致通过DHFR的四氢叶酸合成的阻断。MTX-γ-(glu)n还具有对在DNA和RNA合成中所涉及的其它酶包括胸苷酸合酶和AICAR甲酰转移酶的更大的抑制作用。聚谷氨酸酯(polyglutamate)的形成和蓄积可能具有不希望的体内作用，当它们在某些器官(肾和肝)大量形成时，在那里它们可能会因为延长细胞内存留而有不希望的毒性。
我们的某些缀合物(即MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3)在γ-COOH上进行了修饰，而不太可能被多谷氨酰化，这样就解释了它们的降低的毒性。
γ-COOH在细胞吸收还被涉及，修饰可以降低吸收。在我们的研究中，各种MTX-γ-缀合物在其对细胞生长的作用方面表现出差异。MTX-γ-GT的抑制作用较MTX-γ-GTP1或MTX-γ-GTP2小。可以假设在加入GT时阻碍了通过叶酸转运系统的药物吸收(以及作为结果的毒性)，这种作用可以部分地通过棕榈酸酯基团的加入而过度进行(over ridden)。可能棕榈酸酯缀合物通过胞吞作用进入细胞。尽管MTX-γ-GT与棕榈酸酯化的缀合物相比对细胞的毒性更小，它对生物化学分析中的DHFR的抑制作用更大(见上述)。这表明MTX-γ-GT和MTX-γ-GTP1或MTX-γ-GTP2的差别是因为转运机理而不是直接酶抑制。
广泛报道α-COOH修饰比γ-COOH修饰在更大程度上减少了细胞吸收。我们的结果与此一致。MTX-α-GT和MTX-GTP2的毒性分别比MTX-γ-GT和MTX-γ-GTP2小得多。
所有我们的结果均与文献报道一致。一些相关的参考文献如下：
Rosowsky等；J.Med.Chem.(1984)27，600-604
Rosowsky等，J.Med.Chem.(1984)27，605-609
Rosowsky等，J.Med.Chem.(1981)24，1450-1455
Fan等，(1991)Biochem.30，4573-4580.在大鼠佐剂诱发的关节炎模型中测试MTX和MTX-γ-GT
Baggott和同事(Arthritis Rheum 1998，41：1407-10)已证明40、15和5微摩尔/千克剂量的MTX提供对佐剂诱发的lewis大鼠关节炎的剂量依赖性抑制作用。
已应用采用Dark Agouti(DA)大鼠的类似的模型测试MTX-γ-GT的效果。方法：
将弗氏完全佐剂皮下注射进DA大鼠的尾基部。10-12天后未治疗的大鼠患上了关节炎。在第6天给大鼠口服(通过管饲法)PBS(对照)或等摩尔的在PBS中的MTX或MTX-γ-GT一次进行治疗；每个治疗组6只大鼠。每天通过评价体重和关节炎的症状来监测对关节炎的治疗效果，采用制定的打分系统进行定量。这涉及给每只爪子从0-4的分数(0＝无关节炎或炎症症状，4＝爪全部肿胀)。理论上最大的分数为16，但是如果观察到分数大于12则处死大鼠。在发生轻微关节炎的治疗的大鼠中，治疗期以外跟踪该疾病以确定是否是延迟而不是抑制或预防了关节炎。结果：
图1：A-F显示了在第6天单一剂量的MTX和MTX-γ-GT的结果。结论：
MTX和MTX-γ-GT将炎症的发生有效地延迟了2-4天。在测试剂量下和实验误差的范围内两种化合物的作用不能区分。根据DTH大鼠脚板结果可以预期MTX-γ-GTP1还可延迟这种模型中炎症的发作。在银屑病的治疗中，MTX-γ-GTP3在DTH分析中为阴性，但在人SPA试验中表现出活性(参见以下)。仍要测定它对大鼠佐剂诱发的关节炎的作用。MTX-Tris缀合物的毒性
虽然没有进行专门检查毒性的试验，但在检查生物学活性的试验期间已进行的观察表明MTX-TRIS缀合物较MTX具有降低的全身毒性。记录了以下的观察：1.已进行了在连续三天内每天局部应用赋形剂、MTX、MTX-γ-GTP2或MTX-γ-GTP3对UVR诱发的雌性Skh-1小鼠红斑的作用的试验。在该研究期间，持续6天评价小鼠的中毒症状(脱水、腹泻和厌食)，然后在尸体剖检时评价GIT毒性的总体症状(增大的充满液体的肠)。MTX-γ-GTP2和MTX-γ-GTP3似乎比MTX的毒性更小，在下表中显示了结果。
给Skh-1裸鼠局部应用的毒性结果
治疗 总GIT毒性症状     死亡
赋形剂MTXMTX-γ-GTP2MTX-γ-GTP3 4毫克/千克19.6毫克/千克111.7毫克/千克1     0/245/240/240/14     0/248/240/240/14
1采用等摩尔量的MTX、MTX-γ-GTP2和MTX-γ-GTP3。将它们在水包油型乳膏∶油酸乙酯(4∶1)中配方并且每只小鼠应用0.1毫升。GIT＝胃肠道。
在许多用MTX治疗的小鼠中，毒性和尸体剖检时的临床症状、增大的充满液体的肠是普遍的。这些肠的组织学检查显示显著的微绒毛损伤和坏死的粘膜细胞。作为比较，在接受MTX-γ-GTP2或MTX-γ-GTP3的小鼠上既没有观察到GIT损伤也没有观察到死亡。在所有小鼠中，肝和肾表现正常。2.在延迟型超敏测试研究中，每天口服给予哥本哈根大鼠豆油、MTX(0.5毫克)或等摩尔量的MTX-γ-GT、MTX-γ-GTP1或MTX-γ-GTP3，为期5天，同时局部应用DNFB进行致敏。在用DNFB激发免疫反应和尸体剖检24小时后，检查代表性组的大鼠的肠的总变化并收集组织学用的样品。
所有MTX治疗的大鼠(n＝7)均具有增大的充满乳状液体的胃和肠。这些GIT样品的组织学揭示了具有增厚、炎性核心的绒毛，上皮的分离和腐肉分离和粘膜坏死。这表明中度至重度的损伤。接受MTX-γ-GT(n＝9)的大鼠具有正常的GIT，除了一只动物具有增大的充满液体的肠。目测检查MTX-γ-GTP1(n＝14)和MTX-γ-GTP3(n＝14)治疗组的GIT表明无总体上的异常。接受MTX-Tris缀合物的大鼠表现出在GIT中减少的病理组织学。3.在检查MTX和MTX-γ-GT对大鼠佐剂诱发的关节炎的研究中，记录了以下的观察：a)在单一口服剂量的MTX或MTX-γ-GT(40微摩尔/千克)之后，1-2天后在MTX组中观察到了腹泻。这在MTX-γ-GT和只有赋形剂的组中不明显。b)在第二个试验中，分3天给予大鼠3个口服剂量。用MTX(5微摩尔/千克)治疗的大鼠中的毒副作用(毛皮起皱和共济失调)明显。所以这些动物比最初计划的要早处死。死后检查表明在GIT中的显著变化，尤其是看起来气胀和收缩的小肠。组织学表明在空肠和回肠上的粘膜中的腺管增生和绒毛状结构损失。在一些区域，腺管和绒毛状上皮细胞均有损失。这些大鼠的肠系膜淋巴结也增大。在赋形剂和MTX-γ-GT治疗组中没有观察到这些作用。此外，MTX治疗大鼠的外周血液样品显示显著的白细胞减少症(大约2×109/升)，主要由于中性粒细胞减少。在赋形剂对照组和MTX-γ-GT组中的白细胞数量没有不同(大约3×109/L)。结论：
所有MTX-Tris缀合物与MTX相比具有降低的毒性。采用细胞毒性试验观察到了类似的结果(参见上文)。MTX-Tris缀合物在小鼠中的分布介绍
MTX是一种对具有自体免疫成分的疾病如银屑病和类风湿性关节炎有效的口服治疗。但是由于肝萎缩、坏死和硬化的风险，其长期使用要求不断进行肝评价。MTX还导致胃肠刺激、肾脏毒性和流产。我们己证明MTX-Tris缀合物具有生物学活性但体内和体外的毒性较小(参见上述)。此外，采用液体闪烁和全身放射自显影法检查局部、口服(p/o)和静脉内(i/v)给予小鼠的放射标记的MTX-Tris缀合物和MTX的分布。这用以确定MTX-Tris缀合物(或它们的降解产物)是否蓄积在MTX毒性所涉及的器官以及是否它们的排泄方式不同于MTX的排泄方式。以下总结了相关的结果。结果：l.i/v和口服给予[14C]-MTX-γ-GT的小鼠与给予[14C]-MTX的动物相比，表现在粪便中排泄出更高水平的放射活性，但在尿液中具有相似的量。[14C]的组织分布相似，但给予[14C]-MTX-γ-GT的小鼠的水平较低。这些发现表明MTX-γ-GT比MTX具有更高的肝清除。2.在局部应用之后，在皮肤表皮中检测到比MTX治疗的小鼠更长时间的MTX-γ-GTP3放射标记。这表明皮肤中存留的MTX-γ-GTP3的程度比MTX更高。此外，放射活性出现于口服给予[14C]-MTX-γ-GTP1和[3H]-MTX-γ-GTP3的小鼠的皮肤中。这些发现在考虑作为抗银屑病治疗的可能用途时可能具有重要意义。3.在口服给予之后，放射性标记的MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3的量表现出在MTX毒性所涉及的器官中显著降低的水平。这表明减少了吸收或增加了肝排泄(即肠肝循环)。但是，一旦这些缀合物进入循环(即在i/v给药之后)，它们似乎在肝脏、脾和肺蓄积。这提供了在通过Tris与脂族酰基结合以后将药物靶向于特定器官的可能。4.[14C]-MTX的放射性标记主要在尿中排泄而在粪便中较少。作为比较，当[14C]-MTX-γ-GTP1和[14C]-MTX-γ-GTP3以i/v转运时，放射性标记主要通过肝脏排泄在粪便中消除，而在尿中检测到的水平很低。讨论：
MTX-Tris缀合物在口服时比MTX在MTX毒性所涉及的器官中蓄积程度更低，因为它们或者具有更高的肝清除(MTX-γ-GT)或在受试配方中具有更低水平的吸收(MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3)。分布方式可能部分地解释用缀合物观察到的降低的毒副作用(参见上述的毒性部分)。还可能有贡献的是降低的细胞吸收和多谷氨酰化(参见上述的细胞毒性部分)。虽然MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3在i/v给药时可能会在肝、肺和脾中蓄积，但我们并没有评价毒副作用。但是，这些缀合物不可能被多谷氨酰化，而这种多谷氨酰化是广泛地导致MTX毒性的机理。在口服转运之后在皮肤中观察到了MTX-γ-GTP1和MTX-γ-GTP3。这可能已表明其用作一种银屑病治疗剂的可能。MTX-γ-GTP3作为银屑病的局部治疗的临床试验
银屑病是一种影响1-2％的欧洲人的皮肤病。它是一种尚不知其病因和具有不良预后的炎性和表皮过度增生的疾病。
MTX在被口服给予时，是对中度至重度银屑病的有效治疗。但是，它的应用伴随着立即的胃肠问题和长期的肝毒性。在临床反应之前大约需要6周的治疗。
已提出局部应用MTX可能会给作用部位提供药物并具有较小的副作用。这已进行过试验(Weinstein等，1989)但整体的结果不理想，可能是因为在皮肤上的存留不够。根据我们的观察，认为MTX-γ-GTP3具有与MTX相同的生物活性和增加的在皮肤中的存留。临床前研究
临床前研究表明局部应用MTX-γ-GTP3具有适于治疗银屑病的生物活性。它在减少UVB-诱发的裸鼠表皮过度增殖方面具有比MTX同等或更好的活性(图3)，并且通过Molek等(Brit J Derm(1983)108：25-31)的方法确定了它抑制UVB诱导的表皮DNA合成(图4)。皮内注射MTX-γ-GTP比MTX更为有效地降低了B16黑瘤的生长(美国专利5952499)。分布研究(上述)表明局部应用的MTX-γ-GTP3比MTX更长时间地存留在裸鼠的表皮上。局部或口服给予的MTX-γ-GTP3与MTX相比对裸鼠的毒性更小(参见上述)。
这些正性的临床前结果和缺乏良好的银屑病动物模型导致在人的局部用MTX-γ-GTP3的验证(proof-of-concept)试验。临床研究设计：
小斑块分析(Small Plaque Assay，SPA)评价化合物在两周时程内的抗银屑病作用。该分析在封闭情况下在单一斑块上同时测试6种化合物。这些受试化合物在各斑块上的位置是随机化的以消除评价的偏差和任何药物的相互作用。研究了11名患者。治疗：0.5％MTX-γ-GTP3溶液(试验配方)1.0％MTX-γ-GTP3溶液(试验配方)MTX-γ-GTP3赋形剂(阴性对照)0.5％MTX溶液(参比配方)MTX赋形剂(阴性对照)0.05％倍他米松戊酸酯(阳性对照)(所有的MTX-γ-GTP3溶液浓度都是就它们的MTX含量而论的)。日程表
天     治疗     评价
0136810131529     2％水杨酸应用药物应用药物应用药物应用药物应用药物应用药物     临床和组织学临床临床和组织学临床
参数
在临床反应明显之前大约需要6周口服MTX治疗。因此，在两周的SPA(受伦理学限制)期间采用局部MTX-γ-GTP3不可能观察到临床效果。但是，可以预期采用活性试剂，发生与银屑病消退相一致的早期组织学变化。因此，与临床评价一起，如下评价一系列的病理组织学和免疫组织学标记：·临床
在第0、8、15和29天浸润和红斑·病理组织学
角化不全     炎性浸润
颗粒性       棘皮病
血管变化     表皮增厚
乳头瘤病·免疫组织学
Involucrin       ICAM-1
丝聚合蛋白       Ki-67+角质形成细胞
CD4和CD8+T-细胞患者选择
纳入标准 排除标准
任何人种组的男性，18-70岁。非生殖状态的女性也允许。至少6个月的慢性斑块型寻常型银屑病。能够理解试验的目的和风险，给予的印象是她/他愿意在整个期间参与所有的评价，并已提供书面表示的同意。要求的斑块特征·位于躯干或四肢；但不在曲部·面积至少5.5×8.3厘米·均一的外观(红斑和浸润)·严重的红斑和浸润 脓疱性银屑病、红皮病型银屑病、皮褶性银屑病和/或活性银屑病关节炎。需要治疗的严重的间发性疾病或活性感染，包括肝炎或AIDS。已知是HIV阳性。已知对试验药物成分过敏。历史上的和/或现在的系统性恶性肿瘤。同时参加任何其它研究药物试验或在试验开始前4周接受研究药物。在试验开始前4周接受任何系统性抗银屑病治疗。在试验开始前两周接受任何局部抗银屑病治疗以测试斑块。逆表明(contra-indicate)参与试验的实验室值。任何形式的物质滥用、精神病或可能引起不能与研究者的交流的症状。已知具有肝硬化或其它肝病。服用可能与MTX相互作用的药物的患者。计算肌酐清除率＜30毫升/min的患者。
结果：临床
阳性对照，倍他米松显著地改善了试验区的临床外观，表明正确地进行了试验方法。在MTX-γ-GTP3和MTX试验点区域两周内很少或没有观察到变化。这并非是未预期的，因为口服MTX的抗银屑病活性所需的时程为6周。采用任何受试化合物都没有观察到严重的副作用或局部刺激。组织学
统计意义上，倍他米松除了角化过度和involucrin之外的所有的参数上都表现出抗银屑病活性。
MTX-γ-GTP3治疗对11名患者中的5名患者的丝聚合蛋白表达(基端表皮区别的标志)、颗粒性(在银屑病中颗粒层不存在或不完全)和角化不全(表皮角细胞的不完整形成)具有积极作用。·丝聚合蛋白
在所有检查的免疫组织学标记中，丝聚合蛋白证明是受试药物作用的
最有力的指示剂。检查患者丝聚合蛋白结果表明了对倍他米松的反应
和对MTX-γ-GTP3溶液的反应的相关性(图5)。MTX-γ-GTP3溶液
在浓度为0.5％时表现出最佳的丝聚合蛋白反应，而1％的MTX-γ-GTP3
和0.5％的MTX给出大致相同的结果。作为一组，与赋形剂相比，采
用0.5％MTX-γ-GTP3溶液的颗粒层的丝聚合蛋白表达存在差异。对
MTX也存在类似的反应(图6)。·颗粒性：角化不全比
计算颗粒性对角化不全比以给出治疗指数-比率升高表明银屑病消退
的趋势。与早期银屑病消退相一致的在颗粒性和角化不全的病理组织
学变化在采用0.05％倍他米松戊酸酯乳膏(11名患者中有10名)和
1.0％MTX-γ-GTP3溶液(11名患者中有5名)中是明显的-图7a)
和b)。用0.5％的MTX-γ-GTP3和MTX治疗导致很小的颗粒性：角
化不全比率反应(分别为1和2个患者)。临床研究结论
根据组织学(颗粒性和角化不全)和角化细胞成熟标记，丝聚合蛋白，证明MTX-γ-GTP3与其赋形剂相比表现出对许多患者的抗银屑病作用。这与其较MTX低的毒性相结合，使其成为对顽固性银屑病进行局部治疗的有效治疗剂。
本领域技术人员将认识到，可以在不背离广泛描述的本发明的实质和范围的情况下对如在特定的实施方案中所示的本发明进行多种改变和/或修饰。因此，应将本发明的实施方案完全理解为是说明性的而不是限制性的。

Claims (20)

1.具有分子式I的化合物：
Figure A9981595700021
其中M为甲氨蝶呤或其类似物，
A＝H、CX2-O-R2或卤素；
B＝H、CX2-O-R3或卤素；
X独立地为H或卤素；
n为0或者大于或等于1；
Y为连接基团，且如果n大于1，各个Y相同或不同；
R1、R2和R3相同或不同，且为氢、取代或未取代的甲基、乙基、饱和或不饱和的脂族酰基；
附加条件是当n为0或1，且A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3时，R1、R2和R3不选自脂族酰基；
附加条件是当n大于或等于2，A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3，且至少R1、R2和R3之一为脂族酰基时，-[Y]n-不为-(AA)n-或-Y-(AA)n-1-，其中AA为氨基酸。
2.根据权利要求1的化合物，其中M通过其γ羧基连接。
3.根据权利要求1的化合物，其中Y选自由以下组成的组：
  a)具有羧基和氨基的化合物；
  b)具有氨基和磺酸基的化合物；
  c)具有羟基和羧基的化合物；
  d)具有羟基和磺酸基的化合物；
  e)具有羟基和活性卤素基团的化合物；
  f)具有卤素基团和羧基的化合物；
  g)具有两个活性卤素基团的化合物；
  h)具有羟基和醛基的化合物；和
  i)烯化氧。
4.前述任一权利要求的化合物，其中-[Y]n-为-[AA]n-，其中的各个AA为氨基酸。
5.根据权利要求4的化合物，其中n为1，且AA为甘氨酸。
6.根据权利要求4的化合物，其中n为2，且AA为甘氨酸。
7.根据前述任一权利要求的化合物，其中A和B为CH2OH，且R1为H。
8.甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris。
9.甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-甘氨酸-Tris。
10.含有前述任-权利要求的化合物和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
11.根据权利要求10的药物组合物，其中该组合物为适于口服给予的形式。
12.根据权利要求10的药物组合物，其中该组合物为适于非胃肠给予的形式。
13.治疗患者的具有自体免疫成分的疾病或癌症的方法，该方法包括给予患者有效量的分子式I的化合物：
其中，M为甲氨蝶呤或其类似物；
A＝H、CX2-O-R2或卤素；
B＝H，CX2-O-R3或卤素；
X独立地为H或卤素；
n为0或者大于或等于1；
Y为连接基团，且如果n大于1，各个Y相同或不同；
R1、R2和R3相同或不同，且为氢、取代或未取代的甲基、乙基、饱和或不饱和的脂族酰基，
附加条件是当n为0或1，A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3时，R1、R2和R3不选自脂族酰基；
附加条件是当n大于或等于2，A为CH2-O-R2和/或B为CH2-O-R3，且至少R1、R2和R3之一为脂族酰基时，-[Y]n-不为-(AA)n-或-Y-(AA)n-1-，其中AA为氨基酸。
14.根据权利要求13的方法，其中M通过其γ羧基连接。
15.根据权利要求13或14的方法，其中治疗为具有自体免疫成分的疾病的治疗。
16.根据权利要求13-15中的任一权利要求的方法，其中具有自体免疫成分的疾病选自由银屑病、类风湿性关节炎、炎症性肠病和局限性回肠炎组成的组。
17.根据权利要求16的方法，其中疾病为银屑病。
18.根据权利要求16的方法，其中疾病为类风湿性关节炎。
19.根据权利要求13-18的任一权利要求的方法，其中分子式I的化合物通过口服或非胃肠给予。
20.根据权利要求13-19的任一权利要求的方法，其中分子式I的化合物为甲氨蝶呤-γ-甘氨酸-Tris。
CN99815957A 1998-12-04 1999-12-03 甲氨蝶呤衍生物 Pending CN1334815A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPP7513 1998-12-04
AUPP7513A AUPP751398A0 (en) 1998-12-04 1998-12-04 Methotrexate derivatives

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1334815A true CN1334815A (zh) 2002-02-06

Family

ID=3811723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99815957A Pending CN1334815A (zh) 1998-12-04 1999-12-03 甲氨蝶呤衍生物

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1135390A1 (zh)
JP (1) JP2002531566A (zh)
KR (1) KR20010081050A (zh)
CN (1) CN1334815A (zh)
AU (1) AUPP751398A0 (zh)
CA (1) CA2353839A1 (zh)
NO (1) NO20012720L (zh)
WO (1) WO2000034281A1 (zh)
ZA (1) ZA200104533B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101926860A (zh) * 2010-05-07 2010-12-29 宁波立华制药有限公司 一种芍药提取物甲氨蝶呤组合物及其制备方法与应用
CN111487208A (zh) * 2019-01-09 2020-08-04 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备甲氨喋呤检测试剂中的用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1958632A1 (en) * 2007-02-14 2008-08-20 Dan Stoicescu Use of condensed pyrimidine derivatives for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501655A (ja) * 1993-08-02 1997-02-18 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション 治療化合物−脂肪酸接合体
WO1996022303A1 (en) * 1995-01-16 1996-07-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Therapeutic compound - fatty acid conjugates

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101926860A (zh) * 2010-05-07 2010-12-29 宁波立华制药有限公司 一种芍药提取物甲氨蝶呤组合物及其制备方法与应用
CN111487208A (zh) * 2019-01-09 2020-08-04 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备甲氨喋呤检测试剂中的用途
CN111487208B (zh) * 2019-01-09 2023-07-14 北京九强生物技术股份有限公司 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备甲氨喋呤检测试剂中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000034281A1 (en) 2000-06-15
JP2002531566A (ja) 2002-09-24
EP1135390A1 (en) 2001-09-26
KR20010081050A (ko) 2001-08-25
NO20012720D0 (no) 2001-06-01
CA2353839A1 (en) 2000-06-15
NO20012720L (no) 2001-07-31
ZA200104533B (en) 2002-06-03
AUPP751398A0 (en) 1999-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2724436C1 (ru) Способ получения промежуточного соединения конъюгата антитело-лекарственное средство
CN1154512C (zh) 喜树碱的聚合衍生物
JP4091250B2 (ja) スフィンゴシン類誘導体及び医薬組成物
US6436386B1 (en) Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
JP5271677B2 (ja) １０−プロパルギル−１０−デアザアミノプテリンの精製組成物と腫瘍の治療への同化合物の使用方法
EP0513543B1 (de) Amidinophenylalaninderivate, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel als Antikoagulantien
US8784849B2 (en) Hydroxyapatite-targeting poly(ethylene glycol) and related polymers
CZ113493A3 (en) Derivatives of bile acid, process of their preparation and use of said derivatives as medicaments
KR101903768B1 (ko) 펩티드 및 펩티드­관련 화합물의 고침투성 전구약물 조성물
US11420949B2 (en) Cystine diamide analogs for the prevention of cystine stone formation in cystinuria
JP2002501512A (ja) 葉酸アンタゴニストと担体とを含有してなるコンジュゲート
CA1089485A (en) .omega.-AMINOCARBOXYLIC ACID AMIDES AND A PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF
JP2005533820A (ja) 癌治療のためのポルフィリン−ポリアミン結合体
Oatis Jr et al. Synthesis of quinazoline analogs of folic acid modified at position 10
JPS63250360A (ja) サイモペンチンレトロ−インバーソ類似体及びそのフラグメント
CN1334815A (zh) 甲氨蝶呤衍生物
CN1148384A (zh) 螯合剂化合物
Rosowsky et al. Methotrexate analogs. 13. Chemical and pharmacological studies on amide, hydrazide, and hydroxamic acid derivatives of the glutamate side chain
CN103570806A (zh) 多肽环氧酮化合物
CN1321166A (zh) 用于治疗脂代谢紊乱的与胆汁酸相连的丙醇胺类衍生物
JPS6111943B2 (zh)
WO2021117770A1 (ja) 医薬組成物及び処置剤
De Croos et al. Hemoglobin S antigelation agents based on 5-bromotryptophan with potential for sickle cell anemia
JPH08505143A (ja) ジフルオロペンタペプチド誘導体抗炎症剤
CN101367859B (zh) 脂肪酸胆汁酸偶合物及其医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication