KR20010081050A - 메토트렉세이트 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 I:

[화학식 I]

의 메토트렉세이트 결합체 및 자가면역 성분을 가진 질환 및 암의 치료에서 이의 사용에 관한 것이다. 화학식 I의 화합물의 특정 예로는 메토트렉세이트-γ-글리신 트리스를 들 수 있으며, 여기서, M은 메토트렉세이트 또는 이의 유사체이고; A=H, CX₂-O-R₂또는 할로겐; B=H, CX₂-O-R₃또는 할로겐; X는 독립적으로 H 또는 할로겐이고; n은 0 또는 1 이상이고; Y는 연결기이고, n이 1보다 클 때, 각 Y는 동일하거나 다르고; R₁, R₂및 R₃는 동일하거나 다르고, 수소, 치환 또는 비치환 메틸, 에틸, 포화 또는 불포화 지방성 아실기이고, 여기서, n이 0 또는 1이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃인 경우에 R₁, R₂및 R₃는 지방성 아실기로부터 선택되지 않고; n이 2 이상이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃이고, R₁, R₂및 R₃중 하나 이상이 지방성 아실기인 경우에 -[Y]_n-은 AA가 아미노산인 -(AA)_n- 또는 -Y-(AA)_n-1-과 다르다.

Description

메토트렉세이트 유도체{METHOTREXATE DERIVATIVES}

MTX는 효소 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 상의 활성 부위에 결합할 수 있고, 경쟁적 억제를 통하여 DNA 및 RNA의 생합성에 필요한 테트라히드로폴레이트(THF)의 형성을 차단할 수 있다. MTX는 또한 다른 폴레이트 의존성 효소를 억제한다.

핵산 합성을 억제하는 MTX의 능력은 비정상적인 세포 성장을 치료하는데 사용되어 왔다. 활성적으로 증식하는 세포들은 MTX에 더 민감하기 때문에, 악성세포 성장을 선택적으로 손상시키는데 사용할 수 있다. MTX는 종양 질환을 치료하는데 사용되는 항암제로 널리 사용되고 있다. MTX는 또한 항증식제 및 면역조절제로 작용하며, 건선 및 류머티즘성 관절염의 치료에 사용될 수 있다.

경구 MTX는 현재 보통 또는 심한 관절염 및 난치성 관절염을 치료하는데 사용되고 있다. 주당 투여량은 2.5 내지 25 mg이다. 이 약제는 간을 손상시킨다는 주요 장기간 부작용을 가진 그 독성 때문에 사용이 제한된다. 건선 치료에서 TMX를 국부적으로 적용하여 독성을 줄이고, 효능을 향상시키려는 시도가 있었으나, 아마도 피부를 잘 통과하지 못하거나 약제가 피부에 잔류하는 시간 때문에, 거의 또는 전혀 성공을 거두지 못하였다.

본 발명은 유도체를 포함하는 조성물인 메토트렉세이트(MTX)의 유도체 및 이 MTX 유도체를 사용하는 것을 포함하는 치료법에 관한 것이다.

도 1은 지연형 과민성 발바닥(footpad) 부종의 래트 분석에서 경구 MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3의 효과를 나타내는 박스도면이다. MTX-γ-GT 및 MTX-γ-GTP1은 모두 MTX와 마찬가지로 이 분석에서 활성이 있다. MTX-γ-GTP1은 통계적으로 MTX(p=0.021)보다 더 효과적이다.

도 2는 래트 보조제-유도된 관절염 모델에서 MTX 및 MTX-γ-GT의 효과를 나타내는 도면이다. 이 결과로부터 이 모델에서 공동 염증 발병의 지연시 2회 저투여에서 MTX-γ-GT는 MTX와 동등하다는 것을 알 수 있다.

도 3은 UVB 조사 후의 표피 DNA 합성에 대한 MTX-γ-GTP3의 억제 효과를 보여주는 도면이다. UVB 조사 후, 마우스는 DNA 합성으로 초기 억제에 반응하고, 48시간 후에는 DNA 합성이 현저히 증가한다. 합성을 이 펄스를 억제하는 경우 MTX-γ-GTP3는 적어도 MTX만큼 활성이 있다.

도 4는 UVB 조사에 이은 표피 세포의 유사분열 활성에서 MTX 및 MTX-트리스 결합체의 억제 효과를 보여주는 도면이다.

도 5는 SPA 원리 입증 실험에서의 필라그린(Filaggrin) 발현을 보여주는 도면이다. 이 도면은 국부적 MTX-γ-GTP3 또는 MTX 치료 후의 총 필라그린 발현 대 베타메타손과의 반응을 나타낸다. 오른쪽 상단의 사분면에 있는 환자들은 베타메타손과 0.5% MTX-γ-GTP3에 대해 모두 양성으로 반응하였다(^*로 표시; 환자 1, 2, 4, 6 및 8). 환자 5, 9 및 10은 베타메타손에 대해서는 반응하였으나, 0.5% MTX-γ-GTP3에 대해서는 반응하지 않았다. MTX(원형) 및 1.0% MTX-γ-GTP3(사각형)은 또한 유사한 방식으로 양성인 환자를 나타낸다. 베타메타손 및 MTX-γ-GTP3에 대한 반응 간의 관계는 이 실험에서 두가지 주요 그룹이 있다는 것을 나타낸다: 반응자 및 비반응자.

도 6은 베타메타손 치료와 비교하여 경구 MTX-γ-GTP3 또는 MTX로 치료한 SPA 환자의 과립층에서 필라그린 발현에 대해 모아진 결과를 보여주는 박스 도면이다. 여기에는 양성 대조구 베타메타손 대 이의 비히클의 통계적으로 중요한 효과가 있다. 0.5% MTX-γ-GTP3과 이의 비히클을 비교하면 0.08의 경계선 유의성이 있다.

도 7은 1.0%, 0.5% MTX-γ-GTP3 용액, 0.5% MTX 및 0.05% 베타메타손 발러레이트 크림을 사용하여 치료한 환자의 과립:부전각화증 비율을 보여주는 도면이다. 1.0% MTX-γ-GTP3는 분석판의 이러한 초기 표지를 가진 양성 결과를 보여주고 있다.

본 발명을 수행하기 위한 방법

약어:

AICAR 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드

APA 4-아미노-4-데옥시-N¹⁰-메틸프테로산

DAHMP 2,4-디아미노-6-히드록시메틸프테리딘

DCC 1,3-디시클로헥실카르보디이미드

DCM 디클로로메탄

DECP 디에틸 시아노포스포네이트

DMA N,N-디메틸아세트아미드

DMAP 4-디메틸아미노피리딘

DMF N,N-디메틸 포름아미드

Et₂O 디에틸에테르

EtNⁱPr₂디-이소프로필 에틸 아민

EtOAc 에틸 아세테이트

GT 글리신-트리스

GTP1 글리신-트리스 모노팔미테이트

GTP2 글리신-트리스 디팔미테이트

GTP3 글리신-트리스 트리팔미테이트

HOAc 아세트산

HOSu N-히드록시숙신이미드

MABA N-메틸 아미노벤조산

MTX 메토트렉세이트

MTX-γ-GT 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스

MTX-γ-GTP1 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스 모노팔미테이트

MTX-γ-GTP2 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스 디팔미테이트

MTX-γ-GTP3 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스 트리팔미테이트

OMe 메틸 에스테르

P₂O₅오산화인

PmCl 염화 팔미토일

PPh₃트리페닐 포스핀

RM 반응 혼합물

RT 실온

tBu 3차 부틸 에스테르

tBuOAc 3차 부틸 아세테이트

TFA 트리플루오로아세트산

TPPO 트리페닐포스핀 옥사이드

Z-GT 벤질옥시카르보닐 글리신-트리스

Z-GT1 벤질옥시카르보닐 글리신-트리스 모노팔미테이트

Z-GT2 벤질옥시카르보닐 글리신-트리스 디팔미테이트

Z-GT3 벤질옥시카르보닐 글리신-트리스 트리팔미테이트

제 1 실시형태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물:

(상기 식에서, M은 메토트렉세이트 또는 이의 유사체;

A=H, CX₂-O-R₂또는 할로겐;

B=H, CX₂-O-R₃또는 할로겐;

X는 독립적으로 H 또는 할로겐이고;

n은 0 또는 1 이상이고;

Y는 연결기이고, n이 1보다 클 때, 각 Y는 동일하거나 다르고;

R₁, R₂및 R₃는 동일하거나 다르고, 수소, 치환 또는 비치환 메틸, 에틸, 포화 또는 불포화 지방성 아실기이고,

여기서, n이 0 또는 1이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃인 경우에 R₁, R₂및 R₃는 지방성 아실기로부터 선택되지 않고;

n이 2 이상이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃이고, R₁, R₂및 R₃중 하나 이상이 지방성 아실기인 경우에 -[Y]_n-은 AA가 아미노산인 -(AA)_n- 또는 -Y-(AA)_n-1-과 다르다)

을 제공한다.

메토트렉세이트 유사체의 예는 종래 기술에 기재되어 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참조문헌으로 통합된 문헌들(A.L.Jackman ed(1999). "Antifolate Drugs in Cancer Therapy" Humana Press, Totowa, New Jersey; Matsuoka, H and Mihara, M(1998). "The synthesis and biological evaluation of new methotrexate derivatives in rheumatoid arthritis. Drugs of the Future 1998. 23(9); 1015-1022; and Degraw, J et al.(1995) "New analogs of methotrexate in cancer and arthritis". Current Medicinal Chemistry 2:630-653)을 참고한다.

바람직하게는 M은 메토트렉세이트이다.

본 발명에서 유용한 연결기의 예로는 하기 물질들을 들 수 있다:

a) M에 대해 아미노기 및 NHC(A)(B)CX₂OR₁기에 대해 카르복시기를 가진 연결기, 예를 들어, 아미노산 또는 항생물질.

b) M에 대해 아미노기 및 NHC(A)(B)CX₂OR₁기에 대해 술폰산기를 가진 연결기, 예를 들어, 2-아미노에탄술폰산(타우린).

c) M에 대해 히드록시기 및 NHC(A)(B)CX₂OR₁기에 대해 카르복시기를 가진 연결기. 이 연결기는 히드록시산일 수 있다. 히드록시산은 아미노산의 아미노기가히드록시기로 치환된 아미노산의 유사체일 수 있다. 히드록시산의 예로는 글리콜산(HOCH₂COOH); 락트산(HOCH(CH₃)COOH); 4-히드록시-부티르산 (HOCH₂CH₂CH₂COOH); 6-히드록시-카프로산; 10-히드록시-데카노산; 2-히드록시-카프로산; 2-히드록시부티르산; 3-히드록시-부티르산 등을 들 수 있다. 이 산들을 사용하면 더 안정한 아미드 결합 보다는 불안정한 에스테르 결합을 통하여 약제에 트리스, 또는 트리스-결합체의 연결이 가능하다.

d) M에 대해 히드록시기 및 NHC(A)(B)CX₂OR₁기에 대해 술폰산기를 가진 연결기, 예를 들어, 2-히드록시에탄술폰산(이세톤산(isethonic acid)).

e) M에 대해 히드록시기 및 NHC(A)(B)CX₂OR₁기에 대해 반응성 할라이드기를 가진 연결기, 예를 들어, 2-클로로에탄올.

f) 히드록시기 및 알데히드기를 가진 연결기, 예를 들어, p-히드록시벤즈알데히드,

g) 할라이드기 및 카르복시기를 가진 연결기, 예를 들어, 2-클로로아세트산;

h) 두 반응성 할라이드기를 가진 연결기, 예를 들어, 1,2-디브로모에탄; 및

i) 알킬렌 옥사이드, 예를 들어, 에틸렌옥사이드.

NHC(A)(B)CX₂OR₁기는 메토트렉세이트 화합물의 α 또는 γ 카르복시기에 부착될 수 있다. NHC(A)(B)CX₂OR₁기는 선택적으로 연결기에 의해 메토트렉세이트 화합물의 γ카르복시기에 부착되는 것이 더 바람직하다.

Y가 아미노산인 경우, 천연 및 비-천연 아미노산을 포함하는 임의의 적당한 아미노산 및 이의 유사체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산은 글리신이다.

R₁, R₂및 R₃는 각각 H인 것이 바람직하다.

n은 0-5의 범위에 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, M은 메타트렉세이트이고, -[Y]_n-는 AA가 아미노산인 -[AA]_n-이다. 바람직하게는 AA는 글리신이고, n은 1이다. n≥2 인 경우, 각각의 AA가 동일한 아미노산일 필요는 없다.

바람직한 메토트렉세이트 유도체는 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스 (MTX-γ-GT)이다.

제 2 실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석액이 혼합된 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 형태의 조성물에서, M은 메토트렉세이트이다. Y는 글리신이고, n은 1이다.

바람직한 메토트렉세이트 유도체는 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스이다.

경구 투여에 적합한 조성물은 액제, 캅셀제, 현탁제, 에멀젼 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 일반적인 정제 성분과 혼합된 정제 형태로 존재할 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 수성 및 비수성 주사액 또는 에멀젼을 포함한다.

국부 투여에 적합한 제제는 본 발명의 화합물이 혼합된 크림제, 젤, 페이스트제, 고약, 찜질약, 비강 스프레이, 폐 에어로졸 또는 폼(foam)제 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 좌제, 페서리, 탐폰, 크림제, 젤, 페이스트제, 로션, 임플란트, 패치 또는 폼제 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 임플란트 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 폐에 투여하기 위하여 액체 에어로졸 또는 산제 형태로 존재할 수 있다.

약제학적 조성물에서 본 발명의 MTX 유도체의 투여 수준은 선택된 시간 프레임에서 예방 또는 치료 반응에 영향을 주기에 충분할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식 I의 화합물을 예방적 또는 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 암 또는 자가면역 성분을 가지는 질환의 치료법을 제공한다.

따라서, 제 3 실시형태에서, 본 발명은 화학식 II에 따른 화합물:

(상기 식에서,

D=H 또는 CX₂-O-R₄또는 할로겐;

E=H 또는 CX₂-O-R₅또는 할로겐;

X는 상기 정의된 바와 같고;

n은 상기 정의된 바와 같고;

Y는 상기 정의된 바와 같고;

R₄, R₅및 R₆는 동일하거나 다르고, 수소, 치환 또는 비치환 메틸, 에틸 또는 포화 또는 불포화 결합을 가진 지방성 아실기이다)

을 환자에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 자가면역 성분을 가진 질환 또는 암의 치료법을 제공한다.

자가면역 성분을 가진 질환은 면역억제가 필요한 어떤 상태일 수 있다. 예를 들어, 자가면역 성분을 가진 질환은 건선 또는 류머티즘성 관절염일 수 있다.

자가면역 성분을 가진 질환은 환자의 장염 질환 또는 크론병일 수 있다.

제 3 실시형태의 방법에 사용되는 바람직한 화합물은 화학식 I의 화합물이다.

본 발명의 치료법은 임의의 적당한 경로, 예를 들어, 경구, 비경구, 이식 및 국부적 경로에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 MTX 유도체의 투여 수준은 치료할 상태의 특성 및 심각도에 따라 다르지만, 일반적인 투여량은 예방적 또는 치료적 효과를 나타내기에 충분하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 MTX 유도체를 조성물의 약 0.001 내지 약 90% 범위의 양으로 함유할 수 있다. 정제와 같은 경구형 조성물은 MTX 유도체를 경구조성물의 85% 이하, 바람직하게는 2 내지 60%로 함유할 수 있다. 여기서의 농도는 단지 기술하기 위해 제공된 것이며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 하기 비제한적인 실시예를 제공한다.

메토트렉세이트-γ-글리신-트리스(MTX-γ-GT)의 제조

글리신-트리스(GT)

C₆H₁₄N₂O₄

분자량 178.19

N-(벤질옥시카르보닐)-글리신-트리스(Z-GT; 미국 특허 제 5,952,499호)(1.70 g, 5.44 mmol)을 가온 및 교반하면서 에탄올(60 ㎖)에 용해시켰다. 냉수조에 침지시켜 실온으로 냉각시킨 후, 탄소 상의 팔라듐(10%, 0.14 g)을 첨가하고, 시스템을 배기하고, 수소로 3회 충전하였다. 이 혼합물을 19시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 격렬하게 교반한 후, 두 개의 유리섬유(GF/A) 여과지를 통해 여과하였다(에탄올로 세정(약 10 ㎖)). 여과물을 증발시켜 백색 고체인 GT(0.97 g, 100%)를 남겼다.¹H n.m.r.(d₆-DMSO) δ2.1, br s, NH₂; 3,1,s,NCH₂CO; 3.55, s, 3xCH₂O; 5.0, br s, 3xOH; 7.95, br s, NH.

메토트렉세이트-α-3차-부틸 에스테르(MTX-α-tBu; 미국 특허 제 5,952,499호)(0.438 g, 0.86 mmol)를 DMF(4 ㎖)에 교반하면서 용해시켰다. HOSu(0.12 g, 1.03 mmol)을 첨가하고, 용해될 때까지 교반하였다. DCC(0.27 g, 1.29 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 질소 하에 교반하였다. DCC(100 mg)를 더 첨가하고, 이 혼합물을 한 시간 더 교반하였다. DMF(1.5 ㎖) 중의 GT(0.23 g., 1.29 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 54시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 유리솜을 통해 여과하고, 여과물을 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 상에서 방사상으로 크로마토그래피하였다. DCM 중의 15% 메탄올로 용리하여 황색 고체인 표제의 화합물(0.33 g, 57%)을 얻었다.¹H n.m.r.(d₆-DMSO) δ1.39, s, C(CH₃)₃; 1.96, m, 글루-β-CH₂; 2.24, m, 글루-γ-CH₂; 3.21, s, Nme; 3.52, d, J 6Hz, 3xCH₂OH; 3.70, d, J 6 Hz, 글리 NCH₂CO; 4.22, m, 글루-α-H; 4.69, t, J 6 Hz, 3xOH; 4.79, s, ArCH₂n 6.62, br s, NH₂; 6.82, 7.72 AA'BB', J 9Hz, ArH; 7.14, s, 트리스 NH; 7.46, br s, NH₂; 8.10, t, J 6Hz, 글리 NH; 8.27, d, J 7Hz, 글루 NH; 8.56, s, H-7, 질량 스펙트럼[전기스프레이 이온화, 양이온 모드(ES(+))]m/z671 (M+1)

MTX-α-t-Bu-γ-GT(0.459 g, 0.68 mmol)을 TFA(3 ㎖)에 교반하면서 용해시켰다. 이 용액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하고, 진공 하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고, 중탄산나트륨 수용액(75 ㎖ 중의 1g)을 사용하여 용액의 pH(약 2)를 6으로 조절하였다. pH 4가 되도록 수성 HOAc(10%)를 첨가하였다. 이 용액을 동결-건조하고, 잔류물을 속성 크로마토그래피로 정제한 후, 실리카겔 상에서 방사상 크로마토그래피(2회) 하였다. 메탄올:클로로포름(3:5) 중의1-3% 물로 용리하여 황색 고체인 표제 화합물(0.086 g, 21%)을 얻었다.¹H n.m.r.(d₆-DMSO) δ1.96, m, 글루-β-CH₂; 2.14, m, 글루-γ-CH₂; 3.19, s, Nme; 3.5-3.7, m, 3xCH₂OH + 3xCH₂OH; 3.95, m, 글리 NCH₂CO; 4.41, m, 글루-α-H; 4.76, s, ArCH₂N; 5.37, br s, NH₂; 6.61, br s, NH₂; 6.84, 7.62 AA'BB', J 9Hz, ArH; 7.60, m, 글루 NH; 7.71, s, 트리스 NH; 8.23, t, J 6Hz, 글리 NH; 8.57, s, H-7, ES(+) 질량 스펙트럼 m/z 615(M+1), 637(M+Na), 659(M+2Na).

메토트렉세이트-γ-글리신-트리스 모노, 디 및 트리팔미테이트(MTX-γ-GTP1, MTX-γ-GTP2, MTX-γ-GTP3)의 제조

표제의 화합물들은 미국 특허 제 5,952,499호에 기재된 대로 또는 하기 공정을 통하여 제조할 수 있다.

2,4-디아미노-6-히드록시메틸프테리딘(DAHMP)의 합성

참조 문헌:Rosowskyet al, J. Med. Chem., 1985, Vol. 28, No. 5, 660-667.

반응물:

DAHMP. 염산염(69.04g, 0.30mol)

HOAc(120㎖)

H₂O(1200㎖)

공정:

DAHMP.HCl을 수성 아세트산에 (80℃로 가열하면서) 용해시켰다. 이 용액을 유리솜을 통해 여과하고, 45℃로 냉각하였다. 수산화암모늄 농축액을 사용하여 pH를 5.3-5.6(pH 페이퍼로 측정)로 조절하였다. RM을 RT로 냉각하고 여과하였다. 수집한 황색/캐러멀 색 고체를 물로 두 번 세척하고, 80℃에서 밤새 x 2 진공 오븐 중에서 P₂O₅로 건조시켜, 금색/황갈색 고체인 원하는 DAHMP(무염기)(52.90g, 92%)를 얻었다.

4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]-벤조산, 또는 4-아미노-4-데옥시-N ¹⁰ -메틸프테로산(APA)

참고 문헌:Kralovecet al, J. Med. Chem., 1989, Vol. 32, No. 11, 2426-2431.

Rosowskyet al, J. Med. Chem., 1985, Vol. 28, No. 5, 660-667.

반응물:

DAHMP (15.00g, 78mmol)

Br₂(3당량, 12.1ml, 37.53g, 0.23mol)

PPh₃(3당량, 61.44g, 0.23mol)

DMA(187ml)

MABA(13.57g, 89mmol)

EtNⁱPr₂(3당량, 40.6ml, 30.1g, 0.23mol)

공정:

질소 하에서 Br₂를 얼음 냉각되고 교반된 DMA 중의 PPh₃의 혼합물에 주사기로 서서히 첨가하였다. 고체 DAHMP를 첨가하고(RM 위로 질소 기류), RM을 RT에서 24시간 동안 교반하였다. 주사기로 아민을 첨가한 후, 고체 MABA를 첨가하였다(질소 기류). RM을 RT에서 67.5 시간 동안 교반하였다. RM을 수산화나트륨 수용액(0.33M, 125ml)에 붓고, 생성된 침전물을 여과해내고, 수성 아세트산(10%, v/v)을 사용하여 여과물의 pH를 5.5로 조절하였다. 침전물을 수집하고, 물, 차가운 에탄올, 및 에테르로 연속으로 세척하고, 40℃ 진공 오븐에서 4일 동안 건조시켜 황색 고체(25.79g)를 얻었다. TPPO 및 MABA 오염물을 제거하기 위해, 조생성물을 RT에서 50시간 동안 메탄올:에탄올(3:2)(50ml)에서 교반하고, 여과하고, Et₂O(x2)로 세척하고, 공기-건조하고, 배기하여 황색 고체인 APA(24.48g, 87%)를 얻었다.

L-글루탐산-α-tBu-γ-Me 에스테르

참조 문헌:Rosowskyet al, J. Med. Chem., 1981, Vol. 24, No. 12, 1450-1455.

반응물:

L-글루탐산 5-Me 에스테르(17.54g, 0.108mol)

tBuOAc(200ml)

70% HClO₄(10.9ml, 0.12mmol)

공정:

HClO₄를 tBuOAc 중의 기질의 현탁액/분액에 서서히 첨가하였다(산을 첨가하는 동안, 기질이 용해하기 시작하였다). 느슨하게 막은 플라스크에서 RM을 40시간 동안 RT에서 교반하였다. RM을 0.5N HCl(2 x 200ml, 1 x 150ml)로 추출하였다. 수층을 얼음/염/드라이아이스 조에서 냉각시키고(> -5℃), 용액의 온도를 약 -4℃로 유지하면서 (pH 약 8 및 NaHCO₃가 더 용해되지 않을 때까지) 고형 탄산수소나트륨으로 중화하였다. 이 혼합물을 에테르(RT, 4 x 200ml)로 추출하고, 결합된 유기층을 염수(100ml)로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 증발시켜(회전 증발기, 그리고 나서 가열 없이 오일 펌프), 거의 무색이고, -20℃에서 저장시 부분적으로 고형화된 점성 오일인 원하는 생성물(10.77g, 45%)을 얻었다.

MTX-α-tBu-γ-Me 디에스테르

참고 문헌:(1)Rosowskyet al, J. Med. Chem., 1981, Vol. 24, No. 12, 1450-1455.

(2)Kralovecet al, J. Med. Chem., 1989, Vol. 32, No. 11, 2426-2431.

반응물:

APA(8.56g, 23.7mmol)

EtNⁱPr₂(9.0ml, 51.7mmol)

DMF(460ml)

DECP(7.20g, 44.1mmol)

L-글루탐산 a-tBu-γ-Me 에스테르(7.26g, 33.4mmol)

EtNⁱPr₂(8.5ml, 48.8mmol)

공정:

APA(과립화된)를 10분에 걸쳐 DMF(400ml) 중에 DECP 및 EtNⁱPr₂(제 1부)을 녹인 용액에 부분적으로 첨가하였다. 이 용액을 오일조(80℃로 예열)에 2분 동안 침지시켰다(내부 온도 34℃). 플라스크를 조에서 꺼내고, 30분 동안 교반하였다(내부 온도 22℃). EtNⁱPr₂의 제 2부를 첨가한 후, DMF(50+10ml 세정) 중의 글루타메이트를 첨가하였다. RM을 14시간 동안(밤새) 실온에서 질소 하에 교반하였다. 물(60ml)에 NaHCO₃(1.80g, 21mmol)를 녹인 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 증발시켰다(회전식/오일펌프, 45℃). 잔류물을 클로로포름(약 400ml)에 용해시키고, 이 용액을 물(300ml) 및 5% 중탄산나트륨 수용액(200ml)으로 세척하였다. 유기층을 염수(30ml)로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 증발시켰다. 잔류물(갈색, 점성 검)을 DCM 중의 5% 메탄올을 사용하여 작은 실리카 컬럼을 통해 여과하여 극성 불순물을 제거하고, 생성물을 DCM 중의 7-12% 메탄올로 용리하면서 실리카겔 상에서 속성 크로마토그래피하여, 밝은 황색 고체인 세 개의 분획: 1(약간의 불순물)(2.17g, 18%); 2(고순도)(4.40g, 36%); 및 3(약간의 불순물)(2.77g, 22%)으로 생성물을 얻었다.

MTX-α-tBu 에스테르

(이것은 미국 특허 제 5,952,499호-화합물 IV에 기재된 것과 동일한 중간체이다)

참고 문헌:Rosowskyet al, J. Med. Chem., 1981, Vol. 24, No. 12, 1450-1455.

반응물:

MTX-α-tBu-γ-Me 디에스테르(5.00g, 9.5mmol)

Ba(OH)₂.8H₂O(1.82g, 5.8mmol)

에탄올(95ml)

물(110ml)

물(10ml) 중의 Na₂SO₄.10H₂O(1.93g, 6.0mmol)

공정:

처음 세 개의 반응물을 혼합하고, 느슨하게 막은 플라스크에서 19시간 동안 RT에서 교반하였다. 황산나트륨 수용액을 첨가하고, 이 혼합물을 수 분동안 교반한 다음(BaSO₄침전물은 즉시 형성되는 것으로 보임), 3번 또는 4번 유리 소결물 상에서 2xGF/A 여과지를 통해 여과하였다. 10% HOAc 수용액을 사용하여 여과물의 pH를 5로 조절하였다. 결과 현탁액(젤라틴성 침전물)을 30분 동안 냉각시키고, 유리 소결물 상에서 1번 여과지를 사용하여 여과하여 고체를 수집하였다. 수집한 고체를 (여전히 깔때기의 여과지 상에서) 밤새 공기-건조시킨 후, 증발시켜(오일펌프) 밝은 오렌지/황색 고체인 원하는 생성물(4.41g, 91%)을 얻었다.

반응물:

Z-GT(50.00g, 0.16mol)

PmCl(108ml, 97.85g, 0.356mol)

Et₃N(100ml, 72.4g, 0.72mol)

DMF(450ml)

DCM(1.60 + 0.20L)

공정:

Z-GT를 5L 둥근 바닥 삼구 플라스크에서 DMF에 용해시켰다. DCM(1.6L)을 첨가하고, 이 교반된 용액을 빙염조(ice-salt bath)에서 1시간 동안 냉각시켰다. DCM 중의 PmCl 용액(100ml)을 2시간에 걸쳐 적가하고, 조 온도를 -13 내지 -10℃로 유지하였다. 적하 깔때기를 DCM(100ml)으로 헹구었다. RM을 동일한 온도에서 2시간, 이어서 4℃에서 주말동안 추가로 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다(증발시 생성되는 침전물은 DCM의 제거 후 여과하여, DMF를 효율적으로 제거하였다.). 잔류물을 EtOAc(400ml), 이어서 DCM(800ml)으로 추출하였다(EtOAc 추출물은 염수 또는 물로 추출물을 세척할 때 침전하였다.). 결합된 유기 추출물을 염수로 세척하고 건조시켰다(MgSO₄). 진공 하의 용매 제거를 통하여 황색 왁스인 조생성물(133.48g)을 얻었다. HPLC 분석 결과, Z-GTP3, Z-GTP2 및 Z-GTP1이 각각 28.8%, 47.4% 및 23.8% 비율로 혼합된 혼합물로 밝혀졌다.

반응물:

MTX-α-tBu 에스테르(11.00g, 21.5mmol)

DCC(1.2당량, 5.50g, 26.7mmol)

GTP3(1.1당량, 21.32g, 23.9mmol)

DMAP(0.1당량, 258mg, 2.1mmol)

DMF(86ml)

DCM(340ml)

공정:

MTX-α-tBu 에스테르를 DMF 중에 교반하면서 용해시켰다. DCM(200ml)를 첨가하였다. DCC를 첨가하고, 이 용액을 20분간 교반하였다. DCM 중의 GTP3(70ml)를 10분에 걸쳐 적가하였다. DMAP를 첨가하고, RM을 RT에서 질소 하에 밤새(24시간) 교반하였다. RM을 여과하여, 백색 고체인 우레아 부산물을 DCC로부터 제거하고, 농축하여(회전식/오일 펌프, 50℃) DMF를 제거하였다. 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 재여과 및 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc/DCM(150/20ml) 중에 용해시키고, 염수로 세척하고, 건조(MgSO₄) 및 증발시켰다. 잔류물을 반씩 나누어, 각각을 실리카겔 상에서 속성 크로마토그래피하되, 반은 DCM 중의 5% 메탄올로 용리시키고, 나머지 반은 DCM 중의 3.7-4.4% 메탄올로 용리시켰다. 불순한 분획을 재크로마토그래피함으로써 (1) (>95%의 순도)(17.18g, 58%) 및 (2) (90-95%의 순도)(4.83g, 16%)의 두 분획(밝은 황색 고체)의 생성물을 얻었다. 8-10% 메탄올로 추가 용리하여 밝은 황색 고체 부산물을 함유하는 세번째 분획을 얻었다.

반응물:

MTX-α-tBu-γ-GTP3(0.86g, 0.62mmol)

TFA(1.7ml, 22mmol)

DCM(5ml)

공정:

TFA를 얼음 냉각되었으며 교반된 DCM 중의 기질 용액에 적가하였다. RM을 RT로 가온하고 질소 하에서 5.5시간 동안 교반하였다. RM을 4℃에 밤새 방치한 후 DCM(25ml)으로 희석하고 중탄산 나트륨 수용액(5% w/v, 35ml)으로 세척하였다. HOAc(빙초산, 1.8ml)을 첨가하고 혼합물을 흔들었다(pH~4 확인). 유기층을 물로 세척하고(2x25ml)(약간의 NaCl & 메탄올 & 새로 만든 용매를 첨가하여 휘저으면서 가온하여 현탁 상태를 깨뜨렸다.), 건조(MgSO₄) 및 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 상에서 속성 크로마토그래피하되, DCM 중의 메탄올을 사용하여 8-30% 단계 구배(3X4%; 2X5% 단계)로 용리하여 (1) (미량의 고Rf 부산물, 187mg), (2) (고순도, 476mg) 및 (3) (미량의 저Rf 부산물, 79mg)의 세 분획의 생성물을 얻었다. 모든 분획은 황색 고체였으며, 상당히 고순도였다. 분획 (2)->97.25% 순도(HPLC). 수율=742mg, 90%.

Z-GTP1 & 2 로부터 각각 유사한 방법으로 MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP2를 제조할 수 있다.

시험관 내 DHFR 억제

디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)는 MTX의 표적 효소이다. 이는 하기 반응에서 촉매작용을 한다.

340nm에서의 NADPH 산화율로 시험관 내에서 이의 활성을 측정할 수 있다.

방법:

MTX, MTX-γ-GT 및 MTX-γ-GTP1 에 의한 DHFR의 억제를 문헌[Imbert AM, Pignon T, Lena N(1983) "Enzymatic assay for methotrexate with a centrifugal analyser(Cobas-Bio)" Clin Chem, 29(6): 1317-1318]에 기재된 바와 같이 측정하였다.

결과:

MTX-γ-GT는 MTX와 동일한 농도 범위에서 DHFR를 억제하였다(표 1).

2.86nM에서 DHFR에 대한 MTX 및 MTX-γ-GT의 억제 활성

화합물	% 억제
MTXMTX-γ-GT	45.536.4

MTX-γ-GTP1의 억제 활성도 시험하였다. DHFR을 50% 억제하기 위하여 필요한 농도는 76nM이었다. 이는 4.8nM에서 DHFR를 50% 억제하는 MTX보다 16X 낮은 활성이다.

MTX-α-GTP1은 이러한 조건하에서 DHFR을 억제하지 않았다.

MTX-γ-GTP2 및 MTX-γ-GTP3은, 이들의 용해도 특성이 이 검정 시스템과 양립할 수 없으므로 시험하지 않았다.

래트에서의 지연형 과민증(DTH) 반응을 이용한 MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3의 조사

지연형 과민증(DTH)은 다양한 치료제의 작용을 평가하기 위하여 사용할 수 있는 면역 반응이다. 대상을 화합물로 감작시키고, 이어서 동일한 화합물로 자극시에 자극 부위에서의 부종의 발생을 관찰함으로써 이를 확인할 수 있다. MTX는 부종을 감소시키는 면역억제 효과를 가지며, 이러한 DTH 반응의 감소를 사용하여, MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3의 효능 중 일면을 평가하였다.

방법:

코펜하겐(COP) 래트의 복부를 면도하고 아세톤 중의 0.5% 디니트로플루오로벤젠(DNFB) 100㎕를 3일동안 매일 적용하였다. 이와 동시에, 두유, MTX(0.5mg) 또는 동량의 MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3을 5일동안 매일 래트에 경구 투여하였다. 7일 째에, 래트를 메톡시플루란으로 마취하고, 아세톤 중의 2% DNFB 25㎕를 왼쪽 발바닥에 가하기 직전에 발바닥 부피를 측정하였다. 마취 하에, 23시간 후에 발바닥을 측정하였다. 실험실에서 제작한 온코미터로 플레디스모그래피(plethysmography)(투입 후 관찰되는 부피 변화로 대상의 부피를 측정)하여 발바닥의 부피를 측정하였다. 23시간에서의 발의 부피에서 0시간에서의 발의 부피를 빼 줌으로써 순부종(nett oedema)을 계산하였다.

약물:

두유 중의 MTX(1mg/ml)

두유 중의 MTX-γ-GT-(1.4mgs/ml)-(Batch QY5-64MXS),

두유 중의 MTX-γ-GTP1 -(1.88mg/ml)-(Batch GB4-99 NB00077-p50)

두유 중의 MTX-γ-GTP3-(3mg/ml) (Batch QY 4-41 FP)

대조구-두유

결과:

순 발바닥 부종의 데이터를 도 1 에 나타낸다.

평균 순 발바닥 부종은 대조구의 래트와 비교할 때 MTX-γ-GTP3 이외의 MTX, MTX-γ-GTP1, MTX-γ-GT로 치료한 래트에서 크게 경감되었다(표 2). 또한, MTX-γ-GTP1 -치료된 래트의 순 발바닥 부종은 MTX-치료된 쥐보다 크게 경감되었다(p=0.021).

데이터의 평균, SD 및 p 값

치료	n	평균 부종(ml)	SD	대조구와 비교한 p 값
대조구MTXMTX-γ-GTP3MTX-γ-GTMTX-γ-GTP1	388221811	0.3630.2160.3270.1920.055	0.2540.1500.3250.2370.050	-0.044*0.590.0195*<0.0001*
* 통계적으로 유의성 가짐

토론:

DTH는 항원 자극 후에 염증 반응으로 나타나는 생체 내 T 세포-의존성 면역 반응이다. 따라서, 이러한 결과는 MTX-γ-GT 및 MTX-γ-GTP1 의 면역억제 효과가 MTX와 적어도 동등하거나 이보다 더 효과적일 수도 있음을 나타낸다.

시험관 내 세포독성

MTX 및 이의 트리스 접합체의 배양 세포 증식을 억제하는 능력을 평가하였다.

방법:

세포 증식에 미치는 MTX 및 MTX-트리스 접합체의 효과를 통상의 세포 배양 절차를 사용하여 연구하였다. 하기 세포주를 시험하였다:

JURKAT(인간 급성 T-세포 백혈병)

스위스 마우스 피브로블라스트(3T3) 세포

CCRF-CEM(CEM) 인간 T-세포 백혈병

JURKAT 세포를 약물의 존재 하에 64시간동안 배양하고, 3T3 및 CEM 세포는 각각 48시간 및 96 시간동안 화합물의 존재 하에 배양하였다. 모든 연구는 96-조 플레이트 및 약물이 함유되지 않은 대조구 조에서 수행하였다. 이어서, MTS 또는 MTT 검출을 사용하여 세포 증식을 측정하였다: (D Marks, L Belov, MW Davey, RA Davey, A Kidman, Leukemia Research 16, 1165-1173. "The MTT cell viability assay for cytotoxicity testing in multidrug-resistant human leukemic cells").

결과:

모든 접합체는 증식을 억제하였고, 시험한 모든 세포 형태에 대하여 모 화합물인 MTX보다 독성이 적었다. 결과를 표 3에 요약한다.

감소된 활성은 MTX의 α- 또는 γ-COOH 상의 변형에 기인하는 것으로 보인다. 생체 내 MTX는 γ-COOH 상에 폴리글루타밀화되고((glu)_n의 첨가), 이는 MTX 독성의 중요한 양상이다. 이는 세포내 보유를 증가시켜, 결과적으로 DHFR을 통한 테트라히드로폴레이트 합성을 지속적으로 차단한다. MTX-γ-(glu)_n은 또한, 티미딜레이트 합성효소 및 AICAR 트랜스포르밀라아제를 포함하는 DNA 및 RNA 합성과 관련있는 다른 효소에 대하여 큰 억제 효과를 갖는다. 폴리글루타메이트 형성 및 축척은, 이들이 장기간 세포 내에 보유되어 원하지 않는 독성을 일으킬 수 있는 일부 기관(신장 및 간)에서 상당량 형성됨에 따라, 생체 내에서 원하지 않는 효과를 낳을 수 있다.

본 출원인의 접합체 중 일부(즉, MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3)는 γ-COOH 상에서 변형되고 폴리글루타밀화되지 않는 것으로 보이며, 따라서 이들의독성 감소가 설명된다.

γ-COOH는 또한 세포 흡수와 관련있으며, 변형을 통해 흡수가 감소될 수 있다. 본 출원인이 연구한 바에 따르면, 다양한 MTX-γ-접합체는 세포 성장에 미치는 효과가 상이하다. MTX-γ-GT는 MTX-γ-GTP1 또는 2 보다 억제력이 낮다. GT 를 첨가하면, 폴레이트 수송 시스템을 통한 약물 흡수(및 이에 따라 독성)가 방해되나, 이러한 효과는 팔미테이트 기를 첨가함으로써 일부 억제할 수 있다고 가정할 수 있다. 팔미테이트-접합체는 세포내이입에 의해 세포에 들어가는 것으로 보인다. MTX-γ-GT는 팔미토일화된 접합체보다 세포에 대한 독성이 적으나, 생화학적 검정(하기 참조)에서 DHFR에 대한 억제력이 더 크다. 이를 통하여, MTX-γ-GT 와 MTX-γ-GTP1 또는 2를 구분짓는 것은 직접적인 효소 억제보다는 수송 메카니즘이라는 것을 알 수 있다.

α-COOH 변형이 -γ-COOH 변형보다 세포 흡수를 더 큰 범위로 감소시킨다는 것은 널리 보고되어 있다. 본 출원인이 얻어낸 결과는 이와 일치한다. MTX-α-GT 및 MTX-GTP2는 모두 MTX-γ-GT 및 MTX-γ-GTP2 각각보다 독성이 훨씬 적다.

전체적으로, 본 출원인이 얻어낸 결과는 문헌과 일치한다. 관련된 참조문헌 중 일부를 하기한다.:

Rosowskyet al.; J. Med. Chem. (1984) 27, 600-604

Rosowskyet al.; J. Med. Chem. (1984) 27, 605-609

Rosowskyet al.; J. Med. Chem. (1981) 24, 1450-1455

Falet al.(1991) Biochem. 30, 4573-4580.

래트의 보강제-유도된 관절염 모델에서의 MTX 및 MTX-γ-GT 시험

바곳(Baggott) 및 공동작업자는, 루이스 래트의 보강제-유도된 관절염의 투여량-의존성 억제를 위하여 40, 15 및 5μmol/kg의 MTX 투여량을 제시하였다.

다크 아구티(Dark Agouti)(DA) 래트를 사용한 유사한 모델을 MTX-γ-GT 효과를 시험하기 위하여 사용하였다.

방법:

DA 래트의 꼬리 기부로 프룬드 완전 보강제(Freund's Complete Adjuvant)를 정맥 주사하였다. 치료하지 않은 래트에서 10-12일 후 관절염이 발생하였다. 래트를 PBS(대조구) 또는 PBS 중의 MTX 또는 MTX-γ-GT의 몰 당량 투여량으로 6일째 튜브롤 통해 한 번 경구 치료하였다; 치료 그룹 당 래트 6마리. 관절염에 대한 치료 효과를 체중 및 관절염의 증상(확립되어 있는 스코어링 시스템을 사용하여 정량)을 평가함으로써 매일 모니터하였다. 이는 각 발에 대하여 0 내지 4의 점수를 부여하는 것을 포함한다(0=관절염 또는 염증의 증상이 없음, 4=발이 전체적으로 부풀어오름). 이론적 최대 스코어는 16이지만, 12 이상의 스코어가 관찰되면 래트를 안락사시켰다. 경미한 관절염이 나타났던 치료된 래트에서, 관절염이 억제 또는 방지되기 보다는 지연되었는지를 결정하기 위하여 치료 기간 이후에도 질병을 추적하였다.

결과:

6일째 MTX 및 MTX-γ-GT의 일회 투여한 결과를 도 2의 A 내지 F로 도시한다.

결론:

MTX 및 MTX-γ-GT는 염증 발생을 2 내지 4일 지연시키는 데 효과적이었다. 시험한 투여량의 실험적 오차 내에서 두 화합물의 효과는 구별되지 않았다. DTH 래트의 발바닥으로부터, MTX-γ-GTP1도 이 모델에서 염증 발생을 지연시킬 수 있는 것으로 기대되었다. MTX-γ-GTP3은 DTH 검정에서 음성이었으나, 인간 SPA 임상시험에서 건선 치료시 활성을 보인다(하기 참조). 래트의 보강제-유도된 관절염에 미치는 이의 효과는 측정되지 않은 상태이다.

MTX-트리스 접합체의 독성

독성을 구체적으로 조사하는 실험은 하지 않았으나, MTX-트리스 접합체가 MTX에 비하여 감소된 전신적 독성을 갖는다는 것을 나타내는 생물학적 활성 검사 실험동안 이를 관찰하였다.

하기 관찰 결과가 주목되었다:

1. Skh-1 마우스 암놈에 비히클, MTX, MTX-γ-GTP2 또는 MTX-γ-GTP3을 연속 3일 이상 매일 국부 적용하여 UVB-유도된 홍반에 미치는 효과를 조사하는 실험을 하였다. 이 연구를 실시하는 동안, 6일간 독성 징후(탈수, 설사 및 식욕부진)를 평가한 후, GIT 독성의 전체 징후(확장된 유체-충전된 장)를 검시를 통하여 평가하였다. MTX-γ-GTP2 또는 MTX-γ-GTP3는 MTX보다 독성이 훨씬 낮은 것으로 나타났으며, 그 결과는 하기 표에 나타낸다.

Skh-1 무모 마우스에 국부 적용한 독성 결과

치료		GIT 전체 독성 징후	치사
비히클MTXMTX-γ-GTP2MTX-γ-GTP3	4mg/kg19.6mg/kg111.7mg/kg1	0/245/240/240/14	0/248/240/240/14
1MTX, MTX-γ-GTP2 및 MTX-γ-GTP3 동몰량을 사용하였다. 이들은 오일/물 크림: 에틸 올레이트(4:1)로 조성하였고, 0.1ml를 각 마우스에 적용하였다. GIT=위장관

MTX 치료된 많은 마우스에서, 독성의 임상 징후 및 검시 시에 확장된 유체-충전된 장을 갖는 경우가 지배적이었다. 이러한 장의 조직학적 검사를 통하여, 뚜렷한 미소융모 손상 및 괴사 점막 세포가 나타났다. 대조적으로, MTX-γ-GTP2 또는 MTX-γ-GTP3을 투여한 마우스에서는 GIT 손상 및 치사가 전혀 관찰되지 않았다. 모든 마우스에서 간과 신장은 정상으로 나타났다.

2. 지연형 과민증 검정 연구에서, 코펜하겐 래트에 두유, MTX(0.5mg) 또는동몰량의 MTX-γ-GT, MTX-γ-GTP1 또는 MTX-γ-GTP3을 5일동안 매일 경구 투여하고, 동시에 DNFB를 국부 적용하여 감작시켰다. DNFB 자극 및 24시간 후의 검시에 이어, 래트의 대표 그룹의 장에 대하여 전체 변화를 조사하고, 조직학 연구를 위해 시료를 수집하였다.

MTX-치료된 래트(n=7)는 모두 위와 장이 우유같은 유체로 충전되어 확장되었다. 이러한 GIT 시료의 조직학 연구를 통하여, 융모가 두꺼워진 염증 있는 핵을 가지며, 상피가 분리되어 떨어지고, 점막이 괴사되는 것으로 밝혀졌다. 이는 경미 내지 심각한 손상을 나타낸다. MTX-γ-GT(n=9)를 투여한 래트는, 한마리가 확장된 유체-충전 장을 가진 것을 제외하고는 정상적인 GIT를 가졌다. MTX-γ-GTP1(n=14) 및 MTX-γ-GTP3(n=14) 치료 그룹에 대한 GIT의 육안 검사에서, 총체적인 비정상은나타나지 않았다. MTX-트리스 접합체를 투여한 래트의 GIT는 조직병리학적으로 감소가 관찰되었다.

3. 래트의 보강제-유도된 관절염에 대한 MTX 또는 MTX-γ-GT의 효과를 조사하는 연구에서, 관찰된 사항은 하기와 같다.:

a) MTX 또는 MTX-γ-GT의 일회 경구 투여(40umole/kg) 후, 1-2일 후에 MTX 그룹에서 설사가 관찰되었다. 이는 MTX-γ-GT 및 비히클만의 그룹에서는 나타나지 않았다.

b) 2차 실험에서, 래트에 3일의 간격을 두고 3회 경구 투여하였다. MTX(5umole/kg)로 치료한 래트에서 독성 부작용(곤두선 털 및 운동실조)이 명백하였다. 결과적으로, 이러한 래트들은 원래 계획한 것보다 일찍 치사시켰다. 부검에서 GIT에 뚜렷한 변화를 보였고, 특히 소장이 팽창 및 수축하였다. 조직학 연구에 따르면, 뚜렷한 소와 과형성이 나타났고, 공장 및 회장 점막에서 융모 구조가 손실되었다. 부위 중 일부에서는, 소와 및 융모 상피가 모두 손실되었다. 이들 래트의 장간막 림프절도 확대되었다. 비히클- 및 MTX-γ-GT-치료 그룹에서는 이들 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 이들 MTX 치료 래트의 말초 혈액 시료는 호중구감소증에 크게 기인하여 심한 류코파에니아(leucopaenia)(약 2x10⁹/L)가 나타났다. 비히클 대조구 및 MTX-γ-GT 그룹에서의 백혈구 수는 다르지 않았다(약 30x10⁹/L).

결론:

모든 TMX-트리스 접합체는 TMX에 비해 독성이 감소하였다. 세포 내 독성 실험(상기 참조)에서 이와 유사한 결과를 관찰하였다.

마우스에서의 MTX-트리스 접합체의 분포

도입:

MTX는 건선 및 류머티즘성 관절염과 같은 자가 면역 성분을 갖는 질병에 효과적인 경구 치료제이다. 그러나, 이를 장기간 사용하면 간 소모증, 괴사 및 간경변의 위험이 있어 계속적으로 간을 검사해야 한다. MTX는 또한 위장 염증, 신장 독성 및 유산을 유도한다. 본 출원인은 MTX-트리스 접합체가 생물학적으로 활성이 있고, 시험관 내 및 생체 외에서 독성이 적다는 것을 증명하였다(상기 참조). 또한, 액체 신틸레이션 및 전신 오토라디오그래피를 사용하여, 마우스에서의 국부, 경구(p/o) 및 정맥내(i/v) 투여된, 방사성 동위원소로 표지된 MTX-트리스 접합체 및 MTX의 분포를 조사하였다. 이는, MTX-트리스 접합체(또는 이의 분해 생성물)가 MTX 독성이 걱정되는 기관에서 축척되는지, 또한 이의 배설 패턴이 MTX의 배설 패턴과 다른지를 알아보기 위한 것이었다. 결과를 하기에 요약한다.

결과:

1. [¹⁴C]-MTX-γ-GT 투여 마우스(i/v 및 경구)에서, 대변으로 높은 수준의 방사성활성이 배설되었고, [¹⁴C]-MTX 투여된 마우스에서와 유사한 양이 소변으로 배설되는 것으로 증명되었다. [¹⁴C]의 조직 분포는 유사하였으나, [¹⁴C]-MTX-γ-GT 투여 마우스에서 보다 낮은 수준이었다. 이는, MTX-γ-GT가 MTX보다 큰 간 클리어란스를 갖는다는 것을 제시한다.

2. 국부 적용 후, MTX-γ-GTP3의 방사성 동위원소 표지는 MTX 치료 마우스에서보다 장기간동안 피부 상피에서 검출되었다. 이는, MTX-γ-GTP3이 MTX보다 많이 피부에 보유된다는 것을 나타낸다. 또한 경구 [¹⁴C]-MTX-γ-GTP1 및 [³H]-MTX-γ-GTP3 투여 마우스에서 피부에 방사성활성이 존재한다. 이는, 항-건선 치료제로서의 사용 가능성을 크게 암시할 수 있다.

3. 경구 투여 후, 방사성 동위원소 표지된 MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3 은 모두, MTX 독성이 걱정되는 기관에서 그 수가 크게 감소되는 것으로 나타났다. 이는, 흡수가 감소되고 간 배설(즉, 장간 순환)이 증가되었음을 나타낸다. 그러나, 이들 접합체가 일단 순환하게 되면(즉, i/v 투여 후) 간, 비장 및 폐에 축척되는 것으로 보인다. 이는 트리스를 통하여 지방성 아실기에 접합한 후 약물을 특정 기관에 표적화하는 가능성을 제공한다.

4. [¹⁴C]MTX로부터의 방사성 동위원소 표지는 주로 소변으로 배설되고, 대변으로는 이보다 적게 배설된다. 이와 달리, [¹⁴C]-MTX-γ-GTP1 및 [¹⁴C]-MTX-γ-GTP3은 i/v 송달되는 경우, 방사성 동위원소 표지가 주로 간 배설을 통하여 대변으로 제거되고, 소변으로 검출되는 수준은 매우 낮다.

토론:

경구 투여시 MTX-트리스 접합체는 MTX 독성이 걱정되는 기관에서 MTX보다 적은 범위로 축척되는데, 이들이 간 클리어란스가 크거나(MTX-γ-GT), 시험된 조성물에서 흡수 수준이 낮기 때문이다(MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3). 분포 패턴으로 이 접합체에서 관찰되는 독성 부작용의 감소를 일부 설명할 수 있다(상기 독성 부분을 참조). 세포 흡수 및 폴리글루타밀화의 감소도 이에 기여하는 것으로 보인다(상기 세포독성 부분 참조). MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3는 i/v 투여시 간, 폐 및 비장에 축척될 수 있으나, 독성 부작용을 평가하지는 못하였다. 그러나, MTX 독성의 원인으로 널리 알려진 메카니즘인 이러한 접합체의 폴리글루타밀화는 일어나지 않을 것으로 보인다.

MTX-γ-GTP1 및 MTX-γ-GTP3는 경구 송달 후 피부에서 발견되었다. 이는, 건선 치료제로서의 이의 사용 가능성을 암시할 수 있다.

건선의 국부 치료제로서의 MTX-γ-GTP3의 임상 시험

건선은 유럽인의 1-2%에게 발생하는 피부 상태이다. 이는 병인이 알려지지 않고 예후가 어려운 염증 및 표피 과증식 질환이다.

경구 투여시 MTX는 심한 건선을 완화시키는 효과적인 치료제이다. 그러나, 이를 사용하면 즉각적으로는 위장의 문제와 장기간으로는 간 독성이 발생한다. 임상 반응 전에 약 6주동안의 치료가 필요하다.

국부-적용된 MTX는 감염 부위에 약물을 제공하며, 부작용이 거의 없는 것으로 주장되었다. 이는 시험된 바 있으나(Weinstein et al., 1989), 총체적인 결과는 그리 좋지 못하였는데, 피부 보유력이 좋지 못하기 때문인 것 같다. 본 출원인이 관찰한 바에 따르면, MTX-γ-GTP3은 MTX의 생물학적 활성뿐만 아니라 피부 보유력도 증가하는 것으로 간주되었다.

예비 임상 연구

예비 임상 연구에 따르면, 국부-적용된 MTX-γ-GTP3는 건선의 치료에 적합한 생물학적 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이는, 무모 마우스의 UVB-유도된 표피 과증식을 감소시킴에 있어서 MTX와 동등하거나 더 나은 활성을 가지고(도 3), 몰렉 등[Molek et al.(Brit J Derm(1983) 108:25-31)]의 방법으로 측정되는 바와 같이 UVB-유도된 표피 DNA 합성을 억제하였다(도 4). MTX-γ-GTP2의 내피 주사는 B16 흑색종의 성장을 감소시킴에 있어서 MTX보다 더 효과적이었다(USP 5,952,499). 분포 연구(상기)에 따르면, 국부-적용 MTX-γ-GTP3는 무모 마우스의 표피에 MTX보다 장기간동안 보유되는 것으로 나타난다. 국부 또는 경구 투여된 MTX-γ-GTP3는 MTX보다 무모 마우스에 대한 독성이 적다(상기 참조).

이러한 긍정적인 예비-임상 결과와 건선에 대한 우수한 동물 모델이 부족함으로 인해, 인간에게 국부적 MTX-γ-GTP3의 개념 입증 시험(proof-of-concept trial)을 하게 되었다.

임상 연구 설계

스몰 플라크 어세이(Small Plaque Assay; SPA)로 두 주에 걸쳐 화합물의 항-건선 능력을 평가한다. 이 검정에서는, 폐색 하에 단일 플라크 상에서 6가지 화합물을 동시에 시험한다. 각 플라크 상의 시험 화합물의 위치는 임의로 하여, 평가가 편중되지 않고 약물의 상호 작용 효과가 없도록 한다. 11명의 환자를 연구하였다.

치료:

0.5% MTX-γ-GTP3 용액(시험 조성물)

1.0% MTX-γ-GTP3 용액(시험 조성물)

MTX-γ-GTP3 비히클(음성 대조구)

0.5% MTX 용액(참조 조성물)

MTX 비히클(음성 대조구)

0.5% 베타메타손 발러레이트(양성 대조구)

(MTX-γ-GTP3 용액의 모든 농도는 이의 MTX 함량에 대하여 나타낸다.)

계획

일	치료	평가
0136810131529	2% 살리실산약물 적용약물 적용약물 적용약물 적용약물 적용약물 적용	임상& 조직학임상임상& 조직학임상

파라미터

임상 반응이 명백하기까지 약 6주의 경구 MTX 치료가 필요하다. 따라서, SPA의 기간인 두 주 지속기간 (윤리적 이유로 제한) 내에 국부 MTX-γ-GTP3의 임상 결과가 나타날 것 같지 않았다. 그러나, 활성제를 사용하여 건선 치료에 상응하는 초기의 조직학적 변화가 기대되었다. 따라서, 임상 평가 뿐 아니라 임상병리학적 및 면역조직학적 표지를 하기와 같이 평가하였다.

·임상

0, 8, 15 및 29일에 침윤 및 홍반

·조직병리학

부전각화증 침윤

과립증(Granularity) 극세포(증)

혈관 변화 표피 두께

유두종증

·면역조직학

인볼루크린(involucrin) ICAM-1

필라그린(filaggrin) Ki-67⁺케라티노사이트

CD4⁺및 CD8⁺T-세포

환자 선택

포함 기준

제외 기준

어떤 민족 그룹, 18 내지 70세의 연령의 남성. 비가임 상태의 여성도 가능.6개월 이상의 만성 플라크 형태의 일반적인 건선.시험의 목적 및 위험을 이해할 수 있으며, 전 기간동안 모든 평가에 기꺼이 참여하기로하며 서면의 정보제공 동의서를 받아 날인함.요구되는 플라크 특징:·체간 또는 수족에; 만곡부 영역 아님.·적어도 5.5 x 8.3 cm 영역.·동종의 외형(홍반 및 침윤).·심각한 홍반 & 침윤

농포성 건선, 홍피성 건선,역 건선 및/또는 활성 건선관절염.간염 또는 AIDS를 포함한, 심각한 병발성 질환 또는 치료가 필요한 활성 감염.HIV 양성으로 알려진 경우.실험 약물 성분에 과민성으로 알려진 경우.병력 및/또는 현재 전신 악성인 경우.다른 연구 약제 실험에 동시 참여 또는 실험 시작 4주 전에 연구 약제를 투여받은 경우.실험 시작 4주 전에 임의의 전신 항-건선 치료를 받은 경우.실험 시작 2주 전에 실험된 플라크에 대해 임의의 항-건선 치료를 받은 경우.실험과 관련하여 반대를 가리키는 실험값.연구자와의 관계를 무효화할 수 있는 어떤 형태의 물질 남용, 정신의학적 질환 또는 상태.간경화 또는 다른 간 질환을 가진 것으로 알려진 경우.MTX와 상호작용할 수 있는 약제를 취한 환자.계산된 크레아티닌 클리어런스가 <30ml/min인 환자.

결과:

임상

양성 대조구인 베타메타손은 실험 부위의 임상적 외관을 현저히 개선시켰고, 이것은 실험방법론이 정확했음을 말해준다. 2주 동안 MTX-γ-GTP3 또는 MTX 시험 지점 부위에서 거의 또는 전혀 변화가 관찰되지 않았다. 이것은 경구 MTX의 항-건선 활성에 필요한 시간이 6주였기 때문에 예상치 못한 것이었다. 어떤 실험 화합물에서도 심각한 부작용 또는 국부적 염증이 관찰되지 않았다.

조직학

통계적으로 베타메타손은 각화 증식증 및 인볼루크린을 제외한 모든 파라미터에서 항-건선 활성을 나타내었다.

MTX-γ-GTP3 치료는 환자 11명 중 5명에게서 필라그린 발현(말단 표피 분화의 표지), 과립상(건선에서 과립층이 없거나 불완전함) 및 부전각화증(표피 각질 세포의 불완전 형성)에 긍정적인 효과를 주었다.

ㆍ필라그린

실험한 모든 면역조직학적 표지 중에서, 필라그린이 실험 약제 작용의 가장 강력한 지표로 입증되었다. 환자에게서 필라그린 결과의 조사는 베타메타손에 대한 반응과 MTX-γ-GTP3 용액에 대한 반응 사이의 관계를 나타내었다(도 5). MTX-γ-GTP3 용액은 1% MTX-γ-GTP3 및 0.5% MTX가 거의 동등한 결과를 나타낸 것에 반해 0.5%의 농도에서 가장 우수한 필라그린 반응을 나타내었다. 비히클에 비해 0.5% MTX-γ-GTP3 용액을 사용한 과립층에서 필라그린 발현에 있어서 그룹 간에 차이가 있었다. MTX에 대한 반응은 유사하였다(도 6).

ㆍ과립상:부전각화증 비

부전각화증에 대한 과립상의 비를 계산하여 치료 지표를 만들었다-비의 증가는 건선 분해 경향을 나타낸다. 건선의 초기 분해와 일관된 과립상 및 부전각화증에서 조직병리학적 변화는 0.05% 베타메타손 발러레이트 크림(환자 11명 중 10명) 및 1.0% MTX-γ-GTP3 용액(환자 11명 중 5명)에서 명백하다-도 7 a) 및 b). 0.5% MTX-γ-GTP3 및 TMX로 치료한 결과 과립상:부전각화증 비에 거의 반응이 없었다(각각 1 및 2명의 환자).

임상 연구 결과

조직병리학(과립상 및 부전각화증) 및 케라티노사이트 성숙 표지인 필라그린으로 판단한 바와 같이, MTX-γ-GTP3는 그의 비히클에 비해 다수의 환자에게서 항-건선 활성을 나타내었다. 이것은 MTX에 비해 비교적 낮은 독성을 가지기 때문에 난치성 건선의 국부적 치료용 치료제로서 가능성이 있다.

당해 기술분야의 기술자들은 광범위하게 기재된 바와 같이 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않는 구체적인 실시형태에서 나타낸 바와 같이 본 발명에는 다수의 변화 및/또는 변형이 가능하다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 모든 점에서 한정이 아닌 실례로 고려된다.

Claims (20)

1. 화학식 I의 화합물:

   [화학식 I]

   (상기 식에서, M은 메토트렉세이트 또는 이의 유사체이고;

   A=H, CX₂-O-R₂또는 할로겐;

   B=H, CX₂-O-R₃또는 할로겐;

   X는 독립적으로 H 또는 할로겐이고;

   n은 0 또는 1 이상이고;

   Y는 연결기이고, n이 1보다 클 때, 각 Y는 동일하거나 다르고;

   R₁, R₂및 R₃는 동일하거나 다르고, 수소, 치환 또는 비치환 메틸, 에틸, 포화 또는 불포화 지방성 아실기이고,

   여기서, n이 0 또는 1이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃인 경우에 R₁, R₂및 R₃는 지방성 아실기로부터 선택되지 않고;

   n이 2 이상이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃이고, R₁, R₂및 R₃중 하나 이상이 지방성 아실기인 경우에 -[Y]_n-은 AA가 아미노산인 -(AA)_n- 또는 -Y-(AA)_n-1-과 다르다)
2. 제 1항에 있어서,

   상기 M이 이의 γ카르복시기를 통해 부착되는 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 Y가

   a) 카르복시기 및 아미노기를 가진 화합물;

   b) 아미노기 및 술폰산기를 가진 화합물;

   c) 히드록시기 및 카르복시기를 가진 화합물;

   d) 히드록시기 및 술폰산기를 가진 화합물;

   e) 히드록시기 및 반응성 할라이드기를 가진 화합물;

   f) 할라이드기 및 카르복시기를 가진 화합물;

   g) 두 개의 반응성 할라이드기를 가진 화합물;

   h) 히드록시기 및 알데히드기를 가진 화합물; 및

   i) 알킬렌 옥사이드

   로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 -[Y]_n-이 AA 또는 각각의 AA가 아미노산인 -[AA]_n-인 것을 특징으로 하는 화합물.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 n이 1이고, AA가 글리신인 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 4항에 있어서,

   상기 n이 2이고, AA가 글리신인 것을 특징으로 하는 화합물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 A 및 B가 CH₂OH이고, R₁이 H인 것을 특징으로 하는 화합물.
8. 메토트렉세이트-γ-글리신 트리스
9. 메토트렉세이트-γ-글리신 글리신 트리스
10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석액을 포함하는 약제학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 조성물이 적당한 경구 투여 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
12. 제 10항에 있어서,

    상기 조성물이 비경구 투여에 적합한 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
13. 화학식 I에 따른 화합물:

    [화학식 I]

    (상기 식에서, M은 메토트렉세이트 또는 이의 유사체;

    A=H, CX₂-O-R₂또는 할로겐;

    B=H, CX₂-O-R₃또는 할로겐;

    X는 독립적으로 H 또는 할로겐이고;

    n은 0 또는 1 이상이고;

    Y는 연결기이고, n이 1보다 클 때, 각 Y는 동일하거나 다르고;

    R₁, R₂및 R₃는 동일하거나 다르고, 수소, 치환 또는 비치환 메틸, 에틸, 포화 또는 불포화 지방성 아실기이고,

    여기서, n이 0 또는 1이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃인 경우에 R₁, R₂및 R₃는 지방성 아실기로부터 선택되지 않고;

    n이 2 이상이고, A가 CH₂-O-R₂및/또는 B가 CH₂-O-R₃이고, R₁, R₂및 R₃중 하나 이상이 지방성 아실기인 경우에 -[Y]_n-은 AA가 아미노산인 -(AA)_n- 또는 -Y-(AA)_n-1-과 다르다)

    을 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 암 또는 자가면역 성분을 가진 질환의 치료방법.
14. 제 13항에 있어서,

    상기 M이 이의 γ카르복시기를 통해 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,

    상기 치료가 자가면역 성분을 가진 질환의 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 13항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서,

    상기 자가면역 성분을 가진 질환이 건선, 류머티즘성 관절염, 장염 질환 및 크론병으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서,

    상기 질환이 건선인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 16항에 있어서,

    상기 질환이 류머티즘성 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 13항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서,

    상기 화학식 I의 화합물이 경구 또는 비경구 투여로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 13항 내지 제 19항 중의 어느 한 항에 있어서,

    상기 화학식 I의 화합물이 메토트렉세이트-γ-글리신-트리스인 것을 특징으로 하는 방법.