CN1333834A - 植物转化载体 - Google Patents

Abstract

本发明是关于应用农杆菌得到的植物转化载体,其中为了提高载体边缘序列被农杆菌Vir蛋白识别的可能性,从而降低将除T－DNA以外的其它DNA转移至植物染色体的可能性,对农杆菌进行了修饰。更具体地,上述载体是用在转化植物方面,该载体有左右边缘序列、一个T－DNA序列和一个复制起始,其中所述边缘序列能够被农杆菌的Vir蛋白识别,所述T－DNA位于这些边缘序列之间并且其中可插入将被转移至植物的基因,复制起始能够使载体在细菌中复制,且该载体的特点是有多个左边缘序列。

Description

植物转化载体

技术领域

本发明涉及植物转化载体，更具体为可有效进行农杆菌介导的植物转化的载体。本发明还涉及用这些载体进行植物转化的方法。本发明对产生可能作为食品的转基因植物特别有用。

背景

很早以前就知道农杆菌(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))是一种土壤细菌，这种土壤细菌能够导致许多双子叶植物发生肿根病(根癌)。在1970’s，人们就发现根癌农杆菌的Ti质粒与致病性有关，T-DNA作为Ti质粒的一部分可整合在植物基因组中。后来，人们又发现T-DNA包含产生根肿病所必须的一些激素(细胞分裂素和植物生长素)合成基因，虽然这些基因可从细菌分离得到，但它们在植物上也有表达。一组位于Ti质粒毒力区(Vir区)的基因对于T-DNA的切除和转移到植物体中是必须的，此外，位于T-DNA两端的边缘序列对于切除是必须的，它们分别被称为右边缘序列和左边缘序列。发根植物单胞菌是另外一种土壤农杆菌，它也有一个与Ri质粒有关联的相似的系统。

更具体而言，根据位于Vir区的基因生产的蛋白质通过识别左右边缘序列将位于边缘序列之间的T-DNA整合到植物基因组。该功能为利用已带有外来基因的T-DNA转化植物提供了基础。因此，促进了农杆菌介导的植物转化技术的发展。

最近，有一些报告已经描述这样的情况，即在一些特定植物中，有时观察到T-DNA未在边缘序列处被切除，因此，T-DNA能够同其临近区域一同转移到植物染色体中(Ramanathan等，植物分子生物学28，1149-1154(1995)，Kononov等，植物学报，11，945～957(1997))。如果是一个DNA片段，而不是一个T-DNA片段被一起转移，产生的转基因植物将被怀疑带有非希望的特性，当用这些转基因植物制作食品时，可能导致公众对这些食品的接受能力产生不良影响。因此，发明一种能够保证根癌农杆菌中不需要的、非T-DNA序列不被转移到植物染色体的方法是必要的。

本发明人提出农杆菌的Vir蛋白不能识别边缘序列，这能解释非T-DNA和T-DNA一起转移到植物染色体中的原因。到目前为止，还没有发现哪种载体能够抑制或减少非T-DNA的转移，从而解决上面所述的问题。

根据上面的推测，本发明人进行了大量的研究，以求构建可用于农杆菌介导的植物转化的载体。为了减少非T-DNA片段转移到植物染色体的可能性，本发明人对载体进行了修饰，以求增加农杆菌Vir蛋白识别边缘序列的有效性。结果发现当转移载体中存在两个边缘序列时，通过提供较大多数的左边缘序列，能够使非T-DNAs被整合的可能性降低。在这个发现的基础上完成了本发明。

发明概述

本发明提供了基于农杆菌功能的植物转化载体，其中，左边缘序列被修饰，以减少任何非T-DNA片段整合到植物染色体的可能性。更具体是该发明提供了一种植物转化载体，该载体包含能够被根癌农杆菌的Vir蛋白识别的右边缘序列和左边缘序列，位于这些边缘序列之间的可插入待转移之基因的T-DNA片段，能够使载体在细菌(例如，根癌农杆菌和可扩增载体的细菌)中复制的复制起始，其中，为了减少任何非T-DNA序列被整合到植物染色体的可能性，所说的左边缘序列发生改变。

附图简述

图1显示了用在实施例中的载体pSLB0；这个载体是通过对载体pSB11进行修饰然后在限制酶StuI位点插入另一个表达盒得到的，所述修饰使载体在T-DNA区出现一个表达盒，从而可在泛素启动子和泛素内含子的控制下表达潮霉素抗性基因；所插入的另一表达盒可表达GUS基因，该基因含有在泛素启动子控制下的过氧化氢酶内含子。

附图2显示了载体pSLB0，pSLB2和pSLB3的左边缘序列(以下有时简称LB)的邻近区图谱。为了制备载体pSLB2和pSLB3，将含有2个或3个左边缘序列的合成的DNA片段插入到pSLB0上LB和GUS表达盒之间的PvuII限制性位点。在载体pSLB3中，2个左边缘序列通过该合成DNA片段被插入(所插入的左边缘序列下文称sLB)，获得总共3个LB；在载体pSLB3中，3个sLB通过该合成DNA片段被插入，获得总共4个LB。

发明详述

(1)载体的制备

本发明的载体修饰了左边缘序列，以便能够减少不需要的DNA序列，即非T-DNA序列，整合到植物染色体中的可能性。在一个优选实施方案中，本发明提供具有已修饰的左边缘序列的载体，其包含一个以上能够被Vir蛋白识别的DNA序列(例如，一个已知的左边缘序列)。

根据已知的边缘序列，应用各种已知的方法可以制备包括一个以上左边缘序列的DNA片段，例如，可以合成一个具有同样序列的单链DNA分子作为包含于现有Ti质粒中的左边缘序列，通过这条单链DNA制备双链的DNA分子，如果需要，可以将2个或更多个这样的双链DNA分子连接在一起。然后将获得的DNA片段插入植物转化载体中合适的限制性位点处，该位点位于T-DNA区域下游已有的左边缘序列的上游或下游附近。通过这种方法，本发明的载体能够容易地被制备。

通过改变其左边缘序列而制备本发明载体的植物转化载体应该至少有一个右边缘序列和一个左边缘序列，一个位于所述左右边缘序列之间的T-DNA序列和一个复制起始，所述边缘序列均能够被Vir蛋白识别，所述T-DNA序列能够插入一个待植入植物的基因，而复制起始能够在细菌(例如，大肠杆菌)中进行载体的复制。优选植物转化载体有一个能够在根癌农杆菌中操作复制的复制起始。

只要上述条件得到满足，就能够改变各种载体的左边缘序列，例如，可改变在下述基于根癌农杆菌的植物转化法中使用的各种载体。

(i)使一个小的中间克隆载体与一个受体Ti质粒进行同源重组，以产生杂合型Ti质粒载体，植物用含有该杂合型Ti质粒载体的农杆菌感染，其中所述小的中间克隆载体含有左右边缘序列以及插入了一个外源基因的T-DNA，所述受体Ti质粒含有vir区；

(ii)将一个外源基因插入不含vir区的小型Ti质粒(该质粒通常称为小型质粒或微型Ti质粒，并能在多种细菌中复制)中T-DNA区，将该质粒导入带有含vir区但无T-DNA的质粒的农杆菌中，植物用含有所述两种质粒的农杆菌感染；

(iii)使一个小的中间克隆载体与一个受体Ti质粒进行同源重组，以产生杂合型Ti质粒载体，将该杂合型Ti质粒载体导入含有(全长)vir区但已导入了T-DNA缺陷型质粒的农杆菌中，植物用含有这两种质粒载体的农杆菌感染。其中所述小的中间克隆载体含有左右边缘序列以及插入了一个外源基因的T-DNA，所述受体Ti质粒含有vir区的一部分(即，缺乏全长vir区的一部分的vir基因)。这些方法中所用的各种载体可对其左边缘序列进行修饰。小型Ti质粒带有左边缘序列修饰后易于操作，如修饰T-DNA中的外源基因，因此它们是本发明载体的优选实施方案。这类小型Ti质粒包括pBI101和pBI102 (均来自CLONTECH)，以及以下实施例中使用的pSB11。

本发明的概念不仅适合于Ti质粒，而且也适合于Ri质粒。

本发明的载体在T-DNA序列上包含一个可用于筛选转化体的标记基因，如抗生素抗性基因或发光基因。具体而言，常用的标记基因可在常规方法中使用，它们包括抗生素抗性基因如赋予对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素和壮观霉素抗性的基因，发光基因如荧观光素霉基因、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因。除这些基因外，所述载体还可在T-DNA序列以外含有另一个标记基因，优选在左边缘序列下游。该位置的标记基因可用于评价修饰的左边缘序列的效力。

本说明书中术语“复制起始”表示一个特殊的DNA区域，复制反应最初从这儿开始，该区常称为Ori。

(2)转化

为了应用本发明的载体，将用于转化的外来基因插入T-DNA区。该外来基因通常包含能在宿主植物中操作的启动子和连接于该启动子下游的结构基因(其使该植物被赋予新的特征)。必要时，可将多个基因连接在一起，此外或另选，在启动子与结构基因下游之间，在插入T-DNA区之前，先插入一个能增强表达效力的序列。

在导入目标植物之前，先将携有所述外来基因的本发明载体导入能感染该植物的农杆菌(例如根癌农杆菌)中。为此，可利用本领域技术人员熟知的各种方法。例如可通过接合将所述载体转移到农杆菌中；如果可能，可用含有所述外来基因的本发明载体直接转化该农杆菌。

传统的技术可用于使含有本发明载体的农杆菌感染植物，所述常规方法有：在植物体某一部位造成损伤并用所述细菌感染该部位、用所述细菌感染愈伤组织、使原生质粒与所述细菌共培养，使叶片组织与所述细菌共培养。应用这些方法获得的转化细胞可用适当的筛选标记进行筛选或通过分析它们是否表达所需特性而筛选。这种转化细胞可通过现有技术进一步分化以产生重组植物体。

为了使含有外来基因的T-DNA整合至植物的染色体DNA中，必需vir区。所述vir区可由携有所述外来基因的载体或另一载体提供。

用本发明载体转化的植物细胞可通过现有技术进一步分化以产生重组植物体。转化的植物可用适当的筛选标记进行筛选或通过分析它们是否表达所需特性而筛选。

可用本领域技术人员熟知的各种方法确定：所需转化的非必需DNA序列是否已整合至植物染色体。例如，寡核苷酸引物是根据载体上边缘序列以外的DNA序列合成的，应用这些引物，可以进行PCR以分析已转化的植物的染色体DNA序列。如果是用所含标记基因不在T-DNA序列中的载体进行的转化，可通过分析该标记基因的表达与否来分析。

本发明载体的特征在于，其能降低所需转化的非必需DNA序列发生整合的可能性。“降低整合的可能性”指，与用左边缘序列未修饰的载体进行的转化相比，所述非必需DNA序列整合至宿主染色体的频率较低，或所整合的非必需序列长度较短，或不发生此类整合；此外或另选，与左边缘序列未修饰的载体的应用相比，非所需的转化的频率较低，或非所需的转化较少，或不发生此类转化。“所需转化的非必需DNA序列”指所述载体中T-DNA序列以外的序列(即，非T-DNA)的片段或部分。无论它是否自身具有功能或编码多肽或蛋白均无关紧要。

各种植物都能够通过本发明的转化方法进行转化，它们包括单子叶植物如玉米、高粱、黑小麦、大麦、燕麦、黑麦、小麦、洋葱和水稻，和双子叶植物如大豆、苜蓿、烟草、油菜、向日葵、土豆、辣椒和西红柿。本发明的方法可降低所需转化的非必需DNA序列整合至植物染色体的可能性，应用这种转化方法获得的转基因植物携有非预期特性的可能性较小。因此，本发明的方法适于转化其它生物的食用植物，还适于对非T-DNA序列经农杆菌介导自之转化而转移至植物染色体的可能性特别关注的情况。本方法最适合于转化单子叶植物，尤其是水稻。

除非特别说明，本说明书中“植物”不仅包括植物个体，而且也包括它的种子(发芽的或未成熟的)、部分(叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊或者它们的片状物)、培养细胞、愈伤组织和原生质粒。

实施例

实施例1

(1)制备载体

质粒载体pSB11(Genebank录入号：AB027256，Komari等，植物学报10，165-174(1966))经修饰在T-DNA区中有一个经泛素启动子表达潮霉素抗性基因(HRP)的表达盒，和一个泛素内含子(Christensen等，植物分子生物学18，675-689(1992))，在该载体的StuI限制性识别位点还插入了受泛素启动子控制而表达的含有GUS基因的表达盒(Ohta等，植物细胞生理学，31，805-813(1990))。如此制备的质粒被命名为pSLB0(见图1和SEQ ID NO：1)。pSLB0的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据Ti质粒pTiAch5(Genebank录入号为K00548)的核苷酸序列，制备含一个左边缘序列(后文简称LB)的合成DNA及互补的合成DNA，使它们退火并经加工形成钝端，然后用于制备分别具有两个和三个LB序列的DNA片段。这两个合成DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将它们分别插入pSLB0中位于LB和GUS表达盒之间的限制性酶PvuII识别位点。如此制备了具有一个以上LB的载体。由合成的DNA导入2个LB(后文有时称sLB)后，所形成的共具有3个LB的载体被称为pSLB2。导入3个LB后，所形成的共具有4个LB的载体称为pSLB3(pSLB0、pSLB2和pSLB3在合成型LB之邻近区中的图谱见图2)。将这三个质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中，该菌预先已导入了一个质粒载体pSB1(Genebank录入号为AB027255，Komari等，植物学报，10，165-174(1996))。对它们进行下列测试。

(2)转化

根据Hiei等的方法(Hiei等，植物学报，6，271-282(1994))，来自水稻品种“晨光(Asanohikari)”未成熟胚胎的愈伤组织用LBA4404(pSLB0)，LBA4404(pSLB2)和LBA4404(pSLB3)转化。

(3)转化体中GUS基因表达的分析

实施例2所获潮霉素抗性植物的部分叶片用X-Gluc染色，以检查GUS基因的表达。用LBA4404(pSLB0)转化的340棵植株中有17株表达GUS基因，表明用仅携一个LB的传统载体所转化的植株中，仅5％导入了来自农杆菌非边缘序列的DNA。而另一方面，用LBA4404(pSLB2)和LBA4404(pSLB3)转化并表达GUS基因的植株数量随着合成LB数量的增加而减少(表1)。这表示合成的LB整合到所述载体后，降低了非左边缘序列的DNA转移到植物体的可能性。

(4)不表达GUS基因的植株中基因组DNA的分析

在(3)中的一些不表达GUS基因的植株中，非左边缘序列的DNA可能已经导入植物的染色体，但与泛素启动子的距离不够远，不能触发GUS基因的表达。为了在不表达GUS基因的每组植物中检验这种可能性，随机选取约60株转化体，提取基因组DNA进行PCR分析。用于PCR分析的引物应使得可以扩增从固有LB与合成LB之间某一位点到GUS基因中某一位点的区域。这些引物的序列见SEQ ID NO：4和5。

根据PCR分析的结果，用LBA4404(pSLB0)转化的67棵植株中有7棵(10.4％)显示DNA扩增，这说明使用仅携一个LB的传统载体时，农杆菌中非所需T-DNA的DNA以10.4％的频率整合至所得转化体的染色体中。相反，用携有合成LB的LBA4404(pSLB2)和LBA4404(pSLB3)转化的植株均未发生DNA扩增。

结果如表1和2所示。

                表1 GUS基因表达的分析载体    转化体数    表达GUS基因的植物的百分率pSLB0    340            5.0PSLB2    327            1.2PSLB3    370            0.8

        表2基因组DNA的分析载体    提取了DNA的植株数    经PCR扩增了DNA的植株数pSLB0    67                            7pSLB2    55                            0pSLB3    58                            0

如上所示，本发明减少了非边缘序列的DNA序列向植物染色体的整合，从而使得仅导入所需T-DNA的效力的增加成为可能。

前面对本发明的叙述主要集中在2个或更多个左边缘序列的应用，这些左边缘序列可以从同种或者不同种的农杆菌中获得。但应该强调：本发明的基本概念是建立在对植物转化载体中的左边缘序列进行修饰，使其被vir蛋白更有效地识别，从而减少任何非必需的非T-DNA序列向植物染色体的整合。因此，本发明包括携有能达到同样结果之修饰型左边缘序列的所有载体。除了上述实施例，修饰型左边缘序列还包括：(1)通过对已存在于相关质粒中的左边缘序列删除、取代、或添加一个或多个核苷酸，以使它们被Vir蛋白更有效地识别，而获得的序列；(2)通过对已存在于所述质粒中与已存在的左边缘序列相邻的任何序列删除、取代、或添加一个或多个碱基，以使它们被Vir蛋白更有效地识别，而获得的序列；(3)含有能被Vir蛋白识别的任何序列的多个拷贝的序列；及(4)(1)～(3)的任何组合。

Claims (7)

1.基于农杆菌功能的植物转化载体，其中对左边缘序列进行了修饰以减少任何非T-DNA片段被整合到植物染色体中的可能性。

2.一种植物转化载体，其包含能够被农杆菌Vir蛋白识别的右边缘序列和左边缘序列、位于这些边缘序列之间的可被待导入植物之基因插入的T-DNA区、以及能够在细菌中复制所述载体的复制起始，其中对左边缘序列进行了修饰以减少任何非T-DNA片段被整合到植物染色体中的可能性。

3.权利要求1或2的植物转化载体，其中对左边缘序列的修饰包含一个以上的左边缘序列。

4.权利要求1～3中任何一项的植物转化载体，其中T-DNA序列包含一个标记基因，它可以用于转化体的筛选。

5.权利要求1～4中任何一项的植物转化载体，其中复制起始能够在可进行载体扩增的细菌和农杆菌等细菌中进行载体复制。

6.一种转化植物的方法，其包括对携有权利要求1～5中任一项的载体的农杆菌宿主细胞加以利用。

7.根据权利要求6的方法得到的转化植物。

Images