WO2001025459A1 - Vecteurs de transformation de plantes - Google Patents

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WO2001025459A1
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dna
vector
plant
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agrobacterium
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PCT/JP1999/005386
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Yoshiki Kuraya
Toshihiko Komari
Yukoh Hiei
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Japan Tobacco Inc.
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a plant transformation vector. More specifically, the present invention relates to a vector useful in a method for transforming a plant using an agrobacterium. The present invention further relates to a method for transforming a plant using the vector of the present invention. The present invention is particularly useful for producing transgenic plants that can be consumed as food. Background art
  • T-DNA For excision of T-DNA and transmission to plants, genes present in the virulence region (Vir region) on the Ti plasmid are required, and both ends of T-DNA are necessary for excision of T-DNA. Requires a border array that exists in The border sequences at both ends of this T-DNA are called the right border sequence and the left border sequence, respectively.
  • Another bacterium belonging to the genus Agrobacterium, Agrobacteriinn rizogenes is, has a similar system using the Ri plasmid.
  • vir proteins a group of proteins created based on the genes present in the vir region recognize the left and right border sequences, and incorporate T-DNA between them into the plant genome. Based on this property, it has become possible to transform plants by inserting a foreign gene into T-DNA, and plant transformation by agrobacterium has been developed. However, in recent years, when transforming certain plants, the T-DNA may be transferred to the plant chromosome, including the portion outside the left border sequence, without cutting out the T-DNA at the border sequence. (Ramanathan et al. Plant Molecular Biology 28, 1149-1154 (1995), Kononov et al. Plant Journal 11, 945-957 (1997), etc.).
  • Unwanted DNA other than the T-DNA portion is transferred to the chromosome of the plant, and there is a concern that the transgenic plant created by the transformation may have unexpected traits. It can also have a significant effect on consumer perception (public access). For this reason, there is a need for a method for preventing unnecessary wakes other than the T-DNA portion in the agrobacterium from being transferred to the chromosome of the plant.
  • the reason that the DNA portion other than T-DNA is transferred to the chromosome of the plant may be that the vir proteins of agrobacterium do not recognize the border sequence. However, no vector has been developed to deal with such cases and to make DNA fragments other than the border sequence immobile or difficult to move.
  • the present invention relates to a vector used for plant transformation utilizing the function of agrobacterium, wherein DNA unnecessary for target transformation, that is, DNA other than T-DNA, Provided is a vector for transforming a plant, which has a left border sequence improved so as not to be easily inserted into a plant. More specifically, vir evening Right border sequence and left border sequence that can be recognized by the protein group, placed between those border sequences, and the gene to be introduced into the plant can be inserted
  • FIG. 1 shows the pSLBO vector used in the examples.
  • the hygromycin resistance gene is constructed by the ubiquitin promoter and ubiquitin intron inside the T-DNA of pSBll.
  • HPT HPT
  • Stu1 restriction enzyme
  • FIG. 2 shows a map of the pSLBO vector, the pSLB2 vector, and the pSLB3 vector in the vicinity of their respective left pointer sequences (hereinafter, also referred to as “LB”).
  • a DNA fragment having two or three left border sequences was inserted into the site of pSLBO recognized by the restriction enzyme Pvu II between LB and the GUS expression cassette.
  • Two left border sequences (hereinafter referred to as “sLB”) newly inserted by the synthetic DNA fragment, ie, three LBs in total, are pSLB2, and three sLBs newly inserted by the synthetic DNA fragment That is, the total of four LBs is PSLB3.
  • the vector of the present invention has a left poda sequence that functions so that DNA unnecessary for the intended transformation, ie, DNA other than T-DNA, is hardly inserted into the plant chromosome.
  • a vector in which the left pod sequence is improved so as to include a sequence in which a plurality of base sequences (for example, known left border sequences) that can be recognized by the vir protein group is included is a preferred embodiment of the present invention.
  • a DNA fragment in which multiple left border sequences are arranged is based on a known border sequence. It can be created using various known methods. For example, it can be created by synthesizing single-stranded DNA with the same sequence as the left border sequence already existing in existing Ti plasmid, and converting it to double-stranded, and linking multiple if necessary. it can. By inserting the DNA fragment thus prepared into the vicinity of the existing left border sequence downstream and upstream of the T-DNA of the plant transformation vector using an appropriate restriction enzyme site or the like. The vector of the present invention can be easily prepared.
  • a plant conversion vector that can be used as a vector of the present invention by improving the left border sequence is at least a left and right border sequence that can be recognized by the vir protein group, which is located between them, and that is to be introduced into a plant. It must have a T-DNA sequence into which the gene can be inserted, and an origin of replication that can function in vector-producing bacteria (eg, E. coli). Preferably, it has a replication origin that can function in an agglomerium.
  • a method for transforming a plant using Agrobacterium includes (1) a small intermediate cloning vector having left and right border sequences, a foreign gene inserted into T-MA, and an axceptor having a vir region.
  • a hybrid Ti plasmid vector was formed by homologous recombination, and this was further introduced into an agrobacterium into which a plasmid having a vir region (full length) but from which T-DNA had been deleted was introduced in advance.
  • agrobacterium There are methods for infecting plants with agrobacterium containing them, and various methods in these methods are known. It is possible to improve the left border arrangement of the vector.
  • An improved left-border sequence of a small ⁇ brasmid is easy to handle in a procedure for improving a foreign gene in T-DNA, and is a preferred embodiment of the vector of the present invention.
  • Examples of such small Ti plasmids include pBI101 and PBI121 (both
  • the present invention can be applied not only to the ⁇ plasmid but also to the Ri plasmid.
  • the vector of the present invention may contain, in the T-DNA sequence, a marker gene capable of selecting a transformant, such as an antibiotic resistance gene or a chromogenic gene.
  • a marker gene capable of selecting a transformant, such as an antibiotic resistance gene or a chromogenic gene.
  • commonly used ones can be used according to a conventional method.
  • a luciferase gene in addition to tetracycline, ampicillin, or an antibiotic resistance gene such as kanamycin or neomycin, hygromycin or spectinomycin, etc.
  • a luciferase gene include cuctosidase, green fluorescence protein (GFP;), / 3-lactamase, chloramphenicylacetyltransferase (CAT), and the like.
  • the gene may be contained outside the T-DNA sequence, preferably downstream of the left border sequence. The marker gene located at such a position is useful for examining the effect of the improved border sequence.
  • the replication origin refers to a specific DNA region in which a replication initiation reaction occurs, and generally refers to a region called Ori.
  • the vector of the present invention is used by inserting a foreign gene for performing a desired transformation into the T-DNA.
  • the foreign gene to be inserted usually contains a promoter operable in the host plant and a downstream structural gene (encoding a trait to be imparted to the plant). If necessary, a plurality of genes (groups) may be ligated, and / or a sequence for enhancing expression efficiency may be interposed between the promoter and the structural gene downstream thereof, and inserted between the T-DNAs.
  • the vector of the present invention containing a foreign gene is a bacterium belonging to the genus Agrobacterium capable of infecting a plant to be introduced into a target plant (for example,
  • the agrobacterium may be transferred into the agrobacterium using a conjugation operation or the like, or if possible, the agrobacterium may be directly transformed with the vector of the present invention containing the foreign gene.
  • Conventional techniques can be used to infect plants with an agrobacterium containing the vector of the present invention. For example, there is a method of injuring a part of a plant and infecting it with bacteria, a method of infecting callus, a method of co-culturing protoplasts and bacteria, or a method of culturing small pieces of leaf tissue together with bacteria.
  • Transformed cells obtained by these methods can be selected from other cells by using an appropriate marker as an index or by expressing whether or not a desired trait is expressed.
  • the transformed cells can be used as a recombinant plant by differentiating using conventional techniques.
  • T-DNA containing a foreign gene is integrated into the chromosomal DNA of a plant, a vir region is required.
  • the vir region can be supplied from a vector having a foreign gene, or can be supplied from a vector different from a vector having a foreign gene.
  • a plant cell transformed with the vector of the present invention can be transformed into a recombinant plant by diversification using conventional techniques.
  • Transformed plants can be selected from appropriate markers as indicators or from others depending on whether they express the desired trait.
  • Analysis of whether or not DNA unnecessary for the desired transformation has been inserted into the plant chromosome can be performed using various methods well known to those skilled in the art.
  • an oligonucleotide primer can be synthesized based on the vector DNA sequence outside the border sequence, and the chromosomal DNA of the transformed plant can be analyzed by PCR using the oligonucleotide primer.
  • analysis can be performed based on the presence or absence of expression.
  • DNA unnecessary for the intended transformation refers to a MA (that is, DNA other than T-DNA) portion or fragment located outside the T-DNA sequence in the vector. It does not matter whether it can function by itself or encode a polypeptide or protein.
  • Plants transformed by the transformation method of the present invention include monocotyledonous plants such as corn, sorghum, triticale, barley, oats, rye, wheat, onion, or rice, or soybeans, Alfalpha, tobacco, oilseed rape, and sunflower. And any dicotyledonous plant such as potato, pepper, or tomato.
  • unnecessary DNA is hardly inserted into a plant chromosome for the intended transformation, and the transgenic plant created by the transformation may have unexpected traits. Due to the small amount, the method of the present invention is particularly concerned that unnecessary DNA other than the T-DNA portion is transferred to the chromosome of the plant by transformation with agrobacterium, and can be ingested by other organisms as food.
  • Suitable for plant transformation In particular, it is suitable for transforming monocotyledonous plants, especially rice.
  • plant refers to not only a plant (individual) but also its seeds (including germinated seeds and immature seeds) and parts (leaves, roots, stems, flowers, Examples including stamens, pistils, and fragments thereof), plant cell cultures, calli, and protoplasts
  • Plasmid vector pSBll (Genbank Accession No. AB027256, Komari et al. Plant Journal 10, 165-174 (1996)). 689 (1992) A plasmid containing a cassette for expressing the hygromycin resistance gene (HPT) was prepared from M-kogaku, and a GUS gene (Ohta et al.) Containing a codon-intron by the ubiquitin promoter was added to the site recognized by the restriction enzyme Stul. A plasmid was constructed in which a cassette for expressing al. Plant Cell Physiology 31, 805-813 (1990) was inserted (pSLB0, Fig. 1, SEQ ID NO: 1). No. 1 is shown.
  • a synthetic DNA containing a left border sequence (hereinafter abbreviated as “LB”) and a synthetic DM complementary to the synthetic DNA were prepared.
  • the two were annealed and blunted to create a DNA fragment with two or three LB sequences.
  • the nucleotide sequences of the two synthesized DNAs are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3. This DNA fragment was inserted into the site of pSLBO recognized by the restriction enzyme PvuII between the LB and the GUS expression cassette to prepare a vector to which a plurality of LBs were added.
  • sLBs Two LBs (hereinafter sometimes referred to as “sLBs”) of synthetic DNA, ie, a total of three LBs, were regarded as pSLB2, and three sLBs, ie, a total of four LBs, were regarded as PSLB3 (pSLB0, pSLB2 Figure 2 shows a map of pSLB3 synthesis near LB).
  • pSLB0, pSLB2 Figure 2 shows a map of pSLB3 synthesis near LB).
  • Each of these three plasmids was introduced into Agrobacteriuw tu efaciens LBA4404 into which plasmid vector pSBl (Genbank Accession No. AB027255, Komari et al. Tested.
  • LBA4404 pSLB0
  • LBA4404 pSLB2
  • pSLB3 LBA4404
  • Example 2 A part of the leaves of the hygromycin-resistant plant obtained in Example 2 was stained with X-Gluc to examine the expression of the GUS gene. In plants transformed with LBA4404 (pSLB0), 17 out of 340 individuals showed GUS gene expression. This indicates that DNA derived from agrobacterium outside the border sequence was introduced into the plant in 5% of the plants transformed with the conventional vector having LB. In contrast,
  • the DNA outside the border sequence is less likely to be integrated into the plant chromosome, and the efficiency of introducing only the target T-DNA can be improved.
  • the invention has mainly been described herein by way of example using multiple left border arrangements.
  • the multiple left border arrangements are identical to each other. It may be derived from a realm, or may be derived from a different agrobacterium.
  • the gist of the present invention is to improve the left border sequence of the plant transformation vector so that it can be more reliably recognized by the vir protein group, whereby unnecessary DNA other than T-DNA is removed from the plant. That is, it can be prevented from transferring to the chromosome. Therefore, any vector having an improved left border sequence that can function as such is within the scope of the present invention.
  • the improved left border sequence may be, for example, (1) a vir protein by deleting, replacing or adding one or more bases in the left border sequence already existing in the plasmid. (2) by deleting, substituting, inserting or adding one or more base groups in the sequence near the left border sequence already existing in the plasmid; (3) a sequence containing a plurality of base sequences that can be recognized by the vir protein group; and (4) a sequence in which the vir protein group can recognize the left border sequence more reliably. Any combination of these may be included.

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Description

明 細 書 植物の形質転換用ベクター 技術分野
本発明は、 植物の形質転換用ベクターに関する。 より具体的には、 ァグロパク テリゥムを利用した植物の形質転換方法において有用なベクタ一に関する。 本発 明はさらに、 本発明のベクターを使用する植物の形質転換方法に関する。 本発明 は特に、 食品として摂取されることのある遺伝子組換え植物を作出するのに有用 である。 背景技術
土壌細菌ァグロパクテリゥム （^ro6ac W™ t匿 faci ens) が多くの双子葉 植物に根頭癌腫病 （Crowm ga l l d i s eas e) を引き起こすことは古くから知られて おり、 1 9 7 0年代には、 T iプラスミドが病原性に関与していること、 さらに T iプラスミドの一部である T-DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見され た。 その後この T-DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン （サイトカイニンとォー キシン） の合成に関与する遺伝子が存在し、 細菌遺伝子でありながら植物中で発 現することが明らかにされた。 T-DNAの切り出しと植物への伝達には T iプラス ミド上のヴィルレンス領域 （Vi r領域） に存在する遺伝子群が必要であり、 また T-DNAが切り出されるためには T- DNAの両端に存在するボーダー配列が必要であ る。 この T-DNAの両端に存在するボーダー配列をそれぞれ右ボーダー配列、 左ポ ーダー配列という。 他のァグロパクテリゥム属細菌である Agrobac teriinn rizogenes isも Riプラスミドによる同様なシステムを有している。
より具体的には、 v i r領域に存在する遺伝子群を基に造られるタンパク質群 (v i rタンパク質群） が左右のボーダー配列を認識し、 その間の T- DNAを植物ゲ ノムに組み込む。 この性質をもとに、 T-DNA中に外来遺伝子を挿入することで植 物の形質転換ができるようになり、 ァグロパクテリゥムによる植物の形質転換が 発展してきた。 しかし、 近年、 ある種の植物を形質転換する場合に、 ボーダー配列で T- DNAが 切り出されずに、 T-DNAが左ボーダー配列の外側の部分も含めて植物の染色体に 移される場合があることが分かってきた （Ramanathan et al. Plant Molecular Biology 28, 1149-1154 (1995)、 Kononov et al. Plant Journal 11, 945-957 (1997)など）。 T- DNA部分以外の不要な DNAが植物の染色体に移ることにより、 形質転換により作成された遺伝子組換え植物が予想していない形質をもつことが 懸念され、 遺伝子組換え植物を利用した食品の消費者の認識 （パブリックァクセ ブタンス） にも重要な影響を与えることが考えられる。 このためァグロパクテリ ゥム内の T- DNA部分以外の不要な醒が植物の染色体に移らないようにする方法 が要求されている。
T - DNA以外の DNA部分が植物の染色体に移るのは、 ァグロバタテリゥムの vir タンパク質群がボーダー配列を認識していないためと考えられる。 しかしながら、 このような場合に対処し、 ボーダー配列以外の DNA断片が移らない、 あるいは移 りにくいように工夫されたベクターは開発されていない。
発明者は、 T- DNAの外側の DNAが T- DNAと一緒に植物の染色体に移るのは、 ァ グロバクテリゥムの virタンパク質群がボーダー配列を認識していないためと考 えた。 そこで、 ァグロパクテリゥムを利用した植物の形質転換において用いるベ クタ一を改変し、 ァグロパクテリゥムの virタンパク質群がべクタ一のボーダー 配列を認識する確率を高め、 目的とする DNA以外の DNAが植物の染色体に移され る確率を低くすることを課題とし、 鋭意検討した。 その結果、 2つのボーダー配 列のうち、 形質転換用べクタ一において左ボーダー配列を複数並べることで、 T- DNAの外側の DNAが植物の染色体に挿入されにくくなることを見出し、 本発明を 完成するに至った。 発明の概要
本発明は、 ァグロパクテリゥムの機能を利用した植物の形質転換に用いるべク ターであって、 目的とする形質転換のためには不要な DNA、 すなわち T- DNA以外 の DNAが植物染色体へ挿入されにくいように改良された左ボーダー配列を有する ことを特徴とする植物の形質転換用ベクターを提供する。 より詳細には、 vir夕 ンパク質群によって認識されうる右ボーダー配列及び左ポーダ一配列、 それらの ボーダー配列間に配置され、 かつ植物へ導入しょうとする遺伝子が挿入可能な
T - DNA配列、 並びに細菌 （ァグロパクテリゥム及びべクタ一生産用細菌等） でべ クタ一の複製を可能にする複製開始点 （or i ) を有するベクターであって、 T-DNA 以外の DNAが植物染色体へ挿入されにくいように改良された左ボーダー配列を有 することを特徴とする植物の形質転換用ベクターを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例で用いた pSLBOベクターを表す。 pSBl lの T-DNA内部にュビキ チンプロモーターとュビキチンィントロンによりハイグロマイシン耐性遺伝子
(HPT) を発現させるカセットを持ち、 さらに制限酵素 S tu lで認識される部位に、 ュビキチンプロモーターにより力夕ラーゼィントロンを含む GUS遺伝子を発現さ せるカセットを揷入したものである。
図 2は、 pSLBOベクター、 pSLB2ベクター、 pSLB3ベクターの、 各々の左ポ一 ダ一配列 （以下 「LB」 ということもある。） 付近の地図を表す。 pSLBOの LBと GUS発現カセットの間の制限酵素 Pvu I Iで認識される部位に、 左ボーダー配列を 2つ又は 3つ持つ DNA断片を挿入したものである。 合成 DNA断片により新たに挿 入された左ボーダー配列 （以下 「sLB」 と表す） が 2つ、 すなわち LBが合計 3つ のものが pSLB2、 合成 DNA断片により新たに揷入された sLBが 3つ、 すなわち LB の合計が 4つのものが PSLB3である。 発明を実施するための好ましい形態
( 1 ) ベクターの作製
本発明のベクターは、 目的とする形質転換のためには不要な DNA、 すなわち T - DNA以外の DNAが植物染色体へ挿入されにくいように機能する左ポーダ一配列を 有する。 v i rタンパク質群によって認識され得る塩基配列 （例えば、 公知の左ボ ーダー配列） が複数個配置された配列を含むよう、 左ポーダ一配列が改良された ベクターは、 本発明の好ましい一態様である。
左ボーダー配列が複数個配置された DNA断片は、 公知のボーダー配列を基に 種々の公知の方法を用いて作成することができる。 例えば、 既存の Tiプラスミ ド中に既に存在する左ボーダー配列と同一の配列の一本鎖 DNAを合成し、 そして これを二本鎖とし、 必要であれば複数個連結することにより作成することができ る。 このように作成した DNA断片を、 植物形質転換用ベクターの T-DNAの下流の 既存の左ボーダー配列の前及び 又は後ろの付近に、 適当な制限酵素部位等を利 用して挿入することにより本発明のベクターを容易に作成することができる。 左ボーダー配列を改良して本発明のベクターとすることができる植物転換用べ クタ一は、 少なくとも、 v i rタンパク質群によって認識されうる左右ボーダー配 列、 その間に配置され、 かつ植物へ導入しょうとする遺伝子が挿入可能な T-DNA 配列、 並びにべクタ一生産用細菌 （例えば、 大腸菌） で機能可能な複製開始点を 有することが必要である。 好ましくは、 ァグロパクテリゥムで機能することがで きる複製開始点を有するものがよい。
このような条件を満たすベクターであれば、 左ボーダー配列の改良は、 種々の ベクタ一のいずれにも適用することができる。 例えば、 ァグロバクテリウムを利 用する植物の形質転換方法には （1 ) 左右ボーダー配列を持ち、 T- MA中に外来 遺伝子を挿入したサイズの小さな中間クローニングベクター、 及び v i r領域を有 するァクセプター Πプラスミドから、 相同組換えによりハイプリッド Ti プラス ミドベクターを形成し、 これを含むァグロパクテリゥムを植物に感染させる方 法； （2 ) vi r領域を有さないサイズの小さな T iプラスミド （ミニプラスミド又 はミクロ Tiプラスミドと呼ばれ、 多くの細菌内で複製可能である。） の T-DNA中 に外来遺伝子を挿入し、 これを、 vi r領域を有するが T-DNAを欠失させたプラス ミドをあらかじめ導入したァグロパクテリゥムへさらに導入し、 これらを含むァ グロバクテリゥムを植物に感染させる方法；又は （3 ) 左右のボーダー配列を持 ち、 T-DNA中に外来遺伝子を揷入したサイズの小さなクローニングベクター、 及 び V 領域の一部 （νκ領域の全長から一部を欠失させたもの） を有するァクセ プタ一 Tiプラスミドから、 相同組換えによりハイプリッド T iプラスミドベクタ 一を形成し、 これを vi r領域 （全長） を有するが T-DNAを欠失させたプラスミド をあらかじめ導入したァグロパクテリゥムへさらに導入し、 これらを含むァグロ バクテリゥムを植物に感染させる方法等があるが、 これらの方法における種々の ベクタ一の左ボーダー配列の改良が可能である。 サイズの小さな Π ブラスミド の左ボーダー配列を改良したものは、 T-DNA中の外来遺伝子の改良操作等におい て取り扱いが容易であり、 本発明のベクタ一の好ましい一態様である。 このよう なサイズの小さな T iプラスミドの例としては、 pBI 101、 PB I 1 21 (いずれも
CL0NTECH社）、 又は後述する実施例中で用いた pSBl lがある。
また、 本発明は、 πプラスミドのみならず、 Riプラスミドにおいても適用す ることができる。
本発明のベクターは、 形質転換体を選択可能とするマーカー遺伝子、 例えば抗 生物質耐性遺伝子、 発色性遺伝子等を T-DNA配列中に含んでもよい。 具体的には、 通常使用されるものを常法により用いることができ、 テトラサイクリン、 アンピ シリン、 又はカナマイシン若しくはネオマイシン、 ハイグロマイシン又はスぺク チノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等の他、 ルシフェラーゼ遺伝子、 ーガラ クトシダ一ゼ、 グリーンフルォレツセンスプロテイン （GFP；)、 /3—ラクタマーゼ、 クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ （CAT) 等が例示される。 ま た、 これとは別に、 T-DNA配列の外側、 好ましくは左ボーダー配列の下流にマー 力一遺伝子を含んでもよい。 このような位置に配置されたマーカー遺伝子は改良 されたボーダー配列の効果を検討するために有用である。
ここで、 複製開始点とは、 複製開始反応が起こる特定の DNA領域をいい、 一般 には Or i と呼ばれる領域をいう。
( 2 ) 形質転換
本発明のベクタ一は、 その T-DNA中に目的とする形質転換を行うための外来遺 伝子を挿入して使用する。 挿入する外来遺伝子は、 通常、 宿主植物体で機能可能 なプロモータ一とその下流の構造遺伝子 （植物へ付与しょうとする形質をコード する） を含む。 必要に応じ、 遺伝子 （群） を複数個連結し、 及び 又はプロモー ターとその下流の構造遺伝子との間に発現効率を高めるための配列を介在させ、 T-DNA間へ挿入してもよい。
外来遺伝子を含む本発明のベクターは、 目的とする植物に導入するためにその 植物への感染能力を有するァグロパクテリゥム属に属する細菌 （例えば
Agroba c t er i um t ume fac i ens) 内へ導入される。 この操作には、 当業者に周知の T/JP99 05386 種々の方法を利用することができる。 接合操作等を利用してァグロパクテリゥム 内に移してもよいし、 可能であれば、 外来遺伝子を含む本発明のベクタ一で直接 ァグロパクテリゥムを形質転換してもよい。
本発明のベクターを含んだァグロパクテリゥムを植物に感染させるには、 従来 の技術を利用することができる。 例えば、 植物体の一部を傷つけ、 そこに細菌を 感染させる方法、 カルスに感染させる方法、 プロトプラストと細菌を共培養する 方法、 又は葉組織の小片を細菌とともに培養する方法がある。 これらの方法から 得られた形質転換細胞は、 適当なマーカーを指標とするか、 又は所望の形質を発 現しているか否かによって他の細胞から選択することができる。 形質転換細胞は さらに、 従来技術を利用して分化させることで組換え植物体とすることができる。 植物の染色体 DNAに外来遺伝子を含む T-DNAが組み込まれる際には、 v i r領域 が必要である。 v i r領域は、 外来遺伝子を有するベクターから供給され得るし、 また、 外来遺伝子を有するベクタ一とは異なるベクターから供給され得る。
本発明のベクターを用いて形質転換された植物細胞は、 従来技術を利用して分 化させることで、 組換え植物体とすることができる。 形質転換植物は、 適当なマ —カーを指標とするか、 又は所望の形質を発現しているか否かによって他のもの から選択することができる。
目的とする形質転換のためには不要な DNAが植物染色体へ挿入されたか否かの 解析は、 当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。 例えば、 ボーダ 一配列の外側のベクター DNA配列を基にオリゴヌクレオチドプライマ一を合成し、 これを用いた PCRにより形質転換植物の染色体 DNAを解析することができる。 ま た、 T-DNA配列の外側にマーカ一遺伝子を含むベクタ一を用いて形質転換した場 合は、 その発現の有無により、 解析することができる。
本発明は、 目的とする形質転換のためには不要な DNAが挿入されにくいという 機能を有するが、 「挿入されにくい」 とは、 左ボーダー配列が改良されていない ベクターを用いた場合と比較して、 不要な DNAが宿主植物染色体に挿入される割 合が少ないこと、 挿入される長さが短いこと、 若しくは挿入されないこと、 及び 又は、 左ボーダー配列が改良されていないベクターを用いた場合と比較して、 意図しない形質転換が起こる割合が少ないこと、 起こったとしても軽微であるこ と、 若しくは起こらないことをいう。 また、 「目的とする形質転換のためには不 要な DNA」 とは、 ベクタ一中の T- DNA配列の外側に位置する MA (すなわち T- DNA以外の DNA) 部分又は断片をいう。 それ自体で機能可能であるか又はポリべ プチド又はタンパク質をコードしているかは問わない。
本発明の形質転換方法により形質転換される植物は、 トウモロコシ、 モロコシ、 ライ小麦、 大麦、 オート麦、 ライ麦、 小麦、 タマネギ、 若しくはイネ等の単子葉 植物又は大豆、 アルフアルファ、 タバコ、 アブラナ、 ヒマヮリ、 ジャガイモ、 コ ショウ、 若しくはトマト等の双子葉植物のいずれでもよい。 本発明の方法によれ ば目的とする形質転換のためには不必要な DNAが植物染色体へ挿入されにくく、 また形質転換により作成された遺伝子組換え植物は予想していない形質をもつこ とが少ないことから、 本発明の方法は、 ァグロパクテリゥムによる形質転換では T-DNA部分以外の不要な DNAが植物の染色体に移ることが特に懸念される、 他の 生物に食品として摂取されうる植物の形質転換に適している。 特に、 単子葉植物、 とりわけイネの形質転換に適している。
なお、 本明細書で 「植物」 というときは、 特に明示しない限り、 植物体 （個 体） の他、 その種子 （発芽種子、 未熟種子を含む。）、 部分 （葉、 根、 茎、 花、 雄 蕊、 雌蘂、 それらの片を含む。）、 植物培養細胞、 カルス、 プロトプラストを含む 実施例
実施 !! 1
(1) ベクターの作製
プラスミドベクタ一 pSBll (Genbank Accession No. AB027256, Komari et al. Plant Journal 10， 165-174 (1996)) の T-DNA内部にュビキチンプロモーターと ュビキチンイントロン （Christensenet al, Plant Molecular Biology 18, 675- 689 (1992) Mこよりハイグロマイシン耐性遺伝子 （HPT) を発現させるカセット を持つプラスミドを作成し、 さらに制限酵素 Stulで認識される部位に、 ュビキ チンプロモーターにより力タラ一ゼイントロンを含む GUS遺伝子 （Ohta et al. Plant Cell Physiology 31, 805-813 (1990)) を発現させるカセットを挿入した プラスミ ドを作成した （pSLB0、 図 1、 配列番号 1)。 PSLB0の塩基配列を配列番 号 1に示す。
次に Tiプラスミド pTiAch5の塩基配列 （Genbank Accession No. K00548) を基 に左ボーダー配列 （以下 「LB」 と略す。） を含む合成 DNAと、 この合成 DNAに相 補的な合成 DMを作成し、 2つをアニーリング、 平滑化させて、 LB配列を 2つあ るいは 3つ持つ DNA断片を作成した。 合成した 2つの合成 DNAの塩基配列を配列 番号 2及び 3に示す。 この DNA断片を pSLBOの LBと GUS発現カセットの間の制 限酵素 PvuIIで認識される部位に挿入し、 LBを複数付加させたベクターを作成 した。 合成 DNAによる LB (以下 「sLB」 ということもある。） が 2つ、 すなわち LBが合計 3つのものを pSLB2、 sLBが 3つ、 すなわち LBの合計が 4つのものを PSLB3とした （pSLB0、 pSLB2、 pSLB3の合成 LB付近の地図を図 2に示す）。 これ ら 3種のプラスミドをそれぞれ、 プラスミドベクタ一 pSBl (Genbank Accession No. AB027255, Komari et al. Plant Journal 10, 165-174 (1996)) を導入した Agrobacteriuw tu efaciens LBA4404に導入し、 以下の試験に供試した。
(2) 形質転換
LBA4404(pSLB0)、 LBA4404 (pSLB2)、 LBA4404 (pSLB3)を用い、 イネ品種 「朝の 光」 の未熟胚由来のカルスをそれぞれ形質転換した。 形質転換は樋江井らの方法 (Hiei et al. Plant Journal 6, 271-282 (1994)) に従った。
(3 ) 形質転換体での GUS遺伝子発現の解析
実施例 2で得られたハイグロマイシン抵抗性植物の葉の一部を X-Glucにより 染色し、 GUS遺伝子の発現を調べた。 LBA4404 (pSLB0)で形質転換した植物では 340個体のうち 17個体が GUS遺伝子の発現を示した。 このことは LBがーつであ る従来のベクターで形質転換された植物の 5%ではボーダー配列外のァグロパク テリゥム由来の DNAが植物に導入されたことを示す。 これに対し、
LBA4404(pSLB2)、 LAB4404 (pSLB3)を形質転換した植物では合成 LBの数が増える に従い GUS遺伝子の発現を示す個体は減少した （表 1)。 これは合成 LBをべクタ 一に入れることにより左ボーダー配列外の DNAが植物に移りにくくなつたことを 示す。
(4) GUS遺伝子発現を示さなかった個体のゲノミック DNAの解析
上記試験で GUS遺伝子の発現を示さなかった個体の中には左ボーダー配列外の P T/JP99/05386
DNAが植物染色体に導入されているが GUS遺伝子を発現させるュビキチンプロモ 一夕一までは至らないものが含まれていることが考えられる。 そこで、 GUS遺伝 子の発現を示さなかった植物からランダムに、 それぞれ 60前後の独立の形質転 換体を選んでゲノミック DNAを抽出し、 PCR解析を行った。 PCR解析に用いたプ ライマーは本来の LBと合成 LBの間から GUS遺伝子の一部までを増幅できるよう に作成した。 プライマーの配列を配列番号 4及び 5に示す。
PCR解析の結果、 LBA4404 (pSLB0)で形質転換した植物では 67個体中 7個体 (10. 4%)で DNAの増幅が確認され、 LBがーつである従来のベクタ一では作出され た形質転換体の 1割以上の高頻度で目的とする T-DNA以外のァグロパクテリゥム 由来 DNAが染色体に組み込まれていることが明らかとなった。 これに対し、 合成 LBをもつ LBA4404 (pSLB2)及び LBA4404 (pSLB3)で形質転換した植物では、 そのよ うな DNAの増幅が確認された個体はなかった。
これらの結果を表 1及び表 2に示した。
表 1 . GUS遺伝子発現の解析 ベクター 形質転換個体数 GUS発現個体の割合
( % )
pSLBO 340 5. 0
PSLB2 327 1. 2
PSLB3 370 0. 8
表 2 . ゲノミック DNAの解析
PCRによリ
ベクター DNA抽出個体数 DNAが増幅された
個体数
pSLBO 67 7
PSLB2 55 0
PSLB3 58 0
以上の結果から、 本発明により、 ボーダー配列外の DNAが植物染色体に組み込 まれることが少なくなり、 目的とする T- DNAだけを導入できる効率を向上させる ことが可能となった。
本明細書では、 主として、 複数の左ボーダー配列を使用する例によって本発明 を説明した。 この場合の複数の左ボーダー配列は、 それぞれ同一のァグロバクテ リゥム由来のものであってもよいし、 それぞれ異なるァグロパクテリゥム由来の ものであってもよい。 しかし、 本発明の主眼は、 植物形質転換用ベクターの左ボ ーダ一配列を、 v i rタンパク質群によってより確実に認識されるように改良し、 それによつて T- DNA以外の不要な DNAが植物染色体に移らないようにできること である。 したがって、 そのように機能することのできる改良された左ボーダー配 列を有するベクターであれば、 本発明の範囲に含まれる。 改良された左ボーダー 配列は、 上に説明したものの他、 例えば、 （1 ) プラスミド中に既に存在する左 ボーダー配列において、 一又は複数の塩基を欠失、 置換若しくは付加することに より、 v i rタンパク質群がより確実に認識しうる塩基配列としたもの； （2 ) プ ラスミド中に既に存在する左ボーダー配列付近の配列において、 一又は複数の塩 基を欠失、 置換、 挿入若しくは付加することにより、 v i rタンパク質群がより確 実に左ボーダー配列を認識しうるようにしたもの； （3 ) v i rタンパク質群によ つて認識され得る塩基配列を複数個含むような配列としたもの；及び （4 ) これ らの任意の組み合わせを含み得る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ァグロパクテリゥムの機能を利用した植物の形質転換に用いるベクタ一で あって、 T- DNA以外の DNAが植物染色体へ揷入されにくいように左ボーダー配列 が改良されたことを特徴とする植物の形質転換用ベクター。
2 . ァグロパクテリゥムの v i rタンパク質群によって認識されうる右ボーダー 配列及び左ボーダー配列、 それらのボーダー配列間に配置され、 かつ植物へ導入 しょうとする遺伝子が揷入可能な T- DNA配列、 並びに細菌での前記ベクターの複 製を可能にする複製開始点を有する植物の形質転換用ベクターであって、 T- DNA 以外の DNAが植物染色体へ挿入されにくいように左ボーダー配列が改良されたこ とを特徴とする前記べクタ一。
3 . 左ボーダー配列の改良が、 左ボーダー配列が複数個配置されたことを含む、 請求項 1又は 2に記載のベクター。
4 . T-DNA配列中に、 形質転換体を選択可能とするマーカ一遺伝子を含む請求 項 1〜 3のいずれか 1項に記載のベクター。
5 . 複製開始点が、 ベクター生産用細菌及びァグロパクテリゥムを含む細菌で のべクタ一の複製を可能にするものである、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載 のべク夕一。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のベクターを有するァグロパクテリゥ ムを用いる植物の形質転換方法。
7 . 請求項 6に記載の方法により形質転換された植物。
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