CN1330662C - 标记核糖核酸的方法和由此获得的标记rna片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及标记合成或天然的核糖核酸(RNA)的方法。本发明还涉及根据该方法标记的RNA片段及其应用。所述方法包括:将RNA片段化;在位于所述RNA每个片段的3’端和/或5’端的末端磷酸上标记,所述磷酸末端是在片段化过程中释放的。本发明优选应用于医学诊断领域。
Description
本发明涉及标记合成或天然核糖核酸(RNA)的新方法。
合成RNA是指通过人们开发的技术例如扩增技术(PCR后转录)或转录扩增技术(TMA)获得的RNA。天然RNA是指通过从细胞提取获得的RNA,例如信使RNA、核糖体RNA或转运RNA。
现有技术显示,标记核苷酸、寡核苷酸或核酸有许多方法;寡核苷酸和核酸将用术语多核苷酸表示。寡核苷酸可在合成中标记或通过掺入至少一个标记的核苷酸来标记。
第一种方法包括将标记附加在碱基上,后者可以是天然碱基也可是修饰碱基。第二种方法是将标记附加在糖上,同样后者可以是天然糖也可是修饰糖。第三种方法涉及将标记附加在磷酸上。
标记碱基特别用于通过直接掺入标记的核苷酸来标记核酸的方法。
标记糖常常用于通过化学合成制备核酸探针的情况。
标记磷酸则用于在化学合成多核苷酸时导入功能化的臂或标记。
实际上,标记核苷酸或核苷酸类似物或核酸的技术人员倾向于将标记附加在碱基或糖上,这给他提供更多的方便和更大的选择。而且,大量文献研究也显示这种情况,例如标记碱基的文献EP-A-0,329,198、EP-A-0,302,175、EP-A-0,097,373、EP-A-0,063,879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3,910,151和EP-A-0,567,841,或标记糖的文献EP-A-0,286,898。
然而,这些技术有许多缺点,两个主要缺点是标记的存在造成的空间障碍和影响。
当标记碱基时,空间障碍是由于标记侵占了相邻碱基的空间,不管该相邻碱基是由相同链还是互补链的临近核苷酸所携带。同样非常明显,碱基上标记的存在可削弱酶促掺入过程中的效率和特异性,并可影响两条互补链间氢键的质量,从而对杂交不利。
当标记糖时,空间障碍是由于标记侵占了相同链携带的相邻糖基的空间。该标记的存在可疏远相同链携带的两个相邻碱基,从而妨碍了与互补链的有效杂交,因为链间氢键不是最佳的。
将标记附加在磷酸上的技术比功能化碱基和糖所涉及的技术更为复杂。
即使如此,仍有一些文献提出了标记磷酸的技术。例如文献EP-A-0,280,058,其描述了通过将标记附加在磷酸上来标记核苷酸的方法,其中当核苷酸是脱氧核糖核苷酸时,磷酸在2’和/或5’位与糖相连,当核苷酸是核糖核苷酸时,磷酸在2’、3’和/或5’位与糖相连。该文献还描述了包含至少一个上述标记核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸;该核苷酸在合成过程中掺入多核苷酸或寡核苷酸中。
然而,文献EP-A-0,280,058提出的标记方法不能使核酸均匀标记。这是因为不能控制标记核苷酸在多核苷酸中的掺入;这完全取决于待合成多核苷酸的组成。因此,一些多核苷酸可能包含大量标记核苷酸,而其它多核苷酸可能根本不含任何标记核苷酸。结果,这些核酸发出信号的强度将不均一,这样在检测这些核酸时很容易引起结果难以解释。
在该情况下,标记是一种生物标记,人们不能控制标记核苷酸的位置。
文献US-A-5,317,098涉及5’末端标记的核酸。该标记采用咪唑和接头臂。没有相关的片段化。而且,添加了磷酸,因此使用激酶。
然而,理论上核酸的每个游离末端均存在磷酸,导致至少增加一个步骤。该标记不涉及任何片段化。
此外,上两篇文献所述标记是在大的核酸上进行的。实际上,在标记步骤之前没有描述片段化阶段,也称作切割阶段。结果,当对这些靶核苷酸与捕获探针杂交时,杂交后形成的双链不稳定。当使用多核苷酸作为检测探针时,也会出现该情况。原因可能是空间障碍,或者合成的多核苷酸及其大小不一定相同的靶标之间缺乏特异性。因此,这将导致数量和质量上的信号损失。
空间障碍可能不仅是核酸长度的结果,而且也是二级结构存在或维持的结果。片段化可破坏这些结构,这样就可优化杂交。在与含有高密度捕获探针的表面如Affymetrix公司开发的DNA芯片杂交时该空间障碍起着特别重要的作用(“用高密度DNA阵列获取遗传信息(Accessing Genetic Information with High-Density DNAarrays)”,M.Shee等,科学(Science),274,610-614。“光产生的用于快速DNA序列分析的寡核苷酸阵列(Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis)”,A.Caviani Pease等,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1994,91,5022-5026)。在该技术中,捕获探针大小通常减少,为约20个核苷酸。
本领域现有技术描述了大量核酸片段化的方法。
首先,片段化可以是酶反应的,即核酸可通过核酸酶(DNA酶或RNA酶)片段化。这将产生具有3’-OH、5’-OH、3’-磷酸和5’-磷酸末端的小片段。
其次,片段化可是化学反应的。例如对于DNA,可将DNA脱嘌呤或脱嘧啶,然后该DNA通过所谓的“β-消除”机制在碱存在下片段化。特别地,DNA可通过氧化、烷基化或加入自由基的机制片段化。经常与用作化学催化剂的有机分子如咪唑结合的金属阳离子可用于RNA的片段化。优选地,该片段化在碱性介质中进行,并产生具有3’磷酸末端的片段。
然而,这些片段化的目的不是为了便于或允许标记。
文献WO-A-88/04300提出了一种片段化并标记RNA的方法,该片段化是采用具有酶特性的RNA即核酶来进行的。通过每次切割,这种使用核酶的片段化释放一个核酸(5’)HO末端和一个核酸(3’)HO-PO2末端。然后,通过掺入酶(激酶)实现这种只是放射性的标记,其中加入酶可掺入一个来自γ-GTP分子的增加的放射性磷酸。这种掺入只在5’端进行。而且,片段化仅由核酶来实施,这暗示在核酶和待切割的靶核酸之间存在特异性。然后,磷酸充当标记。
本发明将标记接合在切割过程中释放的核酸片段的单一磷酸上。由于没有特异性,所以任何类型的核酸均可以随机的方式片段化。这样,我们的方法可制备例如检测探针。最后,磷酸只是核酸和标记之间的接头臂。
现有技术没有描述在一或两步的标记之前片段化的方法。
因此,本发明提出了克服前面提到的缺点的方法。这样,该方法可在片段化完成之后即获得均一标记的RNA片段。此外,该片段化可获得对于可能的杂交具有最佳大小的片段。随着杂交质量的改善,该杂交的检测将更为快速和有效。
标记是指附加能产生可被直接或间接检测的信号的标记。下面是这些标记的非限制性列表:
●产生可通过例如比色、荧光、发光检测的信号的酶,例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,
●发色团,例如荧光和发光化合物和染料,
●具有可通过电子显微镜或通过其电学性质如导电率、电流测定法、伏安测量法和阻抗进行检测的电子密度的基团,
●可检测的基团,例如大小足以诱导其物理和/或化学性质可检测的改变的分子;该检测可通过光学方法例如衍射、表面等离子体振子共振、表面变化和接触变化角,或物理方法如原子力光谱和隧道效应来进行,
●放射性分子,例如32P、35S或125I。
也可使用间接系统,例如能与抗配体反应的配体。配体/抗配体对是本领域技术人员所熟知的,例如下列配体/抗配体对的情况:生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/植物凝集素和多核苷酸/互补多核苷酸。在这种情况下,是配体携带了接合因子。抗配体可直接通过前面段落所述标记检测,或其本身可通过配体/抗配体检测。
在一定条件下,这些间接检测系统可导致信号放大。这种信号放大的技术是技术人员熟知的,读者可参考本申请人已有专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000,或参考文章J.Histochem.Cytochem.45:481-491,1997。
为此,本发明涉及标记合成或天然核糖核酸(RNA)的方法,其特征在于它包括:
将RNA片段化,和
在位于所述RNA每一片段3’端和/或5’端的末端磷酸水平上标记,所述末端磷酸是在片段化过程中释放的。
根据一个优选实施模式,对于除构成初始RNA的3’和/或5’端的片段之外的所有片段,标记该RNA每一片段的3’末端,和/或对于除构成初始RNA 5’端的片段之外的所有片段,标记该RNA每一片段的5’末端。
根据第一个实施方案,片段化和标记在一步中进行。
根据第二个实施方案,片段化和标记在两步中进行。
无论哪个实施方案,RNA片段3’端或5’端的标记均通过给位于核糖2’位、3’位或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个活性功能基团来实现,所述活性功能基团是由标记携带的,或其可随后与至少一个标记连接。当有至少两个标记时,该技术就是一个信号放大技术。
片段化和/或RNA片段3’端或5’端的标记可通过给位于核糖2’位、3’位或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个亲核、亲电子或卤化物功能基团来实现,所述功能基团是由标记携带的,或其可随后与一个标记连接。
RNA的片段化通过酶法、化学法或物理法进行。
RNA的酶法片段化通过核酸酶来实现。
RNA的化学片段化通过可能结合或未结合化学催化剂的金属阳离子来实现。
在这种情况下,金属阳离子是Mg++、Mn++、Cu++、Co++和/或Zn++,而化学催化剂包括咪唑、取代类似物例如N-甲基咪唑或任何对RNA具有亲合力并带有咪唑核或取代类似物的化学分子。
RNA的物理片段化通过超声或辐射来实现。
在所有相关情况下,RNA片段3’端或5’的标记均通过给位于核糖2’位、3’位或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个R-X分子来实现,其中R是标记,X是该标记结合RNA的基团如羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤、苯基甲基卤、碘乙酰胺或马来酰亚胺基团。
本发明还包括通过所述方法根据以上详述的特征获得的RNA片段,其特征在于,一方面RNA片段包含在该RNA片段3’端或5’端的末端磷酸上的单个标记核苷酸,所述末端磷酸是在片段化过程中释放的,另一方面,包含至少一个其碱基(嘌呤:腺嘌呤/鸟嘌呤或嘧啶:尿嘧啶/胞嘧啶)与标记核苷酸的碱基相同的另一核苷酸。
该RNA片段包含10-100个核苷酸,优选30-70个核苷酸,更优选40-60个核苷酸。
根据一个优选实施方案,RNA片段包含至少一个硫代磷酸核苷酸。
此外,标记的核苷酸是硫代核苷酸。
本发明涉及上述定义的RNA片段作为探针在检测RNA和/或DNA或RNA片段和/或DNA片段中的应用。
最后,本发明涉及上述定义的RNA片段作为能结合捕获探针的标记靶标的应用。
附图显示了合成本发明标记的RNA片段的不同方法以及由此获得的片段。它们代表具体的实施方案,不能认为是限制了本发明的范围。
图1图示存在Mn++离子和咪唑时RNA的化学片段化。
图2图示用携带了亲核功能基团的标记对RNA片段化和标记。
图3显示可用于图2所示方法的标记,该标记由荧光素-尸胺组成。
图4显示可用于图2所示方法的标记,该标记由荧光素-酰肼组成。
图5显示可用于本发明的方法的卤代标记。
图6图示通过本发明的方法获得的RNA片段的3’端,其中标记与天然磷酸连接,Z是偶联臂,也称间隔臂,见本申请人已有的专利申请的定义,该专利申请是1997年8月1日提交的PCT/FR97/01445。Z的该定义也适于图7和图8。
图7图示通过本发明的方法获得的RNA片段的3’端,其中标记与硫代磷酸相连。
最后,图8图示通过本发明的方法获得的RNA片段的5’端,其中标记与天然磷酸相连。
图中所述的方法可以是一步法,如图2中的情况,其中片段化和标记是使用标记的亲核试剂共同进行的。
所述方法也可在两步中进行。第一步是如图1所示的片段化步骤,例如由咪唑作用产生。第二步也是最后一步是采用如非限制性的图3到5所示的标记进行标记的步骤;该标记是在释放的磷酸上进行的,见图6-8。
实施例1-制备RNA扩增子和RNA转录物
A制备天然扩增子:
天然扩增子(单链RNA)采用Gen Probe(San Diego,CA)开发的TMA(转录介导的扩增)扩增技术制备。扩增的RNA链相应于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(ATCC-27294)核糖体的16S序列。将该16S RNA克隆至质粒中,然后该质粒转化TA克隆双启动子试剂盒(TA Cloning Dual Promoter kit)(货号:K2050-01-Invitrogen,Groningen,荷兰)中的细菌。在LB培养基(如Maniatis所述)中培养并用碱裂解提取细菌DNA后,使用“Ampli Scribe T7Transcription”试剂盒(货号:AS 2607-Epicentre Technologies(Madison,WI))转录所述链。通过测定260nm处的吸光度确定每微升中的拷贝数。
B从通过TMA获得的DNA制备RNA转录物:
首先应注意TMA扩增产物除了RNA扩增子之外还含有约90%RNA比10%DNA比例的DNA扩增子。这些DNA扩增子用于通过体外转录产生单链RNA。
第一步首先采用Gen Probe的Mycobacterium TuberculosisDirect(MTD)试剂盒(货号:1001E)以前面相同的方式使用上述步骤1-A所述的程序获得扩增子。
第二步,对第一步使用结核分支杆菌16S RNA模板由TMA获得的DNA模板进行转录。
转录从5ul TMA产物开始使用MEGAscnipt T7试剂盒(AMBION,Austin,TX,货号:1334)进行。反应在37℃进行1小时。
C-从通过PCR获得的DNA制备RNA转录物
使用刮子从培养于Lowenstein-Jensen培养基上的细菌分离物(ATCC-27294)收集1或2个菌落(3-5mm直径,相当于108细菌),并重悬于1.5ml Eppendorf(商标)管中的250ul无菌水中。通过在玻璃株存在时使用涡旋仪剧烈振荡从细菌悬液的细胞材料中提取核酸。该提取在本申请人提交的1997年9月23日的专利申请FR97/12164和1998年7月23日的FR98/09583中有详细描述。
取5ul裂解物直接加入PCR反应物中。也可向PCR反应物中直接加入20ng质粒DNA。
使用分支杆菌属特异的引物(结核分支杆菌参考序列GenbankM20940的第213-236位和394-415位),通过PCR扩增16S高变区,扩增子的大小是202碱基对(bp)。这两个引物还在5’端含有噬菌体T3或T7启动子序列。在下面描述的引物中,启动子序列是小写的粗体字母,而分支杆菌序列是大写字母:
T3-M15′-aattaaccctcactaaagggAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCA
T7-M25′-gtaatacgactcactatagggcTGTGGCCGGACACCCTCTCA
PCR在含有50mM KCl、10mM Tris(pH8.3)、1.5mM MgCl2、0.001%(m/v)明胶、5%(v/v)DMSO、每个引物各0.5uM、四种三磷酸脱氧核苷酸各200uM和1.5单位Taq聚合酶(AmpliTaq,Perkin-Elmer,Norwalk,CT)的100ul体积的反应液中进行。PCR反应在Perkin-Elmer 2400温度循环仪(Norwalk,CT)中采用如下条件进行:最初变性步骤94℃ 5分钟(min),之后35个循环,每个循环是94℃45秒(s),60℃ 30s和72℃ 30s,最后一个循环之后是72℃ 10min。PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
采用含有所述启动子的扩增子通过体外转录产生单链RNA。每个反应20ul体积,包含约50ng PCR产物、20单位T3或T7聚合酶(Promega,Madison,WI)、40mM Tris乙酸缓冲液(pH=8.1)、100mM乙酸镁[Mg(AcO)2]、10mM DTT和1.25mM的各种三磷酸核苷酸(ATP,CTP,GTP和UTP)。该反应在37℃进行1小时。
D-从由PCR获得的DNA制备含硫代磷酸的RNA转录物:
通过体外转录,采用根据上述步骤1-C由PCR获得的含有所述启动子的扩增子制备含硫代磷酸的单链RNA。每个反应20ul体积,包含约50ng PCR产物、20单位T3或T7聚合酶(Promega,Madison,WI)、40mM Tris乙酸缓冲液pH=8.1、100mM乙酸镁[Mg(AcO)2]、10mMDTT和1.25mM的各种三磷酸核苷酸或硫代磷酸核苷酸(ATP-α-硫代磷酸(ATP-α-S)或CTP-α-硫代磷酸(CTP-α-S)),并采用两中不同的方案:
-ATP-α-S,CTP,GTP和UTP,或
-ATP,CTP-α-S,GTP和UTP。
该反应在37℃进行1小时。
所用硫代磷酸核苷酸以100%的1.25mM存在,因此替代了相应的天然核苷酸。在所有情况下,通过含7M尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析转录产物。溴化乙锭染色后,通过与加至凝胶的标准物比较,检查转录物的大小并定量。
核苷酸ATP-α-S和CTP-α-S获自N&N Life Sc ience Products(Boston,MA,美国)。
实施例2-RNA的化学片段化:
RNA的化学片段化通常由金属阳离子(Mn++,Mg++,等)催化,这些金属离子通过结合磷酸基团中和氧的负电荷,因此有利于核糖2’位羟基对磷酸的亲核攻击。
如图1所示,质子供体和受体分子例如咪唑核的存在可能增强该亲核攻击(R.Breslow和R.Xu,美国科学院院刊90,1201-1207,1993)。
该片段化可在不同温度和不同条件下进行。如下文所述,进行两种不同类型的片段化。
一种片段化可在60℃进行。在这种情况下,将具有330个核苷酸(大约66pmol)的结核分支杆菌16S RNA转录物(以下称作分支杆菌转录物)在咪唑(30mM)和氯化锰(30mM)的水溶液中于60℃孵育30分钟。片段化溶液的总体积是100ul。然后在聚丙烯酰胺胶上(6%,7M尿素)分析片段化的RNA,并用溴化乙锭染色。
片段化还可在95℃进行。在此情况下,分支杆菌330个核苷酸(66pmol)的16S RNA转录物在氯化镁(30mM)溶液中于95℃孵育30分钟。片段化溶液的总体积是100ul。然后在聚丙烯酰胺胶上(6%,7M尿素)分析片段化的RNA,并用溴化乙锭染色。
在这两类片段化中,凝胶分析显示初始化合物的消失和多个较短片段的出现,其中最主要群体的大小介于20-50个核苷酸。
这两个程序均可用于在片段化过程中向RNA链导入荧光标记。
实施例3-在片段化过程中通过导入带有亲核功能基团的标记物进行标记
比核糖2’位羟基具有更大亲核性的功能基团可攻击被中和的磷酸基团,由此产生通过磷酸基连接该功能基团的片段,从而使RNA链片段化。如图2所示,为产生标记的RNA片段可将该功能基团与标记相连。
图3所示带有胺功能基团的荧光素-尸胺以及图4所示带有酰肼功能基团的荧光素-酰肼,用于在65℃片段化过程中标记分支杆菌(330个核苷酸)16S RNA。该RNA按实施例1B所述获得。
将荧光素-尸胺和荧光素-酰肼溶在DMF中至终浓度7.5mM。这些药品均获自Molecular Probes(Eugene,OR,美国)。
将1ul标记物溶液(溶于DMF,7.5mM)加入溶于65℃片段化缓冲液的靶16S RNA(66pmol)溶液(实施例1)中。65℃孵育30分钟后,根据厂家提供的程序在DNA芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA,美国)上杂交、检测并分析每个反应产物。这些芯片是为鉴定某个特定区域设计的,在本例中,该区域是结核分支杆菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-415区域。当采用荧光素-尸胺或荧光素-酰肼时,发现该序列的66%。这说明在每种情况下均在片段化过程中导入了标记物,由此产生了可检测的荧光片段。A.Troesch等的文章(临床微生物学杂志(J.Clin.Mi crobiol.),37(1),49-55页,1999)对该鉴定做了很好的描述。
实施例4-片段化过程中采用带有甲基卤的标记物进行标记
已知单磷酸可被带有苯基甲基卤基团的标记所取代(见T.Furuta等,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 3139-3142,1993)。图5所示之5-溴荧光素属于这类卤代标记物。
由于已知片段化反应会释放与开放形式相平衡的环化单磷酸3’末端,所以可采用片段化步骤将标记附加在RNA片段的3’磷酸基团上。
A-标记TMA扩增获得的RNA扩增子:
按实施例1-A所述通过TMA扩增分支杆菌(330个核苷酸)16S RNA扩增子。5-溴荧光素获自Molecular Probes(Eugene,OR,美国)。氯化锰获自Sigma,咪唑获自Aldrich。
A-1.标记50ul TMA:采用6mM咪唑和60mM氯化锰的程序:
在直径和长分别为12mm和75mm的5ml聚丙烯管中,将15ul咪唑(0.1M)溶液、15ul氯化锰(1M)溶液、2.5ul溶于DMSO的5-溴荧光素(100mM)、以及50ul TMA产物加入165ul无RNA酶的水(Sigma)中。在涡旋仪上振荡混匀混合物,然后于60℃孵育30分钟。
孵育后,不经任何纯化,将该溶液用于在DNA芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA,美国)(又称生物芯片)上杂交和检测。用于该杂交的程序由厂家提供。这些芯片设计用于鉴定分支杆菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-415区域。结果见下表1:
表1:未经纯化标记的RNA片段的标记结果
所获分值 | 中值强度(Rfu) | 背景(Rfu) |
91.2% | 1727 | 834 |
在利用生物芯片技术进行的鉴定中,所获的鉴定百分比或分值相应于相对参考序列的分析百分比。鉴定了91.2%的序列,并且中值强度是1727Rfu。这说明在每种情况下均在片段化过程中掺入了标记物,由此产生可检测的荧光片段。同样重要的是,注意标记反应产物未经任何预先纯化直接用于与芯片的杂交。该结果是非常有趣的,它显示了未纯化的RNA转录物可通过采用咪唑和氯化锰的该片段化程序进行有效标记。
接着,我们尝试了采用上述标记程序和在与DNA芯片杂交前使用纯化步骤对实施例1-A所述的50ul和100ul(总体积)TMA反应产物进行标记。
65℃孵育后,含有50ul和100ul TMA的两个标记反应产物经1-丁醇处理以抽提出过剩的5-溴荧光素。两个实验均采用1ml水饱和的1-丁醇进行该抽提两次。与如下抽提一样,该抽提是本领域所熟知的。具体地,补充信息可见文献Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆(第二版,1.46),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。结果见下表2。这些测量在与生物芯片杂交并读取结果后进行。
表2:经纯化标记RNA片段的标记结果
TMA体积 | 所获分值 | 中值密度(Rfu) | 背景(Rfu) |
50ul | 95.9% | 6867 | 169 |
100ul | 96.7% | 5775 | 275 |
所获的鉴定百分比或分值接近100%,而且所获强度非常高。这显示杂交前的纯化步骤可提高鉴定百分比和标记强度并降低背景。很明显,任何额外的杂交后洗涤循环不再必需。
A-2.标记50ul TMA:采用30mM咪唑和30mM氯化锰的程序
在5ml聚丙烯管中,向112ul无RNA酶的水(sigma)中加入75ul咪唑溶液(0.1M)、75ul氯化锰溶液(1M)、2.5ul溶于DMSO的5-溴荧光素(100mM)、以及50ul TMA产物。混合物通过在涡旋仪上振荡混匀,并于60℃孵育30分钟。
孵育后,50ul TMA产物的两个标记反应产物用1-丁醇处理以抽提出过剩的5-溴荧光素。这些测量在与生物芯片杂交并读取结果后进行。采用1ml水饱和的1-丁醇进行该抽提两次。结果见下表3。
表3:标记RNA片段的结果,该片段标记后经过纯化
TMA体积 | 所获分值 | 中值密度(Rfu) | 背景(Rfu) |
50ul | 92.7% | 444 | 131 |
92.7%的扩增序列被鉴定,而且中值强度是444Rfu。这些结果显示采用30mM咪唑和30mM MnCl2的程序可产生标记的扩增子片段。然而,该强度水平低于采用咪唑/MnCl2=6mM/60mM的程序所获得的强度水平。
可优化该策略。对于标记反应,高浓度的金属盐无疑非常重要。在片段化过程中可采用其它金属或其它缓冲液进行该标记反应。
B-经TMA扩增后转录获得的RNA转录物的标记
按实施例1-B所述制备靶分支杆菌(330个核苷酸)16S RNA转录物。
在5ml聚丙烯管中,向165ul无RNA酶的水(sigma)中加入15ul咪唑溶液(0.1M)、15ul氯化锰溶液(1M)、2.5ul溶于DMSO的5-溴荧光素(100mM)以及50ul转录产物。混合物通过在涡旋仪上振荡混匀,并于60℃孵育30分钟。
孵育后,按实施例3(A-1)所述处理该溶液,以除去过剩的5-溴荧光素。然后在DNA芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA,美国)上进行杂交和检测,其中该芯片设计用于鉴定结核分支杆菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-415区域。结果见下表4。
表4:经TMA扩增后转录获得的RNA的标记结果
所获分值 | 中值强度(Rfu) | 背景(Rfu) |
97.6% | 1426 | 147 |
97.6%的序列被鉴定,而且中值强度是1426Rfu。该结果显示,用于标记经TMA后转录产生的RNA的片段化过程中标记策略是有效的。在该标记反应中使用的这些靶RNA转录物未经任何纯化。
C-含有硫代磷酸的PCR扩增后RNA转录物的标记:
按实施例1-D所示,通过PCR后转录反应产生靶分支杆菌(330个核苷酸)16S RNA样品,转录反应中100%的腺苷三磷酸(ATP)被替换为ATP-α-硫(进行两个实验)或100%的胞苷三磷酸(CTP)被替换为CTP-α-硫(进行一个实验)。
采用上述程序在存在咪唑和氯化锰时标记这些RNA样品。65℃孵育30分钟后,根据厂家提供的程序在DNA芯片(Afffymetrix,santaClara,CA美国)上进行该反应产物的杂交、检测和分析。结果见下表5。
表5:含有硫代磷酸的经PCR扩增后转录获得的RNA样品的标记结果
转录物 | 所获分值 | 中值强度(Rfu) |
ATP-α-硫 | 97.1% | 1186 |
100% | 1290 | |
CTP-α-硫 | 93.6% | 1027 |
在ATP-α-S的情况下97.1%和100%的序列被鉴定,在CTP-α-S的情况下93.6%的序列被鉴定。中值强度介于1000-1300Rfu。该结果显示,用于标记含硫代磷酸的RNA样品的片段化过程中标记策略是有效的,而且甚至与不含硫的核苷酸的情况一样有效。用于标记反应的这些靶RNA转录物没有进行任何纯化。
实施例5-标记天然RNA:
从分离自固体培养基的纯菌株获得细菌悬液。在无菌水中制备的该悬液标化至2 McFarland指数(即大约3×108个细菌/ml),然后在Eppendorf管中离心1分钟。
按如下方式从细菌生物质中提取RNA。将细菌沉淀重悬在100ul的裂解缓冲液(30mM Tris-HCl,5mM EDTA,100mM NaCl,2%SDS,5mg/ml蛋白酶K,pH7.3,并存在法国VIAI生产的直径100um的圆玻璃珠50ul)中进行裂解。将该混合物涡旋30秒。然后于37℃孵育15分钟。再加入100ul饱和酚。将该混合物涡旋30秒。回收水相,之后用100ul氯仿抽提。将该混合物再次涡旋30秒。再次回收水相。进行两次乙醚抽提,蒸发该溶剂。之后余下约50ul含有总RNA的水相。另外可采用Qiagen RNeasy(商标)试剂盒进行该提取。
按如下方式采用本发明所描述的技术以标记细菌生物质的总RNA,其中试剂按如下顺序加入:
-提取的总RNA(50ul),
-水(适量至100ul),
-6ul 1M咪唑(终浓度60mM),
-6ul 1M MnCl2(终浓度60mM),
-涡旋该溶液10秒,
-2ul 50mM 5-溴荧光素(终浓度1mM),
-用移液管抽吸几次以混匀该混合物,
-该混合物再次涡旋1秒,
-离心混合物1秒以将其收集在管底,然后
-该管在60℃孵育30分钟。
然后采用如下程序除去过量的游离标记物。将如下试剂加入100ul的标记混合物中:
-40ul的鲑鱼精子DNA
100ul 3M乙酸钠(终浓度610mM),pH5.2
-250ul冷异丙醇(-20℃)
涡旋该混合物,然后离心1分钟。丢弃上清。然后将沉淀重悬于杂交缓冲液(6×SSPE(盐水磷酸钠乙二胺四乙酸(EDTA)),5mM DTAB(十二烷基三甲基溴化铵),3M甘氨酸三甲内盐,0.05%Triton,250ug/ml鲱鱼精子DNA)中。
采用溴化乙锭显色1%琼脂糖凝胶上的如下样品:
●根据本发明的标记前总RNA制备物的样品(A)
●根据本发明的标记后总RNA制备物的样品(B)
溴化乙锭显色后,在紫外线(UV)灯下观察注意到如下情况:
-对于A孔,存在主要RNA种类特征性的条带,从上至下为:23S,16S,然后是相应于信使RNA群体的弥散带,
-对于B孔,在凝胶底部存在一个相应于总的片段化RNA混合物的群体。
荧光素显色后注意到如下情况:
-对于A孔,什么也没有,
-对于B孔,在凝胶底部存在一个相应于片段化的RNA混合物并共价标记了荧光素的群体,说明该RNA样品已被片段化和标记。对于下表所述的所有细菌种类均进行了该对照实验。
将以该方法标记的RNA的一样品与已通过光蚀刻技术接枝了寡核苷酸的玻璃固相支持物(生物芯片)杂交;按照A.Troesch等(临床微生物学杂志,37(1),第49-55页,1999)的文献所述相同的方法,这些寡核苷酸可鉴定这些不同菌种。结果显示于下表6。
表6:来源于不同菌种的天然RNA样品的标记结果
物种 | 国际菌株参考号 | 内部菌株参考号 | 获得的分值 |
大肠杆菌(Esherrichia coli) | ATCC11775T | 7308009 | 86.3% |
肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae) | NCTC7465T | 7804060 | 87.2% |
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) | ATCC13883T | 7308012 | 84.6% |
铜绿假单胞菌(Pseudonomonas aeruginosa) | ATCC10145 | 7309001 | 79.1% |
阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae) | ATCC13047T | 7308013 | 81% |
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) | ATCC13813 | 7701031 | 89.1% |
产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) | ATCC13182T | 9211047 | 85.5% |
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) | ATCC29935T | 9410068 | 81.5% |
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium) | --- | 9810059 | 71.3% |
生物芯片上具有最高值的菌种都是受追查的菌种;所获得的值显示于右侧栏。
对于每个菌种鉴定均正确,说明本发明的方法对于天然RNA样品和扩增技术来源的RNA样品均有效。
Claims (13)
1.标记合成核糖核酸或天然核糖核酸(RNA)的方法,其特征在于它包括:
-通过酶法、化学法或物理法非特异性地将RNA片段化,以产生多个RNA片段,和
-在位于所述RNA片段的3’端和/或5’端的末端磷酸水平上对多个所述RNA片段进行标记,所述末端磷酸是在片段化过程中释放的。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于除了构成起始RNA 3’端的片段外该RNA每个片段的3’端都进行标记,和/或除了构成起始RNA 5’端的片段外该RNA每个片段的5’端都进行标记。
3.根据权利要求2的方法,其特征在于片段化和标记在一步中实现。
4.根据权利要求2的方法,其特征在于片段化和标记在两步中实现。
5.根据权利要求2的方法,其特征在于RNA片段3’或5’端的标记通过给核糖的2’位磷酸、3’位磷酸或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个活性功能基团来实现,所述功能基团是标记所携带的或其随后能与标记相连。
6.根据权利要求2的方法,其特征在于RNA片段3’或5’端的标记通过给核糖的2’位磷酸、3’位磷酸或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个亲核、亲电子或卤化功能基团来实现,所述功能基团是标记所携带的或其随后能与至少一个标记相连。
7.根据权利要求1的方法,其特征在于RNA的酶法片段化通过核酸酶来进行。
8.根据权利要求1的方法,其特征在于RNA的化学法片段化通过结合或不结合化学催化剂的金属阳离子来进行。
9.根据权利要求8的方法,其特征在于所述金属阳离子是Mg++、Mn++、Cu++、Co++、和/或Zn++离子,而且化学催化剂是咪唑、咪唑的取代类似物、或任何对RNA具有亲合力并携带咪唑核或咪唑核的取代类似物的化学分子。
10.根据权利要求9的方法,其中所述咪唑的取代类似物为N-甲基咪唑。
11.根据权利要求1的方法,其特征在于RNA的物理法片段化是通过超声或辐射实现的。
12.根据权利要求2的方法,其特征在于RNA片段3’或5’端的标记通过给核糖的2’位磷酸、3’位磷酸或环化单磷酸2’-3’位的磷酸结合一个R-X分子来实现,其中R是标记,X是标记与RNA之间的结合基团。
13.根据权利要求12的方法,其中所述结合基团是羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤、苯基甲基卤、磺乙酰胺或马来酰亚胺基团。
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