ES2322034T3 - Procedimiento de marcado de un acido ribonucleico con purificacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de marcado de un ácido ribonucleico (ARN) sintético o natural, caracterizado porque consiste: - en fragmentar el ARN de manera no específica por vía química, para generar una pluralidad de fragmentos de ARN, y - en marcar cada fragmento de dicho ARN a nivel del fosfato terminal que ha sido liberado durante la fragmentación, estando dicho fosfato terminal situado en el extremo 3'' mediante la fijación sobre el fosfato en la posición 2'', en la posición 3'' o en la posición 2''-3'' monofosfato cíclico, con relación a la ribosa, de una función reactiva contenida por un marcador o que se puede asociar ulteriormente a un marcador, y - en purificar el producto de reacción de marcado.
Description
Procedimiento de marcado de un ácido
ribonucleico con purificación.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento de marcado de un ácido ribonucleico (ARN) sintético o
natural.
Mediante la expresión "ARN sintético" se
entiende un ARN obtenido mediante una técnica desarrollada por el
ser humano, por ejemplo una técnica de amplificación (PCR seguida de
una transcripción) o de amplificación transcripcional (TMA).
Mediante la expresión "ARN natural" se entiende un ARN obtenido
por extracción de una célula, por ejemplo un ARN mensajero,
ribosomal, de transferencia.
El estado de la técnica muestra que existen
numerosos métodos para marcar unos nucleótidos, unos
oligonucleótidos o unos ácidos nucleicos; los oligonucleótidos y
los ácidos nucleicos se designarán mediante el término de
polinucleótidos. Haciendo referencia a los oligonucleótidos, el
marcado puede efectuarse o bien durante la síntesis, o bien
mediante la incorporación de por lo menos un nucleótido marcado.
Un primer método consiste en fijar el marcador
sobre la base, ya sea natural o modificada. Un segundo método
propone fijar el marcador sobre el azúcar, en este caso también ya
sea natural o modificado. Un tercer método tiene por objeto la
fijación del marcador sobre el fosfato.
El marcado sobre la base se ha usado en
particular en el enfoque de marcado de los ácidos nucleicos por la
incorporación de nucleótidos directamente marcados.
El marcado sobre el azúcar se usa frecuentemente
en el caso de las sondas nucleicas preparadas por síntesis
química.
El marcado sobre el fosfato se ha usado asimismo
para introducir unos brazos funcionalizados y unos marcadores
durante la síntesis química de los polinucleótidos.
De hecho, el experto en la materia que debe
efectuar un marcado de un nucleótido o de un análogo de nucleótido
o de un ácido nucleico, es propenso a efectuar esta fijación sobre
la base o sobre el azúcar que le ofrece más comodidad y
alternativa. Por otro lado, es lo que se desprende del estudio de
numerosos documentos, tales como
EP-A-0.329.198,
EP-A-0 302 175,
EP-A-0 097 373,
EP-A-0 063 879,
US-A-5.449.767,
US-A-5.328.824,
WO-A-93/16094,
DE-A-3 910 151,
EP-A-0 567 841 para la base o
EP-A-0 286 898 para el azúcar.
Sin embargo, estas técnicas adolecen de ciertos
inconvenientes, de los cuales los dos principales son la molestia
estérica y la influencia generada por la presencia de un
marcador.
En el caso de un marcado efectuado sobre la
base, la molestia estérica se debe a la superposición del marcador
sobre el espacio en el que está presente una base cercana, o bien
contenida por un nucleótido adyacente de la misma hebra o por la
hebra complementaria. Asimismo, resulta bastante evidente que la
presencia del marcador sobre la base puede molestar la eficacia y
la especificidad, durante la incorporación enzimática, y puede
influir en la calidad de las uniones hidrógeno entre las dos hebras
complementarias, lo que puede perjudicar a la hibridación.
En el caso de un marcado sobre el azúcar, la
molestia estérica se debe a la superposición del marcador sobre el
espacio en el que está presente un azúcar adyacente contenido por la
misma hebra. Esta presencia del marcador puede alejar dos bases
adyacentes contenidas por la misma hebra e impedir, como
consecuencia, la buena hibridación con la hebra complementaria,
debido a que las uniones hidrógeno no son óptimas entre las
hebras.
La fijación del marcador sobre el fosfato es una
técnica más compleja que la técnica que consiste en funcionalizar
la base o el azúcar.
Sin embargo, en algunos documentos, se han
propuesto unas técnicas de marcado del fosfato. Por ejemplo es el
caso del documento EP-A-0 285 058,
que describe el marcado de un nucleótido mediante la fijación del
marcador sobre el fosfato, siendo este último fijado sobre el
azúcar en la posición 2' y/o 5' cuando el nucleótido es un
desoxirribonucleótido, y en la posición 2', 3' y/o 5' cuando el
nucleótido es un ribonucleótido. Se describe asimismo un
polinucleótido u oligonucleótido que comprende por lo menos un
nucleótido marcado como se ha descrito anteriormente; este
nucleótido está incorporado en el polinucleótido o el
oligonucleótido durante la síntesis.
Sin embargo, el marcado, propuesto por el
documento EP-A-0 285 058, no permite
obtener un marcado uniforme de los ácidos nucleicos. En efecto, la
incorporación de los nucleótidos marcados en los polinucleótidos no
se puede controlar, y depende totalmente de la composición en
polinucleótidos que se sintetizará. Así, algunos polinucleótidos
pueden contener numerosos nucleótidos marcados mientras que otros
pueden no contener ninguno. La intensidad de la señal emitida por
estos ácidos nucleicos no será por lo tanto uniforme, lo que corre
el riesgo de dificultar la interpretación de los resultados durante
su detección.
\newpage
En este caso, el marcado es un marcado biológico
por incorporación, en la que no se controla la posición de los
nucleótidos marcados.
La patente US nº 5.573.913 describe el marcado
de un ácido ribonucleico, según el cual se incorpora en dicho ácido
unos desoxinucleótidos portadores de un marcador no radioactivo,
estando por lo menos uno de estos desoxinucleótidos fijado sobre el
extremo 3' por la acción de la transferasa terminal.
El documento
US-A-5.317.098 se refiere a unos
ácidos nucleicos que están marcados en su extremo 5'. Esta fijación
usa el imidazol y un brazo de unión. No existe ninguna fragmentación
asociada. Además, se añade el fosfato, y por lo tanto se usa
quinasa.
El documento
WO-A-96/28460 describe el marcado de
ácidos nucleicos, en particular de ARN, por incorporación en el
extremo de fragmentos de ARN, de derivados de nucleósidos que sirven
de sustrato a la ARN polimerasa.
Sin embargo y lógicamente, habrá presencia de un
fosfato en cada extremo libre del ácido nucleico, lo que induce por
lo menos una etapa suplementaria. Este marcado no está asociado a
una fragmentación.
Además, en lo referente a los documentos
anteriores, el marcado se lleva a cabo sobre unos ácidos nucleicos
de grandes tamaños. En efecto, no se ha descrito ninguna fase de
fragmentación, asimismo denominada fase de escisión, antes de las
etapas de marcado. Así, cuando se hibridan estos ácidos nucleicos
diana sobre unas sondas de captura, los dúplex formados después de
la hibridación no son estables. Asimismo, es el caso cuando los
polinucleótidos se usan como sondas de detección. Las razones pueden
deberse a la molestia estérica o a la falta de especificidad entre
el polinucleótido, que se ha sintetizado, y su diana, que no tiene
obligatoriamente el mismo tamaño. Por lo tanto, habrá una pérdida
cuantitativa y cualitativa de la señal.
La molestia estérica puede deberse no sólo a la
longitud del ácido nucleico, sino también a la existencia o a la
conservación de estructuras secundarias. La fragmentación permite
destruir estas estructuras y optimizar así la hibridación. Esta
molestia estérica desempeña una función particularmente importante
en el caso de la hibridación sobre unas superficies que contienen
unas sondas de captura de fuerte intensidad, por ejemplo los chips
de ADN desarrollados por la compañía Affymetrix ("Accessing
Genetic Information with High-Density DNA
arrays", M. Shee et al., Science, 274,
610-614. "Light-generated
oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A.
Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91,
5022-5026). En esta tecnología, las sondas de
captura son generalmente de tamaños reducidos, aproximadamente de
veinte nucleótidos.
En lo referente a la fragmentación de los ácidos
nucleicos, se describen numerosos métodos en el estado de la
técnica.
En primer lugar, la fragmentación puede ser
enzimática, es decir, que la fragmentación de ácidos nucleicos se
puede llevar a cabo mediante unas nucleasas (ADNasas o ARNasas). Se
generan entonces unos fragmentos de tamaños pequeños con unos
extremos 3'-OH, 5'-OH,
3'-fosfato, 5'-fosfato. Según Tung
et al., PNAS USA (1992) 89, 7114-7118, se
describe un tripéptido que imita el sitio activo de la ARNasa. M.
Rosenberg, Nucleic Acids Research, vol. 1. nº 5, mayo de 1974,
páginas 653-670, se refiere a la obtención de
fragmentos del extremo 3' de ARN, obtenidos por fragmentación
enzimática de un ácido ribonucleico radiomarcado.
En segundo lugar, la fragmentación puede ser
química. Por ejemplo en el caso de los ADN, se puede llevar a cabo
la despurinación o la despirimidinación de los ADN, que se
fragmentan entonces en presencia de una base por un mecanismo
denominado de "\beta-eliminación". La
fragmentación de los ADN se puede llevar a cabo mediante unos
mecanismos de oxidación, de alquilación, de adición de radicales
libres, entre otros. Para fragmentar los ARN, se usan unos cationes
metálicos frecuentemente asociados con unas moléculas orgánicas
usadas como catalizadores químicos, por ejemplo el imidazol. Esta
fragmentación se usa preferentemente en un medio alcalino y genera
unos fragmentos con unos extremos 3'-fosfato. Así,
según R. Breslow et al., PNAS USA (1993) 90,
1201-1207, se describe la fragmentación de ARN por
unos tampones de imidazol, según Modak et al. J. Am. Chem.
Soc. (1991) 113, 283-291, se describe la
fragmentación de ARN mediante unos complejos con cobre (11) de
conjugados nucleósido-bipiridina que actúan mediante
la hidrólisis de las uniones de fosfodiéster; según Yoshinari et
al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113, 5899-5901, se
demuestra la actividad hidrolítica de oligoaminas sobre ARN.
Sin embargo, estas fragmentaciones no tienen por
objeto facilitar o permitir el marcado.
El documento
WO-A-88/04300 propone un método que
permite la fragmentación y el marcado de ARN, efectuándose la
fragmentación por medio de unos ARN que tienen unas propiedades
enzimáticas, las ribozimas. Esta fragmentación mediante las
ribozimas libera para cada corte un extremo (5') HO-ácido nucleico y
un extremo (3') HO-PO_{2}-ácido nucleico. El
marcado, que es únicamente radioactivo, se efectúa a continuación
por medio de una enzima de incorporación (quinasa) que permite la
incorporación de un fosfato radioactivo añadido, que procede de una
molécula de \gamma-GTP. Esta fijación se lleva a
cabo únicamente a nivel del extremo 5'. Además, la fragmentación se
realiza únicamente mediante unas ribozimas, lo que implica que
existe una especificidad entre éstas y los ácidos nucleicos diana a
cortar. El fosfato actúa entonces como marcador.
\newpage
La invención permite una fijación de un marcador
a nivel sólo del fosfato, de un fragmento de ácido nucleico,
liberado durante el corte. No existe ninguna especificidad, pudiendo
realizarse la fragmentación sobre cualquier tipo de ácido nucleico
y de manera aleatoria. De hecho, el procedimiento permite por
ejemplo la preparación de una sonda de detección. Por último, el
fosfato es sólo un brazo de unión entre el ácido nucleico y el
marcador.
No se ha descrito en la técnica anterior ningún
procedimiento de fragmentación antes del marcado en una o dos
etapas.
La presente invención propone por lo tanto un
procedimiento que evita los inconvenientes citados anteriormente.
En efecto, permite obtener un marcado uniforme de los fragmentos de
ARN, una vez terminada la fragmentación. Además, la fragmentación
permite obtener unos fragmentos de un tamaño óptimo para una
eventual hibridación. Al ser la hibridación de mejor calidad, la
revelación de esta hibridación será más rápida y eficaz.
Por el término "marcado", se entiende la
fijación de un marcador capaz de generar directa o indirectamente
una señal detectable. A continuación, se proporciona una lista no
limitativa de estos marcadores:
- \bullet
- las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo, por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, tal como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la \alpha-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato de deshidrogenasa,
- \bullet
- los cromóforos tales como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,
- \bullet
- los grupos de densidad electrónica detectable por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas tales como la conductividad, la amperometría, la voltametría, la impedancia,
- \bullet
- los grupos detectables, por ejemplo cuyas moléculas son de tamaño suficiente para inducir unas modificaciones detectables de sus características físicas y/o químicas, pudiendo esta detección realizarse mediante unos métodos ópticos tales como la difracción, la resonancia de plasmón de superficie, la variación de superficie, la variación de ángulo de contacto, o unos métodos físicos tales como la espectroscopía de fuerza atómica, el efecto túnel,
- \bullet
- las moléculas radioactivas tales como el ^{32}P, el ^{35}S o el ^{125}I.
Asimismo, se pueden usar unos sistemas
indirectos tales como, por ejemplo, unos ligandos capaces de
reaccionar con un anti-ligando. Los pares
ligando/anti-ligando son bien conocidos por el
experto en la materia, lo que es el caso, por ejemplo, de los
siguientes pares: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo,
antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectinas,
polinucleótido/complementario del polinucleótido. En este caso, es
el ligando el que contiene el agente de unión. El
anti-ligando se puede detectar directamente por los
marcadores descritos en el párrafo anterior o detectar en sí mismo
por un ligando/anti-ligando.
Estos sistemas de detección indirectos pueden
conducir, en ciertas condiciones, a una amplificación de la señal.
Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por el
experto en la materia, y se puede hacer referencia a las
solicitudes de patente anteriores FR-2 781 802
(FR98/10084) o WO-A-95/08000 del
solicitante, o al artículo J. Histochem. Cytochem. 45:
481-491, 1997.
Con este fin, la presente invención se refiere a
un procedimiento de marcado de un ácido ribonucleoico (ARN)
sintético o natural, caracterizado porque consiste:
- -
- en fragmentar el ARN, y
- -
- en marcar a nivel del fosfato terminal situado en el extremo 3' de cada fragmento de dicho ARN, dicho fosfato terminal que ha sido liberado durante la fragmentación.
Según un modo preferido de funcionamiento, el
marcado del extremo 3' de cada fragmento del ARN se efectúa para
cada fragmento con la excepción del fragmento que constituye el
extremo 3' del ARN de partida.
Según un primer modo de realización, la
fragmentación y el marcado se efectúan en una etapa.
Según un segundo modo de realización, la
fragmentación y el marcado se efectúan en dos etapas.
Sea cual sea el modo de realización, el marcado
del extremo 3' de un fragmento de ARN se efectúa por fijación,
sobre el fosfato en posición 2', en posición 3' o en posición
2'-3'-monofosfato cíclico, con
relación a la ribosa, de una función reactiva contenida por un
marcador o que puede asociarse ulteriormente a por lo menos un
marcador. Cuando existen por lo menos dos marcadores, se trata de
una técnica de amplificación de la señal.
La fragmentación y/o el marcado del extremo 3'
de un fragmento de ARN se efectúa por fijación, sobre el fosfato en
posición 2', en posición 3' o en posición
2'-3'-monofosfato cíclico, con
relación a la ribosa, de una función nucleófila, electrófila,
halogenuro contenida por un marcador o que puede asociarse
ulteriormente a un marcador.
La fragmentación del ARN se efectúa por vía
química.
Se describen las vías enzimática y física que no
forman parte de la invención.
La fragmentación por vía enzimática del ARN se
realiza mediante unas nucleasas.
La fragmentación por vía química del ARN se
realiza mediante unos cationes metálicos asociados o no a un
catalizador químico.
En este caso, los cationes metálicos son unos
iones Mg^{++}, Mn^{++}, Cu^{++}, Co^{++} y/o Zn^{++}, y
el catalizador químico está constituido por imidazol, un análogo
sustituido, por ejemplo el
N-metil-imidazol, o cualquier
molécula química que tiene una afinidad para el ARN y que contiene
un núcleo imidazol o un análogo sustituido.
La fragmentación por vía física del ARN se lleva
a cabo mediante sonicación o mediante radiación.
En todos los casos, el marcado del extremo 3' de
un fragmento de ARN se lleva a cabo por fijación, sobre el fosfato
unido en la posición 2', en la posición 3' o en la posición
2'-3'-monofosfato cíclico de la
ribosa, de una molécula R-X, en el que R está
constituido por el marcador y X es el agente de unión entre el
marcador y el ARN, tal como un grupo hidroxilo, amina, hidrazina,
alcoxilamina, halogenuro de alquilo, halogenuro de
fenil-metilo, yodoacetamida, maleimida.
La presente descripción se refiere asimismo a un
fragmento de ARN obtenido mediante el procedimiento, según las
características expuestas anteriormente, comprendiendo dicho
fragmento de ARN, por un lado, un único nucleótido marcado a nivel
del fosfato terminal situado en el extremo 3' del fragmento de ARN,
habiéndose liberado dicho fosfato terminal durante la fragmentación
y, por otro lado, por lo menos otro nucleótido cuya base (púrica:
adenina/guanina o pirimídica: uracilo/citosina) es idéntica a la del
nucleótido marcado.
Este fragmento de ARN comprende de 10 a 100
nucleótidos, preferentemente de 30 a 70 y más preferentemente de 40
a 60 nucleótidos. El fragmento de ARN puede comprender por lo menos
un nucleótido tiofosfato.
Además, el nucleótido marcado es un nucleótido
tiofosfato.
La descripción se refiere al uso de un fragmento
de ARN, tal como se ha definido anteriormente, como sonda de
detección de un ARN y/o de un ADN o de un fragmento de ARN y/o de
ADN.
La descripción se refiere por último al uso de
un fragmento de ARN, tal como se ha definido anteriormente, como
diana marcada que puede fijarse sobre una sonda de captura.
Las figuras adjuntas muestran diferentes modos
de síntesis de fragmentos de ARN marcados según la invención, así
como los fragmentos así obtenidos. Representan unos modos
particulares de realización y no se pueden considerar como
limitativos del alcance de la presente invención.
La figura 1 representa una vista esquemática de
la fragmentación química de un ARN en presencia de cationes
Mn^{++} y de imidazol.
La figura 2 representa una vista esquemática de
la fragmentación y del marcado de un ARN por un marcador que
contiene una función nucleófila.
La figura 3 representa un marcador que se puede
utilizar con el procedimiento expuesto en la figura 2, estando este
marcador constituido por
fluoresceína-cadaverina.
La figura 4 representa un marcador que se puede
utilizar con el procedimiento expuesto en la figura 2, estando este
marcador constituido por fluoresceína-hidrazida.
La figura 5 representa un marcador halogenado
que se puede utilizar con el procedimiento según la invención.
La figura 6 representa una vista esquemática del
extremo 3' de un fragmento de ARN obtenido mediante un procedimiento
según la presente invención, en el que el marcador se fija sobre un
fosfato natural, siendo Z un brazo de unión, denominado asimismo
brazo espaciador, tal como se ha definido en una solicitud de
patente anterior del solicitante presentada el 1 de agosto de 1997,
y publicada con el número
WO-A-98/05766 (PCT/FR94/01445).
Esta definición de Z es válida asimismo para las figuras 7 y 8.
La figura 7 representa una vista esquemática del
extremo 3' de un fragmento de ARN obtenido mediante un procedimiento
según la presente invención, en el que el marcador se fija sobre un
tiofosfato.
Por último, la figura 8 representa una vista
esquemática del extremo 5' de un fragmento de ARN obtenido mediante
un procedimiento según la presente invención, en el que el marcador
se fija sobre un fosfato natural.
El procedimiento descrito en las figuras puede
ser de una etapa, tal como es el caso en la figura 2 en el que la
fragmentación y el marcado se llevan a cabo conjuntamente por un
nucleófilo marcado.
El procedimiento se puede llevar a cabo asimismo
en dos etapas. Una primera etapa de fragmentación según la figura
1, mediante la acción del imidazol por ejemplo. Por último, una
segunda etapa de marcado por medio de un marcador, representado de
manera no limitativa en las figuras 3 a 5; dicho marcado se efectúa
sobre el fosfato liberado, y se expone en las figuras 6 a 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los amplicones naturales (ARN monocatenario) se
preparan usando la técnica de amplificación TMA
(Transcription-Mediated Amplification) desarrollada
por Gen Probe (San Diego, CA). La hebra de ARN amplificada
corresponde a la secuencia 16S de los ribosomas de Mycobacterium
tuberculosis (ATCC - 27294). El ARN 16S se ha clonado en un
plásmido y se ha transformado en unas bacterias procedentes del kit
TA Cloning Dual Promoter (Ref.: K2050-01-
Invitrogen, Groningen, Países Bajos). Después del cultivo en medio
LB (descrito por ejemplo en Maniatis) y de la extracción del ADN
bacteriano por lisis alcalina, la hebra se ha transcrito mediante el
kit "Ampli Scribe T7 Transcription" (Ref.: AS 2607 - Epicentre
Technologies (Madison, WI)). El número de copias por microlitro se
ha determinado mediante la medición de la absorbancia a 260 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Conviene observar en primer lugar que el
producto de amplificación TMA contiene, además de los ARN, unos
amplicones ADN, en una proporción de sustancialmente 90% por 10% de
ADN. Son estos amplicones ADN los que se han usado asimismo para
producir unos ARN monocatenarios mediante transcripción in
vitro.
Se han obtenido en primer lugar en una primera
etapa unos amplicones con el kit Mycobacterium Tuberculosis
Direct (MTD) de Gen Probe (Ref.: 1001E), de la misma manera que
anteriormente según el protocolo descrito en la etapa
1-A anterior.
En una segunda etapa, se ha realizado la
transcripción sobre una matriz ADN obtenida por TMA de la primera
etapa, a partir de una matriz ARN 16S de Mycobacterium
tuberculosis.
La transcripción se ha llevado a cabo a partir
de 5 \mul de productos TMA usando el kit MEGAscript T7 (AMBION,
Austin, TX, Ref.: 1334). La reacción ha tenido lugar durante una
hora a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de un aislado bacteriano
(ATCC-27294), cultivado sobre un medio
Lowenstein-Jensen, se han recogido una o dos
colonias (3-5 mm de diámetro equivalente a 10^{8}
bacterias) con la ayuda de una espátula y se han resuspendido en
250 \mul de agua estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Los
ácidos nucleicos han sido extraídos del material celular de la
suspensión bacteriana mediante agitación fuerte por medio de un
vórtex en presencia de bolas de vidrio. Una extracción de este tipo
se describe en las solicitudes de patente FR-2 768
743 (FR97/12164) del 23 de septiembre de 1997, y
FR-2 781 500 (FR98/09583) del 23 de julio de 1998
presentadas por el solicitante.
Se ha añadido una alícuota de 5 \mul del
lisado directamente a la reacción de PCR. Es posible asimismo añadir
20 ng de ADN plasmídico directamente a la reacción de PCR.
La región 16S hipervariable se ha amplificado
mediante PCR usando unos cebadores específicos de tipo
Mycobacterium (posiciones 213-236 y
394-415 en la secuencia de referencia de M.
tuberculosis, M20940, Genbank), siendo el tamaño del amplicón
de 202 pares de bases (pb). Los cebadores contienen asimismo unas
secuencias de promotores de bacteriófago T3 o T7 en su extremo 5'.
En la representación de los cebadores siguiente, la secuencia de
los promotores está en letras minúsculas y en negrita, mientras que
la secuencia de las micobacterias está en mayúsculas:
- T3 -
- M1 5'-aattaaccctcactaaagggAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCA
- T7 -
- M2 5'-gtaatacgactcactatagggcTGTGGCCGGACACCCTCTCA
La PCR se ha realizado en un volumen de reacción
de 100 \mul que contiene 50 mM de KCl, 10 mM de Tris, pH = 8,3,
1,5 mM de MgCl_{2}, 0,001% (m/v) de gelatina, 5% (v/v) de DMSO,
0,5 \muM de cada cebador, 200 \muM de cada uno de los cuatro
desoxinucleótidos trifosfato, y 1,5 unidades de polimerasa Taq
(AmpliTaq, Perkin-Elmer, Norwalk, CT). La reacción
de PCR se ha llevado a cabo en un termociclador 2400
Perkin-Elmer (Norwalk, CT) con una etapa inicial de
desnaturalización a 94ºC de 5 minutos (mn), y 35 ciclos de 45
segundos (s) a 94ºC, 30 s a 60ºC, 30 s a 72ºC, seguidos de 10 mn a
72ºC después del último ciclo. Los productos de la reacción de PCR
se analizaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa.
Los amplicones que contienen los promotores han
sido usados para producir unos ARN monocatenarios mediante
transcripción in vitro. Cada reacción de un volumen de 20
\mul contiene aproximadamente 50 ng de productos PCR, 20 unidades
de polimerasa T3 o T7 (Promega, Madison, WI), 40 mM de tampón
Tris-acetato, pH = 8,1, 100 mM de acetato de
magnesio [Mg(AcO)_{2}], 10 mM de DTT, 1,25 mM de
cada nucleótido trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP). La reacción ha
tenido lugar durante una hora a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los amplicones obtenidos por PCR, según la etapa
1-C anterior, que contienen los promotores se han
usado para producir unos ARN monocatenarios que contienen unos
tiofosfatos mediante transcripción in vitro. Cada reacción
de un volumen de 20 \mul contiene entonces aproximadamente 50 ng
de productos PCR, 20 unidades de polimerasa T3 o T7 (Promega,
Madison, WI), 40 mM de tampón Tris-acetato, pH =
8,1, 100 mM de acetato de magnesio [Mg(AcO)_{2}],
10 mM de DTT, 1,25 mM de cada tipo de nucleótidos trifosfato o
tiofosfato (ATP-\alpha-tiofosfato
(ATP-\alpha-S) o
CTP-\alpha-tiofosfato
(CTP-\alpha-S)) según dos
disoluciones diferentes:
- -
- ATP-\alpha-S, CTP, GTP y UTP, o
- -
- ATP, CTP-\alpha-S, GTP y UTP
La reacción ha tenido lugar durante una hora a
37ºC.
El nucleótido tiofosfato usado estaba presente
al 100% de los 1,25 mM, sustituyendo por lo tanto el nucleótido
natural correspondiente. En cada caso, el producto de transcripción
ha sido analizado mediante electroforesis sobre gel de
poliacrilamida al 6% en presencia de urea 7M. Después de la
coloración con bromuro de etidio, el tamaño del transcrito se
controla y se cuantifica con relación a un estándar depositado sobre
el gel.
Los nucleótidos
ATP-\alpha-S y
CTP-\alpha-S se obtuvieron de
N&N Life Science Products (Boston, MA - USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La fragmentación química de los ARN está
catalizada frecuentemente por unos cationes metálicos (Mn^{++},
Mg^{++}, etc.) que, uniéndose al grupo fosfato, neutralizan la
carga negativa del oxígeno y facilita así el ataque nucleófilo
sobre el fosfato por el hidroxilo en la posición 2' de la
ribosa.
Este ataque nucleófilo se puede reforzar por la
presencia de moléculas que son donantes y aceptoras de protones,
tales como el núcleo imidazol (R. Breslow y R. Xu, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90, 1201-1207, 1993), tal como se
representa en la figura 1.
La fragmentación se puede llevar a cabo a
diferentes temperaturas y en diferentes condiciones. Según la
descripción siguiente, se realizaron dos tipos de fragmentaciones
diferentes.
Puede existir una fragmentación a 60ºC. En este
caso, los transcritos ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis,
denominados a continuación micobacterias, que comprenden 330
nucleótidos (aproximadamente 66 pmoles), se incuban en una
disolución acuosa de imidazol (30 mM) y de cloruro de manganeso (30
mM) a 60ºC durante 30 mn. El volumen total de la disolución de
fragmentación es de 100 \mul. El ARN fragmentado se analiza
después sobre gel de poliacrilamida (6X, urea 7M) y se tiñe con
bromuro de etidio.
Puede existir asimismo una fragmentación a 95ºC.
Entonces, los transcritos ARN 16S de 330 nucleótidos (66 pmoles)
micobacterias se incuban en una disolución acuosa de cloruro de
magnesio (30 mM) a 95ºC durante 30 mn. El volumen total de la
disolución de fragmentación es de 100 \mul. El ARN fragmentado se
analiza después sobre gel de poliacrilamida (6X, urea 7M) y se tiñe
con bromuro de etidio.
En los dos tipos de fragmentación, el análisis
sobre gel muestra la desaparición del producto de partida y la
aparición de varios fragmentos más cortos, cuya población más
importante tiene un tamaño comprendido entre 20 y 50
nucleótidos.
Son estos dos protocolos los que se han usado
para introducir un marcador fluorescente sobre la cadena de ARN
durante su fragmentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una función más nucleófila que el hidroxilo, en
la posición 2' de la ribosa, puede atacar el fosfato neutralizado y
permitir así la fragmentación de la cadena de ARN generando unos
fragmentos unidos a esta función, a través del grupo fosfato. Según
la figura 2, esta función puede estar unida a un marcador para
generar unos fragmentos de ARN marcados.
La fluoresceína-cadaverina,
expuesta en la figura 3, que contiene una función amina, y la
fluoresceína-hidrazida, detallada en la figura 4,
que contiene una función hidrazida, se han usado para marcar un ARN
16S (330 nucleótidos) de micobacterias, durante la fragmentación a
65ºC. Dichos ARN se han obtenido según el ejemplo 1B.
La fluoresceína cadaverina y la fluoresceína
hidrazida se han solubilizado en DMF a una concentración final de
7,5 mM. Proceden de Molecular Probes (Eugene, OR, USA).
A la diana de ARN 16S (66 pmoles) en disolución
en el tampón de fragmentación a 65ºC (ejemplo 2), se añadió 1
\mul de la disolución de marcador (7,5 mM en DMF). Después de la
incubación a 65ºC durante 30 minutos, cada producto de reacción se
ha hibridado, detectado y analizado sobre un chip de ADN
(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) según el protocolo indicado por
el fabricante. Estos chips están concebidos para la identificación
de una región particular, y en el presente caso de la región
213-415 de la secuencia M20940 "Genbank" del
ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis. En el caso de la
fluoresceína cadaverina o de la fluoresceína hidrazida, la
secuencia se ha encontrado al 66%. Esto indica que en cada caso el
marcador se ha introducido durante la fragmentación generando así
unos fragmentos fluorescentes y detectables. Dicha identificación se
describe en el artículo de A. Troesch et al., J. Clin
Microbiol., 37(1), p. 49-55, 1999.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se sabe que un monofosfato puede estar
sustituido por un marcador que contiene un grupo halogenuro de
fenil-metilo (véase T. Furuta et al., J.
Chem. Soc. Perkin Trans. 1 3139-3142, 1993). La
5-bromo-fluoresceína, representada
en la figura 5, pertenece a esta categoría de marcadores
halogenados.
Sabiendo que la reacción de fragmentación libera
unos extremos 3'-monofosfato cíclico, en equilibrio
con las formas abiertas, la etapa de fragmentación puede servir
para unir un marcador a los grupos fosfato en 3' de los fragmentos
ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han preparado unos amplicones ARN 16S (330
nucleótidos) de micobacterias mediante amplificación TMA, tal como
se describe en el ejemplo 1-A. La
5-bromo-fluoresceína se ha obtenido
de Molecular Probes (Eugene, OR, USA). El cloruro de manganeso se
ha obtenido de Sigma y el imidazol de Aldrich.
\vskip1.000000\baselineskip
A 165 \mul de agua RNase free (Sigma), en un
tubo de polipropileno de 5 ml, cuyas dimensiones son de 12 mm de
diámetro por 75 mm de longitud, se añaden 15 \mul de una
disolución de imidazol (0,1 M), 15 \mul de una disolución de
cloruro de manganeso (1 M), 2,5 \mul de
5-bromofluoresceína (100 mM) en DMSO y después 50
\mul de productos TMA. La mezcla se homogeneiza mediante agitación
en un vórtex y se incuba a 60ºC durante 30 mn.
Después de la incubación, se ha usado la
disolución sin ninguna purificación para la hibridación y la
detección sobre chip de ADN (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA),
asimismo denominado biochip. El protocolo usado para esta etapa de
hibridación es el indicado por el fabricante. Estos chips están
concebidos para la identificación de la región
213-415 de la secuencia M20940 "Genbank" del
ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis. Los resultados se
proporcionan en la tabla 1 siguiente:
El porcentaje de identificación o de puntuación
obtenida corresponde, en la identificación mediante la tecnología
del biochip, a un porcentaje de análisis con relación a la secuencia
de referencia. La secuencia se identifica al 91,2% y la intensidad
mediana es de 1.727 Rfu. Esto indica que en cada caso el marcador ha
sido introducido durante la fragmentación generando así unos
fragmentos fluorescentes y detectables. Es importante asimismo
observar que el producto de reacción de marcado ha sido hibridado
directamente sobre el chip sin ninguna purificación previa. Este
resultado es muy interesante y demuestra que unos ARN transcritos no
purificados pueden ser marcados de manera eficaz por este protocolo
de fragmentación que usa el imidazol y el cloruro de manganeso.
En un segundo tiempo, se ha intentado el marcado
de 50 \mul y después de 100 \mul (volumen total) de una
reacción TMA descrita en el ejemplo 1-A, usando el
protocolo de marcado descrito anteriormente y una etapa de
purificación antes de la hibridación sobre el chip de ADN.
Después de la incubación a 65ºC, los dos
productos de reacción de marcado que contienen 50 \mul y 100
\mul de TMA han sido tratados con butanol-1 para
extraer el exceso de 5-bromofluoresceína. Esta
extracción se ha realizado con dos veces 1 ml de
butanol-1 saturado en agua. Dicha extracción, al
igual que las siguientes, es bien conocida en el estado de la
técnica. Unas Informaciones complementarias se pueden encontrar en
el documento Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning
(Segunda edición, 1.46) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Los resultados se proporcionan en la tabla 2 siguiente. Estas
mediciones se llevan a cabo después de la hibridación y de la
lectura sobre el biochip.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de identificación o puntuación
obtenida es próximo al 100%, y las intensidades obtenidas son muy
elevadas. Esto demuestra que una etapa de purificación antes de la
hibridación puede mejorar los porcentajes de identificación, las
intensidades de marcado y reducir el ruido de fondo. En efecto, unos
eventuales ciclos de lavado post-hibridación
suplementarios ya no son necesarios.
\vskip1.000000\baselineskip
A 112 \mul de agua RNase free (Sigma) en un
tubo de polipropileno de 5 ml, se añaden 75 \mul de una disolución
de imidazol (0,1 M), 7,5 \mul de una disolución de cloruro de
manganeso (1 M), 2,5 \mul de 5-bromofluoresceína
(100 mM) en DMSO y después 50 \mul de productos TMA. La mezcla se
homogeneiza mediante agitación en el vórtex y se incuba a 60ºC
durante 30 mn.
Después de la incubación, los dos productos de
reacción de marcado sobre 50 \mul de productos TMA han sido
tratados con butanol-1 para extraer el exceso de
5-bromofluoresceína. Estas mediciones se llevan a
cabo después de la hibridación y de la lectura sobre el biochip.
Esta extracción se ha realizado con dos veces 1 ml de
butanol-1 saturado en agua. Los resultados se
proporcionan en la tabla 3 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia amplificada se identifica al 92,7%,
y la intensidad mediana es de 444 Rfu. Estos resultados demuestran
que el protocolo que usa 30 mM de imidazol y 30 mM de MnCl_{2}
produce unos fragmentos de amplicón marcados. Sin embargo, el nivel
de intensidad es inferior al obtenido con el protocolo
imidazol/MnCl_{2} = 6 mM/60 mM.
Esta estrategia se puede optimizar. La
concentración elevada en sal metálica es seguramente muy importante
para la reacción de marcado. Se pueden usar otros metales u otros
tampones para realizar esta reacción de marcado durante la
fragmentación.
Se prepararon mediante transcripción unas dianas
de ARN transcritos 16S (330 nucleótidos) de micobacterias, tal como
se describe en el ejemplo 1-B.
A 165 \mul de agua RNase free (Sigma) en un
tubo de polipropileno de 5 ml, se añaden 15 \mul de una disolución
de imidazol (0,1 M), 15 \mul de una disolución de cloruro de
manganeso (1 M), 2,5 \mul de 5-bromofluoresceína
(100 mM) en DMSO y después 50 \mul de productos de transcripción.
La mezcla se homogeneiza mediante agitación en un vórtex y se
incuba a 60ºC durante 30 mn.
Después de la incubación, la disolución se ha
tratado tal como se describe en el ejemplo 4 (A - 1) para eliminar
el exceso de 5-bromofluoresceína. Se han realizado a
continuación la hibridación y la detección sobre el chip de ADN
(Afflymetrix, Santa Clara, CA, USA), concebido para la
identificación de la región 213-415 de la secuencia
M20940 "Genbank" del ARN 16S de Mycobacterium
tuberculosis. Los resultados se proporcionan en la tabla 4
siguien-
te.
te.
La secuencia se identifica al 97,6% y la
intensidad mediana es de 1.426 Rfu. Este resultado demuestra que la
estrategia de marcado durante la fragmentación usada para marcar
unos ARN producidos por transcripción post-TMA es
eficaz. Estas dianas de ARN transcritos se usan en la reacción de
marcado sin ninguna purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han producido mediante unas reacciones de
transcripción post-PCR unas dianas ARN 16S (330
nucleótidos) de micobacterias en las que el 100% de la adenina
trifosfato (ATP) ha sido sustituida por
ATP-\alpha-tio (se han realizado
dos manipulaciones) o bien el 100% de la citidina trifosfato (CTP)
ha sido sustituida por
CTP-\alpha-tio (se ha realizado
una manipulación), tal como se indica en el ejemplo
1-D.
Estos ARN han sido marcados usando el protocolo
descrito anteriormente en presencia del imidazol y del cloruro de
manganeso. Después de la incubación a 65ºC durante 30 mn, el
producto de reacción se ha hibridado, se ha detectado y se ha
analizado sobre un chip de ADN (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)
según el protocolo indicado por el fabricante. Los resultados se
proporcionan en la tabla 5 siguiente.
Las secuencias se identifican al 97,1 y 100% en
el caso de ATP-\alpha-S y al 93,6%
en el caso de CTP\alpha-S. Las intensidades
medias están comprendidas entre 1.000 y 1.300 Rfu. Este resultado
demuestra que la estrategia de marcado durante la fragmentación
usada para marcar unos ARN que contienen unos tiofosfatos es eficaz,
incluso tan eficaz como para marcar unos nucleótidos que no
contienen azufre. Estas dianas de ARN transcritos se usan en la
reacción de marcado sin ninguna purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Una suspensión bacteriana se obtiene a partir de
una cepa pura aislada en un medio sólido. Esta suspensión llevada a
cabo en agua estéril se estandariza a un índice de 2 MacFarland (es
decir, aproximadamente 3\cdot10^{8} bacterias/ml) y después se
centrífuga en tubo Eppendorf durante 1 mn.
El ARN se extrae de la biomasa bacteriana de la
siguiente manera. El residuo bacteriano se lisa mediante
resuspensión en 100 \mul de tampón de lisis
(Tris-HCl 30 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, SDS 2%,
proteinasa K 5 mg/ml, pH 7,3, en presencia de 50 \mul de bolas de
vidrio redondas de 100 \mum de diámetro, fabricación VIA1
Francia). Se dispone en un vórtex durante 30 seg. Después, se
incuba durante 15 mn a 37ºC. Se añaden entonces 100 \mul de fenol
saturado. Se somete a un vórtex durante 30 s. La fase acuosa se
recupera y después se extrae con 100 \mul de cloroformo. Se
somete nuevamente a un vórtex durante 30 s. La fase acuosa se
recupera de nuevo. Se llevan a cabo dos extracciones con éter y
después se evapora este disolvente. Quedan entonces aproximadamente
50 \mul de fase acuosa que contiene los ARN totales. De manera
alternativa, para esta extracción se puede usar el kit Qiagen
RNeasy (marca comercial).
El marcado de los ARN totales de la biomasa
bacteriana mediante la técnica descrita en la presente invención se
lleva a cabo de la manera siguiente mediante la adición de los
agentes reactivos en el siguiente orden:
- -
- totalidad de los ARN extraídos (50 \mul),
- -
- agua (c.s.p. 100 \mul),
- -
- 6 \mul de imidazol 1 M (60 mM final),
- -
- 6 \mul de MnCl_{2} 1 M (60 mM final),
- -
- se somete la disolución a un vórtex durante 10 s,
- -
- 2 \mul de 5-bromo-fluoresceína 50 mM (1 mM final),
- -
- se homogeneiza extrayendo varias veces con la ayuda de una pipeta,
- -
- se somete de nuevo a un vórtex durante 1 s,
- -
- se centrifuga durante 1 s para recoger en la parte inferior del tubo, y
- -
- se incuba durante 30 mn a 60ºC.
Para eliminar el marcador libre en exceso, se
procede a continuación de la siguiente manera. A partir de los 100
\mul marcados se añaden:
- -
- 40 \mul de ADN de esperma de salmón,
- -
- 100 \mul de acetato de sodio 3 M (610 mM final) pH 5,2,
- -
- 250 \mul de isopropanol frío (-20ºC).
Se somete a un vórtex, y después se centrifuga
durante 1 mn. Se elimina el sobrenadante. El residuo se resuspende
entonces en el tampón de hibridación (6 x SSPE, 5 mM de DTAB,
betaína 3 M, Tritón 0,05%, 250 \mug/ml de ADN de esperma de
arenque).
Se visualiza sobre un gel de agarosa al 1% con
el bromuro de etidio:
- \bullet
- una alícuota de la preparación de ARN totales antes del marcado según la invención (A),
- \bullet
- una alícuota de la preparación de ARN totales después del marcado según la invención (B).
Después de la visualización del bromuro de
etidio bajo ultravioletas (UV), se observa:
- -
- para el pocillo A la presencia de las bandas características de ARN mayoritarios, con de arriba hacia abajo: 23S, 16S y después una banda difusa que corresponde a la población de ARN mensajero,
- -
- para el pocillo B la presencia debajo del gel de una población que corresponde a la mezcla total de ARN fragmentado.
Después de la visualización de la fluoresceína,
se observa:
- -
- para el pocillo A: nada,
- -
- para el pocillo B la presencia debajo del gel de una población que corresponde a la mezcla de ARN fragmentado y marcado de manera covalente con la fluoresceína, lo que demuestra que los ARN han sido fragmentados y marcados. Este control se ha llevado a cabo para todas las especies bacterianas descritas en la tabla siguiente.
Una alícuota de los ARN así marcados se hibrida
sobre un soporte sólido de vidrio (biochip) en el que se injertan
mediante fotolitografía unos oligonucleótidos que permiten la
identificación de estas diferentes especies según un procedimiento
que equivale al descrito en el artículo de A- Troesch et al.,
J. Clin Microbiol., 37(1), p. 49-55, 1999.
Los resultados se reproducen en la tabla 6 siguiente.
La especie que tiene la puntuación más elevada
sobre el biochip es siempre la especie buscada, estando la
puntuación obtenida indicada en la columna de la derecha.
Para todas las especies, la identificación es
correcta, demostrando que el procedimiento de la presente invención
es eficaz tanto sobre ARN naturales como sobre ARN que proceden de
una técnica de amplificación.
Claims (7)
1. Procedimiento de marcado de un ácido
ribonucleico (ARN) sintético o natural, caracterizado porque
consiste:
- -
- en fragmentar el ARN de manera no específica por vía química, para generar una pluralidad de fragmentos de ARN, y
- -
- en marcar cada fragmento de dicho ARN a nivel del fosfato terminal que ha sido liberado durante la fragmentación, estando dicho fosfato terminal situado en el extremo 3' mediante la fijación sobre el fosfato en la posición 2', en la posición 3' o en la posición 2'-3' monofosfato cíclico, con relación a la ribosa, de una función reactiva contenida por un marcador o que se puede asociar ulteriormente a un marcador, y
- -
- en purificar el producto de reacción de marcado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fragmentación y el marcado se llevan
a cabo en una etapa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fragmentación y el marcado se llevan
a cabo en dos etapas.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fragmentación
y/o el marcado del extremo 3' de un fragmento de ARN se lleva a
cabo por fijación, sobre dicho fosfato terminal, de una función
nucleófila, electrófila, halogenuro, contenida por un marcador o que
se puede asociar ulteriormente a por lo menos un marcador.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la fragmentación
por vía química del ARN se realiza mediante unos cationes metálicos
asociados o no a un catalizador químico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque los cationes metálicos son unos iones
Mg^{++}, Mn^{++}, Cu^{++}, Co^{++} y/o Zn^{++}, y porque
el catalizador químico está constituido por imidazol, un análogo
sustituido, por ejemplo
N-metil-imidazol, o cualquier
molécula química que tiene una afinidad para el ARN y que contiene
un núcleo imidazol o un análogo sustituido.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el marcado del
extremo 3' de un fragmento de ARN se lleva a cabo por fijación,
sobre dicho fosfato terminal, de una molécula R-X,
en la que R está constituido por el marcador y X es el agente de
unión entre el marcador y el ARN, tal como un grupo hidroxilo,
amina, hidrazina, alcoxilamina, halogenuro de alquilo, halogenuro de
fenil-metilo, yodoacetamida, maleimida.
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