CN1316984C - 铁苋菜水提取物在制备治疗慢性溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,是大戟科植物铁苋菜水提取物用于制备治疗慢性溃疡性结肠炎的新用途。本发明利用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)诱导的大鼠溃疡性结肠炎动物模型即UC模型大鼠和病理学观察实验,发现铁苋菜水提取物可以有效改善大鼠腹泻、便血、体重减轻、结肠组织形态学改变等症状;对组织中性粒细胞具有清除作用;生化检测及分子生物学试验证明其具有抗氧化和抗NO自由基作用;并可从RNA水平抑制诱导型一氧化氮合酶iNOs的表达。因此,铁苋菜水提取物可用于制备抗慢性溃疡性结肠炎药物。
Description
技术领域:
本发明涉及医药技术领域,是大戟科植物铁苋菜水提取物用于制备治疗慢性溃疡性结肠炎药物的新用途。
背景技术:
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis UC)又称为慢性非特异性结肠炎,以反复发作的腹泻、腹痛、便血等为主要症状。由于该病迁延难愈,又极易转化为结肠癌,并且目前没有特异性的治疗方法,因此被世界卫生组织定义为“世界难治病”之一。慢性溃疡性结肠炎在欧美国家的发病率很高,在我国的发病率也呈逐年上升的趋势。由于还没有明确该病的发病机制,因此治疗效果不是很好。目前临床用药主要是氨基水杨酸类、皮质类固醇和免疫抑制剂,而这些药物均存在疗效欠佳及副作用较大的问题,例如临床常用于治疗轻中型UC的柳氮磺胺砒啶(SASP),大约有45%的病人不能耐受其强烈的副作用。皮质类固醇类药物包括泼尼松、氢化可的松、丁地去炎松等,这类药物不应长期使用。免疫抑制剂主要有硫唑嘌呤、氨甲碟呤等,此类药由于毒性较大,其应用已经受到限制。另外有报导使用环胞素治疗对皮质类固醇类药物有抵抗性的重症UC患者,因必须大剂量静脉注射使用,故毒性也较大。因此,开发疗效确切且毒副作用小的抗溃疡性结肠炎药物已经成为急待解决的任务。铁苋,又称海蚌含珠,是大戟科植物铁苋菜(Acalyphaaustralis L.)的全草,具有清热、利湿、消肿、解毒之功效。民间常用于痢疾、出血等病症。毒理实验发现,铁苋菜毒性很小,其水提取液经腹腔注射或按生药量10g/kg灌胃,均未引起小鼠死亡(金继曙,等.《铁苋菜抗菌平喘有效成分的研究》,中草药通讯,1977,10:13)。至今未见有关铁苋菜水提取物用于治疗慢性溃疡性结肠炎的报道。
发明内容:
本发明提供一种将铁苋菜水提取物用于治疗慢性溃疡性结肠炎的新用途。本发明铁苋菜水提取物的制备方法如下:将铁苋菜干燥全草粉碎成粗粉,按常规分别用10倍量的蒸馏水煎煮两次,每次1小时,合并煎煮液,减压浓缩,即为本发明水提取物。
用目前国内外广泛用于筛选抗UC药物的动物模型TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸钠)诱导的大鼠慢性UC模型进行了动物实验,并通过分子生物学试验,证实了本发明铁苋菜水提取物对UC模型大鼠,能显著改善腹泻、便血、体重减轻、结肠病理形态学改变等症状;能清除中性粒细胞,降低髓过氧化物酶(MPO)的水平;具有升高超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、降低丙二醛(MDA)水平的抗氧化作用;并抑制诱导性一氧化氮合酶(iNOs)mRNA的表达,从而抑制NO自由基的生成。由此说明铁苋菜水提取物具有确切的治疗慢性UC的作用,因此可用于制备治疗慢性UC的药物。
附图说明
图1为本发明水提取物对UC模型大鼠体重变化影响的曲线图。
图2为正常对照组大鼠结肠组织切片图。
图3为UC模型对照组大鼠结肠组织切片图。
图4为本发明水提取物中剂量治疗组大鼠结肠组织切片图。
图5为UC模型对照组大鼠结肠组织iNOs mRNA表达的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图6为本发明中剂量治疗组大鼠结肠组织iNOs mRNA表达的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式:
实施例1现结合实施例,对本发明作详细描述
制备铁苋菜水提取物:将铁苋菜全草干燥饮片粉碎成粗粉,加入10倍量的蒸馏水,煎煮两次,每次1小时,合并煎煮液,于旋转蒸发仪减压浓缩,最终得到1g生药/ml的浓缩液。
实施例2铁苋菜水提取物对UC模型大鼠腹泻、便血、体重减轻及结肠形态学改变的治疗作用。
1.动物:60只清洁级、健康雄性SD大鼠,体重180g-200g,购于中国科学院上海实验动物中心,动物合格证号:[SYXK(沪)2002-0026]。将60只大鼠随机分为6组,每组10只,其中1组作为正常对照组,其余5组用于造模。
2.UC动物模型的制备:采用Morris法(Morris GP,Beck PL,Herridge MS,et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology1989,96(3),795-803.)进行造模,即取上述健康雄性SD大鼠,禁食不禁水24小时,腹腔注射2%的戊巴比妥纳轻微麻醉后,将直径2mm的乳胶管经大鼠肛门轻轻插入大约8cm处,按125mg/kg体重将TNBS的50%乙醇溶液用注射器一次性注入到大鼠的肠腔内,将大鼠的尾部提起,倒置30秒,以防造模剂泄漏,即成UC模型大鼠。
3.药物:①柳氮磺胺吡啶(SASP):为上海三维制药有限公司产品,此为临床用治疗慢性UC的药物,用蒸馏水配制成0.1g/ml的混悬液,作为治疗对照药。
②铁苋菜水提取物:由实施例1所制备,浓度为1g生药/ml。
4.实验方法:实验共分6组:第1组取上述健康雄性SD大鼠10只作为正常对照组;第2组取10只UC模型大鼠作为模型对照组;第3、4、5组分别为本发明提取物低、中、高剂量治疗组,每组10只UC模型大鼠,每天分别灌胃铁苋菜水提取物2.5、6.5、9.5g生药/kg体重;第6组为阳性治疗对照组,取UC模型大鼠10只,每天按照0.3g/kg体重灌胃SASP混悬液。各组大鼠均在造模后6小时开始给药,正常对照组和模型对照组则分别给予等体积量的生理盐水灌胃,连续灌胃10天。
5.试验结果:
(1)铁苋菜水提取物对UC模型大鼠体重变化的影响。
各组大鼠造模及给药后,每天记录大鼠的体重,结果见图1。由图1可见,大鼠造模后体重开始骤降,在1-9天内显著低于正常组大鼠体重(p<0.05),在造模后的第2天体重降到最低,只有原体重的80%,第3天开始逐渐恢复,第10天恢复到最初体重。本发明提取物6.5g、9.5g生药/kg治疗组以及SASP0.3g/kg阳性治疗对照组能够显著促进UC模型大鼠的体重恢复,大鼠在造模后第2天体重就开始上升,5-6天逐渐恢复到最初体重。
(2)铁苋菜对UC模型大鼠腹泻及便血的影响
正常组大鼠没有发生腹泻和便血,造模后的大鼠表现为毛色杂乱无光泽,神情倦怠萎靡,均出现了不同程度的腹泻、便血,结果见表1。由表1可见,本发明提取物中、高剂量组及SASP阳性治疗对照组大鼠发生腹泻、便血的个数明显少于模型对照组,说明本发明提取物对UC模型大鼠的腹泻与便血具有治疗作用,铁苋菜水提取物对UC模型大鼠便血的治疗作用尤为明显。
表1 铁苋菜水提取物对UC模型大鼠腹泻与便血的影响
组别 | 大鼠个数(n) | 大鼠发生腹泻的个数(n) | 大鼠发生便血的个数(n) | ||||||||
1天 | 3天 | 5天 | 7天 | 10天 | 1天 | 3天 | 5天 | 7天 | 10天 | ||
123456 | 101010101010 | 01010101010 | 098777 | 088443 | 066201 | 043101 | 01010101010 | 0109767 | 076326 | 043204 | 032002 |
注:1:正常对照组;2:UC模型对照组;3:铁苋菜水提取物低剂量给药组;4:铁苋菜水提取物中剂量给药组;5:铁苋菜水提取物高剂量给药组;6:SASP阳性治疗对照组。
(3)铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠损伤评分及结肠湿重的影响
各组大鼠给药10天后,按常规过量注射戊巴比妥钠致死,剖开大鼠腹部,观察肠道大体改变。将距肛门10cm长的末段结肠取出,沿肠系膜纵行切开,用冰生理盐水冲洗,并称重。将黏膜面向上展开,观察黏膜损伤并按照Wallace和Keenan1990年的评分标准进行评分:0分,无炎症和溃疡;1分,局部充血但无溃疡;2分,溃疡但无充血;3分,一处溃疡及炎症;4分,两处或两处以上溃疡及炎症;5分,溃疡延伸超过2cm。结果见表2。将大鼠解剖后观察结肠外观及黏膜表面发现,模型对照组大鼠的结肠多数与相邻脏器有轻度粘连,结肠充血水肿,在肛口向上8cm处有较大的溃疡性病灶,病灶处结肠壁增厚,肠黏膜表面发生溃疡糜烂成糊状,结肠明显变短,结肠重量显著增加。铁苋菜水提取物中、高剂量组及阳性治疗对照组可以改善结肠充血水肿等炎性症状,减少溃疡面积,促进溃疡愈合,减轻结肠重量。
表2 铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠组织损伤
及结肠湿重的影响(n=10)
组别 | 结肠损伤评分 | 结肠湿重(mg/100g体重) |
123456 | 0±03.84±1.213.17±1.12.56±0.772.09±0.682.12±0.78 | 0.54±0.051.03±0.221.00±0.290.82±0.200.81±0.170.76±0.25 |
注:各组注释同表1。
(4)铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠组织病理学影响
组织病理切片见图2、3、4,由图2看出,正常大鼠结肠组织结构清晰,黏膜完整,固有层内肠腺丰富,排列紧密;由图3看出,模型对照组大鼠结肠黏膜坏死脱落,形成溃疡,大量的中性粒细胞、淋巴细胞浸润,残余腺体杯状细胞消失,纤维组织细胞增生,间质水肿明显;由图4看出,铁苋菜水提取物中剂量治疗组,间质虽有轻度水肿和少量淋巴细胞浸润,但大鼠结肠黏膜增生活跃,表面黏膜基本恢复,溃疡愈合,说明本发明水提取物具有促进溃疡愈合,消除炎性细胞浸润,改善UC模型大鼠结肠组织病理特征的作用。
(5)铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)活力的影响
MPO酶是在中性粒细胞中含量较高的一种酶,其含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高,间接反映炎症在组织中的存在。因此,MPO的水平可用来衡量组织炎症的程度。由表3可见,模型对照组大鼠结肠组织MPO酶的活性比正常大鼠显著升高(p<0.01),铁苋菜水提取物高、中剂量组可以显著降低结肠组织中MPO的活性(p<0.01),说明铁苋菜水提取物具有一定的抗炎作用,与阳性治疗组相比,没有显著性差异(p>0.05)。
表3.铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠组织MPO酶活力的影响
组别 | 大鼠的个数 | MPO活性(U/g) |
123456 | 101010101010 | 0.15±0.2114.58±5.2812.83±6.585.58±3.064.09±2.807.89±4.75 |
注:各组注释同表1。
综上所述,铁苋菜水提取物的中剂量(6.5g生药/kg体重)、高剂量(9.5g生药/kg体重)治疗能显著改善UC模型大鼠体重减轻、便血腹泻等症状,并具有促进结肠黏膜溃疡愈合、降低MPO酶活力、清除中性粒细胞的作用。由此可见铁苋菜水提取物对溃疡性结肠炎具有治疗作用。
实施例3铁苋菜水提取物抗氧化及抗NO自由基作用的实验
1.动物:健康雄性SD大鼠,体重180--200g
2.药物:铁苋菜水提取物为试验药物;SASP为治疗对照药
3.动物分组及给药:随机将动物分成四组,每组10只。随机取其中一组作为正常对照组,其余三组均用TNBS造模(方法同前)。
第1组为正常对照组:每天灌胃生理盐水。
第2组为模型对照组:每天灌胃生理盐水。
第3组为铁苋菜水提取物中剂量组:每天灌胃铁苋菜水提取物6.5g生药/kg体重。
第4组为阳性对照组:每天按照0.3g/kg体重灌胃SASP混悬液。
各组大鼠均在造模后6小时给药,连续给药10天。
4.指标考察:给药10天后,按常规过量注射戊巴比妥钠致死,剖开大鼠腹部,取病变部位的结肠加入冰生理盐水,冰浴下匀浆配成10%的结肠组织匀浆,分别按照超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOs)检测试剂盒说明书进行测定;蛋白含量测定按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书进行操作(SOD、MDA、GSH-Px、NO、iNOs及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司)。结果见表4和表5。
表4.各组大鼠结肠组织SOD、MDA、GSH-Px酶活力
组别 | 大鼠个数 | SOD(NU/mgprot) | MDA(nmol/mgprot) | GSH-Px(U/mgprot) |
1234 | 8101010 | 95.96±7.7480.67±7.78158.68±10.23115.16±14.07 | 4.31±0.3212.18±0.859.38±0.778.87±0.83 | 15.32±1.768.66±1.0713.09±1.2112.07±2.12 |
表5.铁苋菜水提取物对UC模型大鼠结肠组织NO含量和iNOs活力的影响
组别 | 大鼠个数 | NO(μmol/gprot) | iNOs(U/mgprot) |
123 | 81010 | 0.79±0.292.71±0.830.98±0.25 | 0.015±0.0120.84±0.110.54±0.27 |
由表4、表5可以看出,模型对照组与正常组相比,结肠组织中SOD酶及GSH-Px酶的活性显著降低(P<0.05),而MDA水平显著升高(P<0.05),本发明中剂量给药组及SASP给药组与模型对照组相比,可以显著升高SOD酶和GSH-Px酶的活力(p<0.05),而本发明中剂量给药组与阳性治疗对照组相比,没有显著差异(p>0.05)。正常大鼠结肠组织中NO的含量和iNOs的活力很低,而造模后显著升高(p<0.05),铁苋菜中剂量给药后,结肠组织中NO的含量和iNOs的活力显著降低(p<0.05)。由此说明铁苋菜水提取物具有降低UC模型大鼠NO含量及iNOs活力的作用。
实施例4 RT-PCR检测铁苋菜水提取物对iNOs mRNA的表达的抑制
试验材料:RNA抽提试剂盒(购于上海华舜生物工程有限公司),反转录试剂盒和RNase抑制剂(购于宝生物工程大连有限公司),iNOs、GAPDH引物均由上海博亚生物工程有限公司合成.
iNOs的引物1(5’-TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC-3’)
引物2(5’-TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA-3’),
试验方法:分别对实施例2所述模型对照组和铁苋菜水提取物中剂量组大鼠结肠组织进行RNA抽提,取各样本RNA1.5μl,以Oligo(dT)为引物,AMV反转录酶合成cDNA,以该cDNA为模板,以GAPDH为对照,在PCR反应仪中扩增iNOs和GAPDH的DNA,反应参数为:94℃预变性2min后;94℃变性30sec,51.6℃退火30sec,72℃延伸1min,进行31个循环后,72℃再延伸10min,扩增产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳,并置于生物电泳成像分析系统进行拍照分析。电泳图谱见5、6。应用CMIAS-II真彩色医学图像处理系统对两组PCR结果的积分光密度进行分析,结果见表6。
表6.PCR结果电泳积分光密度值
组别 | 积分光密度 | GAPDH | 积分光密度/GAPDH |
模型对照组铁苋菜水提取物中剂量组 | 3.895±1.0102.418±0.847 | 1.787±0.1711.854±0.0503 | 2.216±0.6881.301±0.446 |
由表6可看出,模型对照组与本发明中剂量治疗组相比,iNOs的mRNA表达存在显著差异(p<0.05),前者iNOs mRNA的表达显著高于后者,表明本发明水提取物对iNOs具有一定的抑制作用。由于NO是通过iNOs催化L-精氨酸产生的,说明本发明铁苋菜水提取物是通过抑制iNOs mRNA的表达抑制NO的产生的。
Claims (1)
1.铁苋菜水提取物在制备治疗慢性溃疡性结肠炎药物中的应用,所说的铁苋菜水提取物的制备方法如下:将铁苋菜干燥全草粉碎后,用10倍量的蒸馏水分次煎煮,合并煎煮液,减压浓缩即成。
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