CN110974875A - 蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，属于医药技术领域。该蓝布正提取物的制备方法包括以下步骤：将蓝布正置于第一醇的水溶液中进行浸泡提取后，得到醇提取液；将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末；将固体粉末溶于水中，先用C6烷烃进行萃取，并去除C6烷烃萃取液后，再用乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用第二醇进行萃取，得到醇萃取液；将醇萃取液进行减压干燥后，再依次进行冷冻干燥和粉磨处理，得到蓝布正提取物。该蓝布正提取物对肝炎、肝纤维化、脂肪肝、肝硬化、门脉高压、肝衰竭和肝肾退行性变等肝肾疾病具有显著的预防和治疗作用。

Description

蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体是一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用。
背景技术
肝脏是一个重要的内脏器官，在许多体内重要的合成，代谢和代谢废物清除，包括消化、蛋白质合成和解毒过程中起着非常重要的作用。肝脏对于人的生存是必需的器官，但是，它也非常容易被疾病侵扰。肝脏疾病是指所有的潜在的可以导致肝脏功能障碍的疾病，其中包括肝炎、滥用酒精引起的肝脏疾病、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化，门脉高压，肝功能衰竭，肝癌等。一些肝脏疾病患者可能不表现出任何症状，而另一些肝疾病患者则表现为黄疸、恶心、呕吐、食欲不振、尿色深、腹水导致的腹部肿胀，腹痛和肝性脑病。
虽然，目前对于肝脏疾病的认识和治疗在最近几十年已经取得长足显著的进步。但是，遭受各种肝脏疾病侵扰的人数依然惊人地高。当前可用的治疗肝脏疾病大多是支持和对症治疗，不能提供可以改善病理学病变的治疗。在许多情况下，肝移植成为肝衰竭的唯一选项。因此，对于肝炎、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病，研究开发有效的新治疗策略势在必行。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，所述蓝布正提取物的活性成分包括多糖类化合物和鞣质类化合物。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述肝肾疾病为肝炎、肝纤维化、脂肪肝、肝硬化、门脉高压、肝衰竭和肝肾退行性变中的一种或多种。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述蓝布正提取物的制备方法包括以下步骤：
将蓝布正置于第一醇的水溶液中进行浸泡提取后，得到醇提取液；
将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末；
将固体粉末溶于水中，先用C6烷烃进行萃取，并去除C6烷烃萃取液后，再用乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用第二醇进行萃取，得到醇萃取液；
将醇萃取液进行减压干燥处理，得到所述蓝布正提取物。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将蓝布正置于第一醇的水溶液中进行浸泡提取后，得到醇提取液的步骤中，蓝布正与第一醇的水溶液的质量体积比以kg/L计为1:(5～7)；第一醇的水溶液中第一醇的体积百分比为60％～80％(0.5～1.5)。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述第一醇和所述第二醇分别独立地为C1～C4醇。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述第一醇为乙醇；所述第二醇为正丁醇。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述C6烷烃为石油醚。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末的步骤中，减压浓缩处理的温度为40～60℃。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将醇萃取液进行减压干燥处理，得到所述蓝布正提取物的步骤中，减压干燥处理的温度为30～50℃。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例制得的蓝布正提取物(命名为ACC)主要含有多糖类、多酚类(鞣质类)、类黄酮和三萜类化合物。ACC主要通过保护肝细胞和肝脏的微架构、促进肝脏小血管和门静脉及其分支的再生、以及抑制肝纤维化，来预防和减轻化学性肝损伤，预防和治疗缺血性肝损伤、脂肪肝、肝脏的炎症、肝纤维化、肝硬化；甚至可以预防和治疗衰老引起的肝脏和肾脏退行性病变。ACC不但可以减轻各种引起肝脏细胞受损的病因对肝脏的破坏，还可以促进对受损的肝脏细胞和肝脏微架构进行修复，例如，在化学毒素、缺血、脂肪肝、肝炎、甚至老龄引起的肝肾细胞退行性变的病程中，ACC可以有效地保护和重建肝脏微架构(包括肝小叶、门脉汇管区结构、和肝索)、以及促进肝脏小血管和门静脉及其分支的再生。这对有效改善肝细胞的微环境，恢复肝功能，以及降低门脉系统的压力有益。所有这些有利于肝脏的作用都可以用来治疗肝脏疾病、改善肝脏的微环境以保证向肝脏供应足够的氧气、营养物质、和生长因子等等，以及帮助降低门静脉高压。
附图说明
图1为实施例3制得的蓝布正提取物的反相色谱层析分离图谱。
图2为评估ACC对四氯化碳诱导的肝损伤和门脉高压治疗效果的柱状图。
图3为肝脏组织弹性超声
Figure BDA0002341579750000031
评估肝纤维化的结果图。
图4为评估肝硬化和门脉高压实验动物的血压的结果图。其中，PI反映注射四氯化碳之前的正常血压；PT反映四氯化碳腹腔注射45天后，在ACC或安慰剂治疗之前，实验动物的平均血压上升到了大约130毫米汞柱；Nor为正常血压。Ctrl为安慰剂组动物的血压。
图5为评估实验动物的门静脉压力的结果图。其中，Nor是注射四氯化碳之前的正常动物的平均门静脉压力；Ctrl为安慰剂组。
图6为测量实验动物门静脉(PVD)和下腔静脉(IVCD)的直径的结果图。Nor为正常大鼠平均门静脉直径。Ctrl为安慰剂组。
图7为肝脏的病理变化结果图。其中，Ctrl-10x30和Ctrl-40x为安慰剂治疗组；T-10x30和T-40x为ACC治疗组。
图8为四氯化碳腹腔注射诱导的大鼠肾脏损伤和肾纤维化的结果图。
图9为蓝布正的乙醇提取物治疗组的组织图。其中，C为安慰剂组动物的代表性肝脏显微镜图像，可见较厚的索状纤维组织呈网状分割肝小叶，形成假小叶；T为乙醇提取物治疗组动物的代表性肝脏显微镜图像，大部分肝细胞结构和边界完整清晰。
图10为安慰剂治疗组的组织图。
图11为石油醚提取液治疗组代表性显微镜图像。
图12为ACC治疗组代表性显微镜图像。
图13为蓝布正的乙醇提取物治疗组动物肝脏的脂肪变性程度评分结果图。
图14为ACC治疗组动物肝脏的脂肪变性程度评分结果图。
图15为安慰剂组动物肝脏脂肪变性评分结果图。
图16为石油醚提取液治疗组动物肝脏脂肪变性评分结果图。
图17为各治疗组的评分结果比较图。
图18为
Figure BDA0002341579750000041
评价老年痴呆(APP)小鼠的肝硬度的结果图。
图19为正常APP小鼠肝脏的平均弹性值测试结果图。
图20为安慰剂治疗的APP小鼠肝脏的平均弹性值测试结果图。
图21为ACC治疗的APP小鼠肝脏的平均弹性值测试结果图。
图22为各APP小鼠的肝脏显微图像图。其中，N2和N3为正常APP小鼠的肝脏显微图像图；C2和C3为安慰剂治疗的APP小鼠肝脏显微图像图；T2和T3为ACC治疗的APP小鼠肝脏显微图像图。
图23为各APP小鼠肝脏和肾脏的病理改变对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在8月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。
(2)取10kg上述处理后的蓝布正置于50L的60％的甲醇水溶液中进行浸泡提取3h，并重复上述步骤4次，合并提取液，得到醇提取液。
(3)将上述醇提取液置于40℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。
(4)将上述固体粉末溶于10L的水中，先用10L的石油醚进行萃取，并去除石油醚萃取液后，再用10L的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用10L的正丙醇进行萃取，得到醇萃取液。
(5)将上述醇萃取液置于30℃温度下进行减压干燥处理，即可得到蓝布正提取物。
实施例2
该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在8月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。
(2)取10kg上述处理后的蓝布正置于70L的80％的正丙醇水溶液中进行浸泡提取3h，并重复上述步骤5次，合并提取液，得到醇提取液。
(3)将上述醇提取液置于60℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。
(4)将上述固体粉末溶于10L的水中，先用10L的石油醚进行萃取，并去除石油醚萃取液后，再用10L的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用10L的正丁醇进行萃取，得到醇萃取液。
(5)将上述醇萃取液置于50℃温度下进行减压干燥处理，即可得到蓝布正提取物。
实施例3
该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在8月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。
(2)取10kg上述处理后的蓝布正置于60L的70％的乙醇水溶液中进行浸泡提取3h，并重复上述步骤5次，合并提取液，得到醇提取液。
(3)将上述醇提取液置于50℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。
(4)将上述固体粉末溶于10L的水中，先用10L的石油醚进行萃取，并去除石油醚萃取液后，再用10L的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用10L的正丁醇进行萃取，得到醇萃取液。
(5)将上述醇萃取液置于38℃温度下进行减压干燥处理，即可得到蓝布正提取物(命名为ACC)。
对比例1
该对比例提供了一种蓝布正的乙醇提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在8月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。
(2)取10kg上述处理后的蓝布正置于60L的70％的乙醇水溶液中进行浸泡提取3h，并重复上述步骤5次，合并提取液，得到醇提取液。
(3)将上述醇提取液置于50℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。
(4)将上述固体粉末溶于10L的水中，先用10L的石油醚进行萃取，并去除石油醚萃取液，得到蓝布正的乙醇提取物(命名为EGJ)。
对比例2
该对比例提供了一种石油醚提取液的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在8月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。
(2)取10kg上述处理后的蓝布正置于60L的70％的乙醇水溶液中进行浸泡提取3h，并重复上述步骤5次，合并提取液，得到醇提取液。
(3)将上述醇提取液置于50℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。
(4)将上述固体粉末溶于10L的水中，先用10L的石油醚进行萃取，得到石油醚萃取液，将剩余部分再用10L的乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液，合并石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液，得到石油醚提取液(命名为PEXP)。
实验例：
一、应用安捷伦高压液相色谱，反相柱层析法对该实施例3得到的蓝布正提取物进行反相色谱分析，其得到的色谱图如附图1所示。其中，C2、木麻黄鞣宁(Casuarinin)、赤芍素(Pendunculagin)和鞣花酸等成分的特征峰如附图1所示。
其中，上述反相色谱分析所采用的仪器、试剂及参数设定如下：
自动进样器：Waters 2767 Sample manager；泵：Waters 2545 Binary GradientModu le；紫外检测器：Waters 2998 Photodiode Array Detector；质谱仪：Waters 3100Mass D etector。
试剂：乙腈，色谱纯fisher批号：133472；纯水：Milli Q；
液相条件：流动相，A：纯水，B:乙腈；流速：0.4ml/min；进样量：5L；柱温：35℃；色谱柱：Unitary C18 2.8μm，3.0 x 50mm Column，ACCHROM；
梯度洗脱程序如下表1：
表1
时间/min 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
2 100 0
6 70 30
7 70 30
7.01 100 0
10 100 0
质谱条件：
MODE：ESI+/ESI-，full scan；
Capillary：3.2KV；
Source Temperature：120℃；
Desolvation Temperature：350℃；
Desolvation Gas Flow：600L/Hr；
Cone Gas Flow：50L/Hr；
Cone voltage：30V；
Mass(m/z)：85-2000；
样品配制：取2μL上述实施例3得到的蓝布正提取物的水溶液直接进样分析。
二、探索上述实施例3提供的蓝布正提取物(ACC)在细胞培养中对成纤维细胞增殖的抑制作用：
为了证明蓝布正提取物(ACC)是否可以特异性地抑制成纤维细胞的生长，可以分别用ICR小鼠尾巴成纤维细胞(ICR-TFB)和人脐静脉内皮细胞培养系统来评估ACC的特异性抑制成纤维细胞增殖的作用。具体的，取ICR小鼠尾组织，剪碎，用加入抗生素(100U/mL的青霉素、100mg/mL的链霉素)的PBS冲洗后将组织加入到含有0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶的培养液中，36℃培养20分钟，然后将培养液中悬浮的细胞通过离心将其沉淀，然后再将沉淀的细胞重新悬浮于含有10％小牛血清(FCS)和抗生素(100U/mL的青霉素、100mg/mL的链霉素)的DMEM培养液中。然后将悬浮的细胞种到24孔培养板，在37℃恒温箱、5％CO2/95％空气下培养。
培养2h后、悬浮的细胞被丢弃，贴壁的细胞在含有10％FCS的DMEM培养基中继续培养两天。然后用PBS冲洗培养的细胞，收集用酶消化(0.25％胰蛋白酶)的细胞，离心，将细胞沉淀再悬浮在含有10％FCS的DMEM培养基中，细胞浓度为105细胞/毫升。然后将细胞种到96孔板，并用含有不同浓度上述实施例3提供的ACC(3.9～125μg/毫升培养基，ACC溶解在5％DMSO中)的培养基进行处理。另外，用同样浓度梯度的上述实施例3提供的ACC(3.9～125μg/毫升培养基，ACC溶解在5％DMSO中)的培养基处理平行培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照。其中，细胞的增长率与ACC浓度的关系结果如下表2所示。结果表明，ACC可以剂量依赖性抑制培养的成纤维细胞的增长率，当培养基中的ACC浓度达到125μg/mL时，培养的成纤维细胞几乎没有增长。相比之下，同样浓度的ACC，对培养的HUVEC细胞并未观察到生长抑制作用。说明ACC对成纤维细胞的生长有特定的抑制作用。因此，这些结果提示ACC可能可以减缓或抑制肝纤维化的进展。
表2
Figure BDA0002341579750000081
Figure BDA0002341579750000091
三、上述实施例3提供的蓝布正提取物(ACC)对亚临床肝纤维化和肝硬化动物模型的治疗方法和评估：
应用四氯化碳(用植物油溶解四氯化碳成50％浓度，3毫升/公斤体重/次)腹腔注射Wistar鼠(160-180g)诱导肝纤维化和肝硬化动物模型。四氯化碳腹腔注射频度为每周两次，共注射15周。为了辅助肝硬化的发病进程，在不注射四氯化碳的天里，每周5次静脉给予每只实验动物1毫升30％的乙醇，共给4周。注射四氯化碳9周后，实验动物被随机分为即对比例1的EGJ(n＝15)治疗，实施例3的ACC(n＝15)治疗，对比例2的PEXP(n＝15)治疗和安慰剂(n＝15)治疗组。从第10周的开始，EGJ(450毫克/公斤/天)、ACC(150毫克/公斤/天)，PEXP(70毫克/公斤/天)，分别给相应的各组实验动物灌胃给药，共给药12周。相同体积的水灌胃给安慰剂组实验动物，同样给12周。
实验过程中，尤其是到实验最后四周，PEXP和安慰剂治疗组实验动物经历了渐进性和进行性脱毛。对比之下，ACC治疗动物组的毛发则表现接近正常，几乎没有观察到脱毛。而EGJ治疗组动物显示有轻中等程度的脱毛。除此以外，安慰剂(Vehicle)组动物的死亡率是26.7％，远远高于ACC治疗组动物的6.7％(如附图2所示)。另外，如附图2所示，安慰剂组由于肝硬化和门脉高压导致的腹水比率为82％(Ascites)，对比之下，ACC治疗组的腹水率只有7.1％。这些结果提示ACC可以有效治疗肝硬化和门脉高压。
此外，利用
Figure BDA0002341579750000092
评估肝纤维化。FibroScan是一种超声波机器，利用测量肝脏某个测定部位的瞬时弹性成像来反应肝脏硬度。在诱导肝纤维化(LF)之前，以及诱导肝纤维化45天之后，用FibroScan来测量实验动物肝脏的硬度。在每个动物的肝脏选择三个不同的区域点进行测量。测量的结果是通过把所有有效测量的数值相加，然后再除以所有测量次数得出，单位表示为千帕(kPa)。算出的中值被认为是代表该被测量肝脏的弹性系数。结果表明，正常大鼠肝脏的平均弹性值大约是8.35±0.86。在用腹腔注射四氯化碳诱导肝纤维化45天时大鼠肝脏的平均弹性值为12.87±1.21。另外，用ACC或安慰剂治疗4周后，安慰剂组肝脏的平均弹性值进一步增加到13.63±1.58，而ACC治疗组大鼠肝脏的平均弹性降低到9.68±0.98(如附图3所示)。这些结果提示，与安慰剂治疗相比，ACC治疗能非常有效地治疗肝纤维化，和改善大鼠肝脏的硬度(p<0.01)。
此外，在实验过程中发现用四氯化碳诱导的肝硬化和门脉高压实验动物的系统血压升高。实验结果显示，在注射四氯化碳之前，三组(正常大鼠，安慰剂组大鼠，ACC治疗组大鼠)实验动物的血压大约都是110mmHg(如附图4的PI所示)。四氯化碳腹腔注射45天后，在任何治疗之前，实验动物的平均血压上升到了大约130毫米汞柱(如附图4的PT所示)。然而，经过85天的治疗后，ACC治疗组(ACC)动物的血压在下降到正常血压110毫米汞柱左右。相比之下，安慰剂治疗组动物的血压继续升高到138毫米汞柱(如附图4的AT所示)。而相应月龄的正常大鼠的血压还是110毫米汞柱左右。这些结果提示肝硬化和门脉高压可能会导致系统血压升高，原因可能是由于肝硬化，肝脏的血管遭到破坏，从而导致肝脏的血管阻力升高，进而肝脏灌流不足，为了克服升高的阻力，保证肝脏的血液灌流，所以系统血压反应性升高。ACC治疗可以重建肝脏的微结构(包括肝血管)，因而可以有效的降低肝脏的血液灌流阻力，进而使系统血压恢复正常。
实验动物门静脉压力测量研究表明，注射四氯化碳之前的动物的平均门静脉压力是8.33mmHg。腹腔注射四氯化碳105天，从四氯化碳注射的46天起开始给予安慰剂85天，测量到的安慰剂组门静脉压力显著升高到17.42mmHg。对比之下，腹腔注射四氯化碳105天，从四氯化碳注射的46天开始给予ACC治疗85天，与安慰剂组的门静脉压相比，ACC治疗组的门静脉压力显著降低到12.16mmHg(如附图5所示)。
在实验治疗终止后，进行各组实验动物门静脉和下腔静脉直径的测量。结果发现，同体重未注射四氯化碳的正常大鼠平均门静脉和下腔静脉的直径分别大约是2.06mm和3.08mm。而在四氯化碳腹腔注射动物105天，安慰剂治疗85天后的动物平均门静脉和下腔静脉的直径扩大，分别约是3.69mm和5.96mm。对比之下，ACC治疗组在腹腔注射四氯化碳为105天，ACC治疗85天的动物的平均门静脉和下腔静脉直径分别约是3.0mm和4.6mm(如附图6所示)。
使用二氧化碳吸入致死法将各组的所有实验动物在相应的方案治疗4周后处死，将动物置于封闭室内，慢慢从压缩二氧化碳汽缸放入70％的CO2。气体流量保持至少1.5分钟后出现明显临床死亡症状。该方法符合AVMA协会小组执行的安乐死原则。
打开处死后实验动物的腹部时，发现安慰剂治疗组有82％的动物出现中度到重度腹水，脾脏体积显著增大。肝脏的体积明显缩小，肝表面呈现粗颗粒状。相比之下，ACC治疗组大鼠中仅观察到有7.1％轻到中度的腹水。肝脏的大小和外观几乎和正常的一样。ACC治疗组大鼠很少观察到脾肿大。
摘取肝脏和肾脏，用PBS冲洗。这些标本切片用于组织学和免疫组织化学分析或用于DNA微阵列研究。切成合适的大小并用石蜡包埋。切片厚度为(5μm)。根据Masson’s试剂盒说明书染色，纤维胶原蓝染和肝细胞红染。蓝染色区域用数字化定量化分析。
为了减少形态学分析的偏见，可给出肝脏的整体图像，这是集成来自30多个10倍视野的照片合成的，所以整个肝脏图像可以被显示，并且有较高的解像度。显微镜观察发现，安慰剂组动物的整个肝脏遍布蓝染的纤维索条，这些纤维索条在汇管区之间(pp)，或汇管区和中央静脉之间(p-c)形成明显的桥接的网状间隔(如附图7所示)。此外，在整个肝脏区域遍布被蓝染的胶原纤维缠绕的肝细胞结节(肝硬化)(如附图7所示)。相比之下，ACC治疗组实验动物肝脏的胶原纤维沉积的量显著少，形成的索条也细得多，在汇管区之间(pp)，或汇管区和中央静脉之间(p-c)形成的桥接也显著少，蓝染的纤维网状间隔也不完整(图10)。没有观察到明显的肝细胞结节形成，虽然偶尔看到少量的肝细胞结节。更显著的是ACC治疗组大鼠肝脏的大小大约是正常的，与显著缩小的、硬化的，遍布肝细胞结节的安慰剂组的肝脏形成鲜明对比。更重要的是，ACC治疗组动物肝脏多数的汇管区、中央静脉和肝小叶被完整保留，而这些微细结构在安慰剂组的动物肝脏中大多都被破坏，被纤维组织取代(如附图7所示)。PEXP治疗的肝脏显示了严重的肝脏毒性反应，许多肝细胞死亡，肝脏的微结构消失，混乱，几乎所有的肝细胞均严重空泡化，细胞界限消失，提示该组分没有任何治疗作用。
腹腔内注射四氯化碳和胃内的灌入30％乙醇不仅诱导了严重肝损害，也导致了实验动物肾脏的损伤和纤维化。形态学观察显示，安慰剂组动物整个肾脏区域都观察到许多蓝染的纤维组织形成块状或索状，许多肾小球被摧毁，被纤维瘢痕组织取代(如附图8的Kcm和KcmH)。相比之下，ACC治疗组动物的肾脏内形成的纤维瘢痕显著少，并且细小(如附图8的Ktm)，大多数肾小球和肾小管的结构也较好地保留下来(如附图8的KtmH)。
乙醇提取物虽然对治疗肝纤维化、肝硬化、脂肪肝和门脉高压有效，但是ACC的疗效比乙醇提取物更好。乙醇提取物治疗的动物的肝脏的大部分肝细胞结构和边界完整清晰，可见较多的中央静脉和结构完整的肝小叶，并且与安慰剂组的肝脏相比，纤维组织沉积也显著较少，较少见形成的假小叶(如附图9所示)。
安慰剂(灌胃等量的水)治疗组存活动物的组织学观察发现，除了大多数该组动物都显著脱毛，毛发干枯，有中到大量腹水外，显微镜下肝脏的整个视野中的大部分肝细胞都遭到中重度破坏，肝细胞结构模糊，细胞界限消失，可见绝大多数肝细胞内都含大量的脂肪空泡，中重度肝脂肪样变性。肝脏的整体，和微结构被严重破坏。视野中的肝小叶和中央静脉的数量比乙醇提取物和ACC治疗组明显少。肝纤维化严重，假小叶形成(如附图10所示)。
实验结果也证明了PEXP部分对肝脏没有保护作用。该组动物除了有较高的致死率以外，存活的动物大多数都表现为毛发干枯，显著脱毛，有中到大量腹水。显微镜下肝脏的整个视野中的大部分肝细胞都遭到重度破坏，肝细胞结构消失，细胞形态和界限消失。绝大多数肝细胞严重空泡化，中重度肝脂肪样变性(如附图11所示)。比较之下，雌性大鼠(如附图11的♀)的肝细胞脂肪样变性，空泡化非常严重，肝细胞结构和细胞界限完全消失。肝小叶、汇管区、中央静脉等微结构严重破坏，但是纤维化程度较雄性的轻。而雄性大鼠(如附图11的♂)的肝纤维化较重，胶原纤维呈索状密集分布于小叶间，并切割肝小叶形成假小叶，而肝细胞脂肪样变性相对比雌性的轻。
实验证明ACC是保护肝细胞，帮助重建肝脏微结构，抑制肝纤维化和肝硬化等病理状态的有效成分。因此ACC组动物模型的治疗效果最为显著。该组动物除了有最低的死亡率以外，存活的动物的毛发基本正常，未见或罕见脱毛，仅有少量动物有小量腹水。大多数肝脏的外观基本正常，显微镜下可见显著少的、和纤细的纤维组织穿插于小叶间，绝大度数的肝细胞结构清晰，排列整齐，大部分肝小叶结构基本清晰(如附图12的♂)。仅有小部分肝细胞有着色变浅，并有轻度空泡化倾向，大部分肝细胞结构和边界完整清晰。可见较多的中央静脉和结构完整的肝小叶，并且与所有其他组的肝脏相比，纤维组织沉积也显著较少，较少见形成的假小叶(如附图12的♀)。
此外，对各组不同处理的肝脏的空泡化，脂肪变性进行评分。以平均空泡化、脂肪样变性程度等级(1-10，10为程度最严重等级)、和平均空泡化，以及脂肪样变性面积(百分比)相乘，算出每组每个动物的平均脂肪样变性程度。其中，乙醇提取物治疗组动物肝脏的肝细胞排列完整有光泽，大部分的肝小叶结构可见和完整。6/13只存活的实验动物可见占肝脏总面积约10％的肝细胞颜色变浅，轻度空泡化，以及微结构轻中度破坏，脂肪样变性程度：2分(如附图13所示)。另外7/13只占肝脏总面积约有18％的肝细胞有空泡化，及微结构轻中度破坏，脂肪样变性程度：2分(如附图13所示)。每个动物的平均脂肪变性指数为0.28。
ACC治疗组动物肝脏的肝细胞排列完整有光泽，大部分的完整肝小叶结构可见。5/14只存活的实验动物中约5％血管周围肝细胞颜色变浅及轻微空泡化.脂肪样变性程度(如附图14的♀右上)评分大约1。5/14只(如附图14的♀右下)约20％面积的肝细胞颜色变浅.呈斑块状，脂肪样变性程度：2。4/14只(如附图14的♂)有10％面积肝细胞颜色变浅及轻微空泡化.总体脂肪样变性程度：1。每个动物的平均脂肪变性指数为0.19。
安慰剂组动物肝脏的肝细胞排列紊乱，空泡变、脂肪变性严重、肝纤维化、肝硬化明显。虽然4/11只存活的雌性实验动物肝脏的纤维化较少，但是90％以上的肝细胞中重度脂肪样变性(如附图15的♀)，脂肪样变性程度:7分。有2/11只雌性大鼠的肝脏既有轻度以上的纤维化，同时有60％以上的肝脏细胞空泡化，脂肪样变性程度:6分(如附图15的♀)。有2/11只雄性动物的肝纤维化严重，形成肝硬化结节和假小叶，肝微结构基本全部被破坏，有占总肝面积15％的肝细胞脂肪样变性，程度4分(如附图15的♂)。有2/11只雄性大鼠的肝脏有30％脂肪样变性，程度5分(如附图15的♂)。有1只雄性大鼠的(♂)肝脏有15％脂肪样变性，程度:1分。每个动物的平均脂肪变性指数为3.34。
PEXP组动物肝脏的肝细胞排列极度紊乱，空泡变、脂肪变性非常严重。存活的10只动物中有4/10只动物(如附图16的♀)有超过总肝面积95％以上的肝细胞严重空泡化脂肪样变性，脂肪变性程度:7分。有3/10只动物的肝脏有轻中度的纤维化，和70％以上的肝细胞空泡化脂肪变性，变性程度：5分。有3/10只动物(如附图16的♂)的肝脏纤维化程度较重，肝结构破坏，形成假小叶，同时有约25％的肝细胞空泡化脂肪样变性，脂肪变性程度约:3分。每个动物的平均脂肪变性指数为3.9。
总结：ACC治疗组的平均脂肪变性指数为0.19；乙醇提取物治疗组的平均脂肪变性指数为0.28；安慰剂组的平均脂肪变性指数为3.34；PEXP组的平均脂肪变性指数为3.9(如附图17所示)。即ACC的治疗效果为最优，乙醇提取物的治疗效果良好，但是治疗效果较ACC次之。
四、探索上述实施例3提供的蓝布正提取物(ACC)对老年相关的肝肾退行性病变的预防和治疗作用：
在研究中发现，6个月龄以上的APP小鼠的肝脏和肾脏都经历严重的退行性病变。因此，为了测定是否ACC可以减缓或治疗肝脏或肾脏退行性变导致的肝肾病变，本实验采用6个月大的APP小鼠随机分为ACC治疗组(n＝15)和安慰剂治疗组(n＝15)。给ACC治疗组的小鼠每天灌胃ACC(ACC溶于水中，200毫克/公斤/天)，共30天。相应地给安慰剂组的动物每天灌胃同等体积的水，共30天。
治疗30天后，用FibroScan来评估实验动物肝的硬度。在每个动物的肝脏选择三个不同的区域点进行测量。测量的结果是通过把所有有效测量的数值相加，然后再除以所有测量次数得出，单位表示为千帕(kPa)。算出的中值被认为是代表该被测量肝脏的弹性系数。结果表明，安慰剂组(Vehicle)肝脏的平均弹性均值大约是13.12±1.32，而ACC治疗组动物肝脏的平均弹性值大约是11.06±0.68(如附图18所示)。这个结果提示，ACC治疗可能有效地治疗或减缓肝细胞退行性变导致的肝损伤。改善APP小鼠的肝脏硬度可能是通过阻止肝细胞退行性死亡和随后的肝纤维化来达到的。
使用二氧化碳吸入致死法将实验动物处死，将动物置于封闭室内，慢慢从压缩二氧化碳汽缸放入70％的CO2。气体流量保持至少1.5分钟后出现明显临床死亡症状。该方法符合AVMA协会小组执行的安乐死原则。摘取肝脏和肾脏，用PBS冲洗，石蜡包埋，切片(5μm)，分别进行H/E和Masson’s三色染色。
如附图19所示，正常野生型同龄小鼠肝脏的弹性是6.5kPa，相对应的肝组织显微图像(如附图22的N2&N3)是正常肝组织，肝细胞、中央静脉和汇管区的结构正常。而安慰剂组转基因APP同龄小鼠肝脏的弹性是16.8kPa(如附图20所示)，相对应的肝组织显微图像(如附图22的C2&C3)显示许多肝细胞空泡化变，细胞界限消失、许多中央静脉和汇管区的结构被破坏，被纤维组织取代。对比之下，ACC治疗的APP同龄小鼠肝脏的弹性是9.1kPa(如附图21所示)，相对应的肝组织显微图像(如附图22的T2&T3)显示许多相对正常肝细胞结构，细胞界限清晰、大多数中央静脉和汇管区的结构正常，纤维化程度显著比安慰剂组轻。
如图23所示，6月龄以上APP小鼠不仅有严重的肝退行性病变，肾脏也同样有明显的退行性病变。形态学观察显示，安慰剂组动物整个肝脏区域的肝细胞肿胀、严重空泡化、细胞界限消失、细胞碎裂(图23:Lc)；而肾脏整个区域都能观察到许多蓝染的纤维组织形成块状或索状，许多肾小球被摧毁，被纤维瘢痕组织取代(图23:Kc&Kcm)。相比之下，ACC治疗组动物的肝脏的肝细胞形态正常，细胞界限清楚、肝脏微细结构如汇管区、肝小叶和中央静脉基本正常(图23:Lt)；肾脏内形成的纤维瘢痕也显著少，大多数肾小球和肾小管的结构也较好地保留下来(图23:Kt&Ktm)。以上这些结果意味着ACC可以降低老年性肝脏和肾脏的退行性变化的步伐，改善老年人的肝肾脏功能。
需要说明的是，在本发明中使用的所有方法步骤均符合美国国家卫生研究院发表的实验动物保护和使用指南。
综上，可以得到以下结论：
1、对比例1得到的蓝布正的乙醇提取物含有蓝布正活性成分和石油醚的组分，其对肝细胞具有保护作用，但是其的保护作用弱于实施例3提供的ACC，对肝纤维化的抑制作用也明显低于ACC。
2、ACC对肝细胞具有良好的保护作用，对肝纤维化也有较强的抑制作用。
3、石油醚分馏部分没有表现出对肝细胞的保护作用，对胶原纤维有一定的抑制作用。
4、从雌雄鼠病理图片看，雄鼠更容易造成肝纤维化和胶原纤维沉积增多，而雌鼠则脂肪样变性较严重。
5、由于乙醇提取物含有蓝布正活性成分和石油醚分馏的组分，因此可以推断蓝布正活性成分是治疗肝纤维化、肝硬化、脂肪肝、门脉高压，肝细胞的退行性变疾病的有效成分。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (9)

1.一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述蓝布正提取物的活性成分包括多糖类化合物和鞣质类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述肝肾疾病为肝炎、肝纤维化、脂肪肝、肝硬化、门脉高压、肝衰竭和肝肾退行性变中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述蓝布正提取物的制备方法包括以下步骤：
将蓝布正置于第一醇的水溶液中进行浸泡提取后，得到醇提取液；
将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末；
将固体粉末溶于水中，先用C6烷烃进行萃取，并去除C6烷烃萃取液后，再用乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液，然后用第二醇进行萃取，得到醇萃取液；
将醇萃取液进行减压干燥处理，得到所述蓝布正提取物。
4.根据权利要求3所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述将蓝布正置于第一醇的水溶液中进行浸泡提取后，得到醇提取液的步骤中，蓝布正与第一醇的水溶液的质量体积比以kg/L计为1:(5～7)；第一醇的水溶液中第一醇的体积百分比为60％～80％(0.5～1.5)。
5.根据权利要求3所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述第一醇和所述第二醇分别独立地为C1～C4醇。
6.根据权利要求5所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述第一醇为乙醇；所述第二醇为正丁醇。
7.根据权利要求3所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述C6烷烃为石油醚。
8.根据权利要求3所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末的步骤中，减压浓缩处理的温度为40～60℃。
9.根据权利要求3所述的一种蓝布正提取物在用于制备防治肝肾疾病药物中的应用，其特征在于，所述将醇萃取液进行减压干燥处理，得到所述蓝布正提取物的步骤中，减压干燥处理的温度为30～50℃。
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