CN113880891B - 具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从蓝布正中分离得到的具有抗氧化活性和α‑葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物新化合物。经过波谱和质谱数据分析表明从蓝布正全草中分离得到1个新的鞣花鞣质二聚体化合物。且经过体外DPPH清除试验和α‑葡萄糖苷酶抑制试验研究表明，本发明提供的鞣花鞣质二聚体化合物具有较强的抗氧化活性以及α‑葡萄糖苷酶抑制活性，可开发成新药。
Description
技术领域
本发明涉及一种新化合物，具体涉及从蓝布正提取分离得到的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物新化合物，属于医药技术领域。
背景技术
蓝布正为蔷薇科水杨梅属植物柔毛路边青Geum japonicum Thunb.var.chinenseBolle及路边青Geum aleppicum Jacq.的干燥全草，又名追风七、水杨梅等。其具有益气健脾，补血养阴，润肺化痰之功效。临床上主要用于气血不足，虚痨咳嗽，脾虚带下。蓝布正中鞣质类、三萜类、黄酮类及木脂素类是其主要化学成分，其中鞣质类成分含量较高。本发明对蓝布正中的有效成分深入研究，分离纯化得到新的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体成分。
发明内容
发明目的：本发明的目的是对蓝布正中的有效成分进行深入研究，分离纯化得到新的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物新化合物。本发明另外一个目的是提供该鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物(GeuminA)，其结构式如下：
具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：
取蓝布正药材用甲醇浸泡提取，得甲醇提取液，减压浓缩干燥，得到浸膏，取浸膏加水超声溶解、过滤，取上清液；
(2)分离：
取步骤(1)的上清液经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，得到馏分LBZSQH70；
取馏分LBZSQH70经正相中压柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱，收集馏分LBZSQH70-1～LBZSQH70-12，将LBZSQH70-1～3合并得到LBZSQH701；
取LBZSQH701经Sephadex LH-20分离，甲醇体系洗脱，得到馏分LBZSQH701S11；
(3)纯化：
取LBZSQH701S11经Pre-HPLC分离，得到馏分LBZSQH701S11P4；LBZSQH701S11P4再经Semi-Pre-HPLC纯化，得到鞣花鞣质二聚体化合物。
作为优选方案，以上所述的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)提取：
取蓝布正药材加甲醇浸泡提取，蓝布正药材和甲醇的质量体积比为1:7.5，每次提取时间2d，共提取3次，合并提取液，在45℃减压浓缩干燥，得到蓝布正浸膏，将蓝布正浸膏加水超声溶解后过滤，得到上清液；
(2)分离：
取步骤(1)的上清液经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，得到馏分LBZSQH70；
取馏分LBZSQH70经正相中压柱色谱分离，用体积比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱，收集馏分LBZSQH70-1～LBZSQH70-12，将LBZSQH70-1～3合并得到LBZSQH701；
取馏分LBZSQH701经Sephadex LH-20分离，甲醇体系洗脱，得到馏分LBZSQH701S11；
(3)纯化：
取步骤(2)的LBZSQH701S11经Pre-HPLC分离，流动相A相为H2O，B相为MeOH，得到馏分LBZSQH701S11P4；取馏分LBZSQH701S11P4经Semi-Pre-HPLC纯化，流动相A相为：含0.1％三氟乙酸的H2O，B相为乙腈，得鞣花鞣质二聚体化合物。
本发明采用DPPH清除试验和α-葡萄糖苷酶抑制试验测定分离得到的新的鞣花鞣质二聚体化合物，显示出较强的体外抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，可开发为抗氧化剂以及α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于治疗糖尿病。
本发明可将化合物Geumin A和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂等剂型的药物。
有益效果：本发明提供的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过对蓝布正化学成分进行系统深入研究，经过波谱和质谱数据分析表明从蓝布正全草中分离得到1个新的鞣花鞣质二聚体化合物(Geumin A)。且经过体外DPPH清除试验和α-葡萄糖苷酶抑制试验研究表明，本发明提供的鞣花鞣质二聚体化合物具有较强的抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，可开发成新药。
附图说明
图1为鞣花鞣质二聚体化合物的结构示意图。
图2为鞣花鞣质二聚体化合物的核磁共振碳谱13C-NMR图。
图3为鞣花鞣质二聚体化合物的核磁共振氢谱1H-NMR图
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：
取20kg蓝布正药材用甲醇浸泡提取，蓝布正药材和甲醇质量体积比为1:7.5，每次提取时间2d，共提取3次。45℃减压浓缩干燥，得到蓝布正浸膏(LBZ)重量约900g。将蓝布正浸膏用3.0L水超声溶解后过滤，得到上清液(LBZSQ)约450g。
(2)分离：
LBZSQ溶液经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，得到馏分LBZSQH70(94.5g)。
馏分LBZSQH70经正相中压柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱(体积比为100:0-0:100)，收集馏分LBZSQH70-1～LBZSQH70-12，将LBZSQH70-1～3合并得到LBZSQH701(68.0g)。
LBZSQH701经Sephadex LH-20分离，甲醇体系洗脱，得到馏分LBZSQH701S11(7.1g)。
(3)纯化：
LBZSQH701S11经Pre-HPLC(A相：H2O，B相：MeOH)分离，得到馏分LBZSQH701S11P4。LBZSQH701S11P4经Semi-Pre-HPLC(A相：H2O+0.1％TFA，B相：ACN)纯化，得到化合物GeuminA(31mg，纯度94.16％)。
化合物Geumin A结构解析为：白色粉末。高分辨质谱TOF-MS给出分子量m/z:1267.1563[M-H]-，推测其分子式为C54H44O36。
通过对图2的13C-NMR，图3的1H-NMR和HSQC，COSY和HMBC谱的分析对化合物中的碳、氢信号进行归属。根据δH6.77(1H,s)和δH6.58(1H,s)2个氢信号推测存在1个六羟基联苯二甲酰基(HHDP)，在HMBC谱中δH6.77与δC167.8之间，δH6.58与δC168.0之间的氢碳远程相关证明上述推测的正确性；δH6.27(1H,d,J＝4.0Hz,H-1)是a糖的端基氢信号，在1H-1HCOSY谱中可以观测到δH6.27(H-1)与δH3.80(H-2)之间，δH3.90(H-3)与δH3.80(H-2)、δH4.79(H-4)之间，δH4.15(H-5)与δH4.79(H-4)、δH5.02(H-6)之间的氢氢相关信号，证明了a糖是吡喃糖；同时，由HMBC谱中δH4.79(H-4)与δC167.8之间，δH3.56,5.02(H2-6)与δC168.0之间的氢碳远程相关信号，得到如下结构片段a。
1H-NMR(acetone-d6,400MHz)中，δH7.26(1H,s)和δH7.23,6.81(1H each,d,J＝1.6Hz)是脱氢二没食子酰基(DHDG；结构片段b)的特征氢信号，而HMBC谱中δH7.23与δC164.5、δC147.4、δC119.3之间，δH6.81与δC164.5、δC146.0、δC139.7、δC119.3之间，δH7.26与δC163.2、δC142.8、δC140.2、δC140.0、δC114.3之间的氢碳远程相关信号进一步验证了DHDG的存在。
1H-NMR、13C-NMR中，δH7.05(2H,s)和δH6.96(2H,s)以及δC165.8和δC165.2的信号推测结构中存在两个没食子酰基(G)，通过HMBC谱中δH7.05与δC165.8、δC145.3、δC138.4、δC120.7之间，δH6.96与δC165.2、δC145.4、δC138.7、δC120.0之间的氢碳远程相关信号对上述推测进一步验证；δH6.00(1H,d,J＝8.4Hz,H-1)是b糖的端基氢信号，且在1H-1HCOSY谱中可以观测到δH5.32(H-2')与δH6.00(H-1')、δH5.55(H-3')之间，δH3.94(H-4')与δH5.55(H-3')、δH3.71(H-5')之间，δH3.74,3.85(H2-6')与δH3.71(H-1')之间的氢氢相关信号，证明了b亦是吡喃糖；同时，由HMBC谱中δH5.32(H-2')与δC165.2之间，δH5.55(H-3')与δC165.8之间的氢碳远程相关信号，得到如下结构片段c。
在HMBC谱中，可以观测到δH6.00与δC164.5之间，δH6.27与δC163.2之间的氢碳远程相关信号，将片段a和b、c有机的结合在一起，得到化合物Geumin A，结构式如图1。
表1.Geumin A的1H和13C-NMR数据
a：数据之间可能互换 b：数据之间可能互换
实施例2体外试验
1、实验材料
DPPH购自笛医生物科技有限公司；DMSO购自科密欧化学试剂有限公司；阿卡波糖购自上海源叶生物科技有限公司；维生素C(Vc，分析纯)、无水乙醇、铁氰化钾购自天津市天力化学试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶、对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷购自Sigma公司。
2、实验方法
2.1DPPH清除试验
用无水乙醇配制0.3mmol/L DPPH溶液，每种化合物配制成不同浓度的DMSO(1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL)。取100μL每种化合物的DMSO和100μL DPPH乙醇溶液进行混合，静置在黑暗中30min。以96孔板为反应载体，使用酶标仪在517nm测定吸光度，各组实验均重复测定三次，清除率(％)＝[(A517对照-A517样品)/A517对照]×100，使用Vc作为阳性对照，计算IC50。
2.2α-葡萄糖苷酶抑制试验
向96孔板中加入25μL不同化合物溶液(终浓度为1、5、10、20、40、60μg/mL)、25μL、0.5U/mLα-葡萄糖苷酶溶液(用0.1mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液配制)、175μL(0.1M、pH6.8)磷酸盐缓冲液室温静置反应10min。加入25μL、23.2mM对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(用0.1mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液配制)，充分混匀后于37℃反应15min。于405nm波长处测定OD值，同时设定相同体系下的样品背景对照组(不加酶)、空白对照组(不加样品)。α-葡萄糖苷酶抑制率按公式计算，并计算IC50。α-葡萄糖苷酶抑制率/％＝[OD空白-(OD样品-OD背景)]/OD空白×100％，OD空白为空白对照组吸光度值，OD样品为样品或阿卡波糖吸光度值，OD背景为样品背景对照组吸光度值。
3、实验结果
本发明采用上述三个实验检测Geumin A的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，在抗氧化实验中选取Vc作为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制实验选择阿卡波糖作为阳性对照。结果显示，Geumin A比阳性药具有更强的抗氧化力和α-葡萄糖苷酶抑制能力。实验结果如下表2所示。
表2.Geumin A的活性实验IC50值
| 化合物 | DPPH清除实验 | α-葡萄糖苷酶抑制试验 |
| Geumin A | 3.782μg/mL | 4.406μg/mL |
| VC | 24.546μg/mL | - |
| 阿卡波糖 | - | 400μg/mL |
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物，其特征在于，其结构式如下：
2.权利要求1所述的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取：
取蓝布正药材用甲醇浸泡提取，得甲醇提取液，减压浓缩干燥，得到浸膏，取浸膏加水超声溶解、过滤，取上清液；
(2)分离：
取步骤(1)的上清液经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，得到馏分LBZSQH70；
取馏分LBZSQH70经正相中压柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱，收集馏分LBZSQH70-1～LBZSQH70-12，将LBZSQH70-1～3合并得到LBZSQH701；
取LBZSQH701经SephadexLH-20分离，甲醇体系洗脱，得到馏分LBZSQH701S11；
(3)纯化：
取LBZSQH701S11经Pre-HPLC分离，得到馏分LBZSQH701S11P4；LBZSQH701S11P4再经Semi-Pre-HPLC纯化，得到鞣花鞣质二聚体化合物。
3.根据权利要求2所述的具有抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的鞣花鞣质二聚体化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取：
取蓝布正药材加甲醇浸泡提取，蓝布正药材和甲醇的质量体积比为1:7.5，每次提取时间2d，共提取3次，合并提取液，在45℃减压浓缩干燥，得到蓝布正浸膏，将蓝布正浸膏加水超声溶解后过滤，得到上清液；
(2)分离：
取步骤(1)的上清液经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用水、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，得到馏分LBZSQH70；
取馏分LBZSQH70经正相中压柱色谱分离，用体积比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱，收集馏分LBZSQH70-1～LBZSQH70-12，将LBZSQH70-1～3合并得到LBZSQH701；
取馏分LBZSQH701经SephadexLH-20分离，甲醇体系洗脱，得到馏分LBZSQH701S11；
(3)纯化：
取步骤(2)的LBZSQH701S11经Pre-HPLC分离，流动相A相为H2O，B相为MeOH，得到馏分LBZSQH701S11P4；取馏分LBZSQH701S11P4经Semi-Pre-HPLC纯化，流动相A相为：含0.1％三氟乙酸的H2O，B相为乙腈，得鞣花鞣质二聚体化合物。
4.权利要求1所述的鞣花鞣质二聚体化合物在制备抗氧化、抗衰老的药物中的应用。
5.权利要求1所述的鞣花鞣质二聚体化合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
6.根据权利要求4或5的应用，将鞣花鞣质二聚体化合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
7.一种抗氧化、抗衰老的药物，其特征在于，它包括权利要求1所述的鞣花鞣质二聚体化合物。
8.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，它包括权利要求1所述的鞣花鞣质二聚体化合物。
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