CN116217456A

CN116217456A - 一种具有吡咯丁胺骨架的酰胺类化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116217456A
Application number: CN202211276742.8A
Authority: CN
Inventors: 程艳刚; 谭金燕; 王颖莉; 李建丽
Original assignee: Shanxi University of Chinese Mediciine
Current assignee: Shanxi University of Chinese Mediciine
Priority date: 2022-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明公开一种具有吡咯丁胺骨架的酰胺类化合物及其制备方法与应用。本发明提供的酰胺类化合物，具有式(I)或式(II)所示结构式。本发明采用正相硅胶柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离和制备型HPLC分离纯化对华山参乙醇提取物进行分离纯化，得到2个新的酰胺类成分，分别为式(I)所示的physolamide A和式(II)所示的physolamide B。通过对新酰胺类化合物的活性研究发现，其具有抗炎活性，具有制备成抗炎药物的潜力。

Description

一种具有吡咯丁胺骨架的酰胺类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种具有吡咯丁胺骨架的酰胺类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

华山参(Physochlainae Radix)是茄科泡囊草属植物漏斗泡囊草的干燥根，因主产于华山而得名，在陕西、河南、山西等省均有分布。华山参性温，味甘、微苦；具有温肺祛痰、平喘止咳、安神镇惊的功效，主要用于治疗寒痰喘咳，惊悸失眠等症，在民间常被用于治疗咳喘、肺痨。此外，华山参对于胃腹疼痛、神经衰弱、精神分裂等也有一定的疗效。

CN111848436A公开了从中药华山参中发现的一种新式Ⅰ或Ⅱ酰胺类化合物，并发现其可以用于制备CREB激活剂药物，促进神经元发育、再生、突触形成及修复，促进学习记忆，以及抗焦虑或抗抑郁药物的前景。

然而，目前对于华山参中活性物质的研究并不多，对于其中发挥各种功效的活性物质还有待于进一步开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的酰胺类化合物及其制备方法与应用。该酰胺类化合物具有吡咯丁胺骨架结构，并具有抗炎活性，可用于制备治疗炎症疾病药物。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种酰胺类化合物，具有式(I)或式(II)所示结构式：

式(I)所示化合物：

分子式：C₁₉H₂₂N₂O₅；

ESI-MS m/z：357.1473[M-H]^-；

状态：淡黄色油状物；

比旋光度：

式(II)所示化合物：

分子式：C₂₀H₂₄N₂O₅；

ESI-MS m/z：371.1607[M-H]^-；

状态：淡黄色油状物；

比旋光度：

第二方面，本发明提供了所述酰胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用乙醇浸提粉碎后的华山参，所得浸提液经浓缩得到粗浸膏；

S2、所述粗浸膏经水分散后，依次采用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇进行萃取，得到正丁醇部位浸膏；

S3、所述正丁醇部位浸膏依次经正相硅胶柱色谱分离、反相ODS柱色谱分离及制备型HPLC分离纯化，得到式(I)或式(II)所示酰胺类化合物。

步骤S1中，所述乙醇的体积浓度为50％-95％；优选体积浓度为70％，所述乙醇的用量为所述华山参重量的10-20倍。

所述浸提的温度为室温；所述浸提的次数为1-3次。

所述浸提液经减压浓缩得到粗浸膏；所述减压浓缩的温度为30-50℃。

步骤S2中，所述萃取的条件如下：

水与所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述水饱和的正丁醇的体积比均为1：1～3：1～3：1～3；优选为1:1:1:1。

每种溶剂萃取的次数为2-5次。例如，所述粗浸膏加入蒸馏水分散均匀，随后依次用石油醚萃取2次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到石油醚萃取物浸膏；然后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物浸膏；再用水饱和的正丁醇萃取5次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到正丁醇萃取物浸膏；蒸馏水与石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇的体积比为1:1:1:1。

步骤S3中，所述正丁醇部位浸膏经正相硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，洗脱比例依次为50:0，50:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:1，薄层色谱检识各洗脱液并合并相似流分，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到15个组分，标记为Fr.1-15；

取组分Fr.9依次经所述反相ODS柱色谱和所述制备型HPLC分离纯化，得到式(I)所示酰胺类化合物；

取组分Fr.8依次经所述反相ODS柱色谱和所述制备型HPLC分离纯化，得到式(Ⅱ)所示酰胺类化合物。

进一步地，所述正相硅胶柱色谱分离过程中，每一洗脱比例所述流动相的用量为2～4个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/4为一份收集，得到120份洗脱液；

所述薄层色谱检识中，以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm紫外灯光下和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～4份、第5～9份、第10～14份、第15～22份、第23～31份、第32～47份、第48～56份、第57～68份、第69～86份、第87～94份、第95～102份、第103～108份、第109～113份、第114～118份、第119～120份洗脱液，按顺序依次得到组分Fr.1-15。

优选地，在进行所述正相硅胶柱色谱分离前，先将正丁醇萃取物浸膏加入适量甲醇进行复溶，随后拌样于80～120目硅胶中，并湿法装柱、干法上样于装有200～300目硅胶的色谱柱中。

进一步地，所述式(I)所示酰胺类化合物的制备条件如下：

所述组分Fr.9经所述反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，洗脱浓度依次为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇，薄层色谱检识各洗脱液并合并相似流分，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到组分Fr.9A～9I；

取组分Fr.9E经所述制备型HPLC分离纯化，以甲醇-水为流动相，洗脱比例为47:53，得到式(I)所示酰胺类化合物。

所述反相ODS柱色谱分离中，每一洗脱浓度所述流动相的用量为1～3个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/5为一份收集，得到118份洗脱液；

所述薄层色谱检识中，以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm紫外灯光下和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～4份、第5～19份、第20～44份、第45～57份、第58～62份、第63～89份、第90～99份、第100～112份、第113～118份洗脱液，按顺序依次共得到9个组分，标记为组分Fr.9A～9I；

进一步地，式(II)所示酰胺类化合物的制备条件如下：

所述Fr.8组分经所述反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，浓度依次为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇，薄层色谱检识各洗脱液并合并相似流分，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到组分Fr.8A～8J；

取组分Fr.8E经所述制备型HPLC分离纯化，以甲醇-水为流动相，洗脱比例为57:43，得到式(II)所示酰胺类化合物。

进一步地，所述反相ODS柱色谱分离中，每一洗脱浓度所述流动相的用量为1～3个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/4为一份收集，依顺序得到98份洗脱液；

所述薄层色谱检识中，以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～3份、第4～16份、第17～29份、第30～47份、第48～54份、第55～62份、第63～78份、第79～85份、第86～91份、第92～98份洗脱液，按顺序共得到10个组分，标记为组分Fr.8A～8J；

本发明中，所述制备液相色谱的色谱柱为C18柱。

第三方面，本发明还提供所述酰胺类化合物在制备治疗炎性疾病的药物中的应用；所述药物为前药或药学上可接受的盐。

优选地，所述药物为具有抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎性因子NO功能的药物。

相比现有技术，本发明所取得的有益效果如下：

1、本发明首次从华山参中分离并鉴定出两个新酰胺类化合物，分别为physolamide A和physolamide B。新化合物physolamide A和physolamide B具有吡咯丁胺骨架，这是首次在茄科植物中发现具有该骨架类型的酰胺类化合物。

2、本发明通过三种分离方式相结合并优化洗脱比例，分离得到新化合物physolamide A和physolamide B。

3、本发明通过体外抗炎试验发现，化合物physolamide A和physolamide B对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的NO释放具有抑制作用，因此化合物physolamide A和physolamide B在开发成抗炎药物方面存在潜力。

附图说明

图1为化合物physolamide A的氢谱谱图。

图2为化合物physolamide A的碳谱谱图。

图3为化合物physolamide A的质谱谱图。

图4为化合物physolamide A的DEPT-135谱图。

图5为化合物physolamide A的HSQC谱图。

图6为化合物physolamide A的¹H-¹H COSY谱图。

图7为化合物physolamide A的HMBC谱图。

图8为physolamide A的¹H-¹H COSY和关键HMBC相关。

图9为化合物physolamide B的氢谱谱图。

图10为化合物physolamide B的碳谱谱图。

图11为化合物physolamide B的质谱谱图。

图12为化合物physolamide B的DEPT-135谱图。

图13为化合物physolamide B的HSQC谱图。

图14为化合物physolamide B的¹H-¹H COSY谱图。

图15为化合物physolamide B的HMBC谱图。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

仪器与材料：

华山参药材于2021年9月购自于河南省确山市。

Bruker Ascend-600 MHz型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)。

Q Exactive Focus LC-MS/MS液质联用色谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

Büchi pump Manager C-610型中压色谱仪(瑞士Büchi公司)。

Waters 2695-2998-2414分析型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

岛津Essentia LC-16P制备型高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)。

Sharpsil-U C18制备型色谱柱(21.2mm×250mm，5μm，柯澜木实验科技(上海)有限公司)。

Sharpsil-U C18分析型色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，柯澜木实验科技(上海)有限公司)。

柱色谱硅胶(200～300目、80～120目，青岛海洋化工厂)。

柱色谱ODS(日本YMC公司)。

色谱级甲醇(瑞典OCEANPAK公司)。

其他试剂均为分析纯(天津致远化学试剂有限公司)。

实施例1、化合物physolamide A和化合物physolamide B的制备及结构确认

制备方法包括如下步骤：

(1)浸提：

取干燥的华山参10kg，粉碎成均匀的小块状，用20倍70％乙醇在室温下浸提3次，每次7天。合并浸提液，采用旋转蒸发仪减压浓缩(40℃)，得到粗浸膏2.05kg。

(2)萃取：

粗浸膏加入20L蒸馏水分散均匀，随后依次用20L石油醚萃取2次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到石油醚萃取物浸膏112.6g；用20L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物浸膏347.2g；用20L水饱和的正丁醇萃取5次，合并萃取物，经旋转蒸发仪减压浓缩，得到正丁醇萃取物浸膏545.2g。

(3)分离及纯化：

取正丁醇萃取物浸膏400g，加入适量甲醇进行复溶，随后拌样于500g、80～120目硅胶中，并湿法装柱、干法上样于硅胶色谱柱中(玻璃色谱柱中装入2.5kg、200～300目硅胶)。

硅胶色谱柱以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，洗脱比例为50:0～0:50(比例依次为：二氯甲烷-甲醇＝50:0，50:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:1，v/v)，每一洗脱比例所述流动相的用量为2～4个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/4为一瓶收集，按顺序依次得到第1～120瓶洗脱液；

以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm紫外灯光下和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～4瓶、第5～9瓶、第10～14瓶、第15～22瓶、第23～31瓶、第32～47瓶、第48～56瓶、第57～68瓶、第69～86瓶、第87～94瓶、第95～102瓶、第103～108瓶、第109～113瓶、第114～118瓶、第119～120瓶洗脱液，按顺序依次得到组分Fr.1-15。

(4)取组分Fr.9(第69～86瓶洗脱液)经反相ODS柱色谱以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，洗脱浓度为10％-100％甲醇(浓度依次为：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇)，每一洗脱浓度所述流动相的用量为1～3个柱体积，按照所述柱体积的1/5为一瓶收集，按顺序依次得到118份洗脱液；

以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm紫外灯光下和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～4瓶、第5～19瓶、第20～44瓶、第45～57瓶、第58～62瓶、第63～89瓶、第90～99瓶、第100～112瓶、第113～118瓶洗脱液，按顺序依次共得到9个组分，标记为组分Fr.9A～9I。

(5)组分Fr.9E(第58～62瓶洗脱液)经制备型HPLC纯化以甲醇-水(47:53)为流动相进行洗脱，得到化合物physolamide A(11.4mg)。

(6)组分Fr.8(第57～68瓶洗脱液)经反相ODS柱色谱以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，洗脱浓度为10％-100％甲醇(浓度依次为：10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇)，每一洗脱浓度所述流动相的用量为1～3个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/4为一瓶收集，按顺序依次得到第1～98瓶洗脱液；

以10％硫酸-乙醇为显色剂，用薄层色谱在254nm、365nm和日光下检测各个洗脱液，合并色谱行为相似的第1～3瓶、第4～16瓶、第17～29瓶、第30～47瓶、第48～54瓶、第55～62瓶、第63～78瓶、第79～85瓶、第86～91瓶、第92～98瓶洗脱液，按顺序依次共得到10个组分，标记为组分Fr.8A～8J。

(7)组分Fr.8E(第48～54瓶洗脱液)经制备型HPLC纯化以甲醇-水(57:43)为流动相进行洗脱，得到化合物physolamide B(11.1mg)。

结构确认：

physolamide A为淡黄色油状物。HRESIMS在m/z 357.1473给出[M-H]^-离子峰(计算值为357.1451)，推测分子式为C₁₉H₂₂N₂O₅。

¹H-NMR谱(表1)中可见1组相互偶合的烯质子信号[δ_H 6.35(1H,d,J＝15.7Hz,H-2)和7.38(1H,d,J＝15.7Hz,H-3)]以及1组典型的ABX偶合系统中的芳香质子信号[δ_H 7.00(1H,d,J＝2.1Hz,H-5),6.76(1H,d,J＝8.2Hz,H-8)和6.91(1H,dd,J＝8.2,2.1Hz,H-9)]，推测结构中包含反式咖啡酰结构片段。

结合¹³C-NMR和DEPT谱可以清晰的观察到19个碳信号，其中包括9个咖啡酰片段碳信号(δ_C 169.3,118.4,142.2,128.3,115.0,146.7,148.7,116.4,122.1)、4个相邻亚甲基碳信号(δ_C 40.0,27.7,29.8,46.3)、1个醛基碳信号(δ_C 180.9)、1个羟甲基碳信号(δ_C56.5)和4个吡咯环碳信号(δ_C 133.5,126.4,111.5,144.5)。其¹H-¹H COSY和HMBC谱能够进一步证实结构。在¹H-¹H COSY谱中能够清晰的观察到图8中粗线标记的直接连接的片段，随后再通过HMBC谱将上述几个片段进行勾连，如图8中箭头所示：H-6′(δ_H 6.98)分别与C-5′(δ_C 133.5)、C-8′(δ_C 144.5)、C-10′(δ_C 180.9)存在相关；H₂-9′(δ_H 4.63)分别与C-7′(δ_C111.5)、C-8′(δ_C 144.5)存在相关；H₂-4′(δ_H 4.39)分别与C-5′(δ_C 133.5)、C-8′(δ_C 144.5)存在相关。以上相关图谱构建出1个(2-甲酰基-5-羟基甲基)-吡咯丁胺结构片段。此外，H₂-1′(δ_H 6.35)与C-1(δ_C 169.3)之间存在HMBC相关，将上述的咖啡酰片段和(2-甲酰基-5-羟基甲基)-吡咯丁胺片段进一步连接起来。因此，其结构最终被确定并命名为physolamideA。

化合物physolamide A的结构如式(I)所示：

分子式：C₁₉H₂₂N₂O₅

ESI-MS m/z：357.1473[M-H]^-

状态：淡黄色油状物

比旋光度：

physolamide B为淡黄色油状物。HRESIMS在m/z 371.1628给出[M-H]-离子峰(计算值为371.1607)，推测分子式为C₂₀H₂₄N₂O₅。分析发现其与physolamide A有高度相似的一维核磁共振波谱数据，因此推测二者具有相同的骨架。它们的主要区别在于physolamide B存在额外的甲氧基[δ_H 3.34(3H,s)、δ_C 58.2]，并且通过δ_H 3.34和C-9′(δ_C66.4)间存在的HMBC相关可以将该甲氧基与C-9′位连接起来。因此，其结构最终被确定并命名为physolamide B。

化合物physolamide B的结构如式(II)所示：

分子式：C₂₀H₂₄N₂O₅

ESI-MS m/z：371.1607[M-H]^-

状态：淡黄色油状物

比旋光度：

表1.¹H-NMR(600MHz,methanol-d₄)和¹³C-NMR(150MHz,methanol-d₄)数据

实施例2、physolamide A和physolamide B的抗炎活性

本研究采用LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型，考察化合物physolamide A和physolamide B的抗炎活性。

具体方法如下：

(1)细胞毒性：

RAW264.7细胞常规方法复苏后，置于含10％胎牛血清和100U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中于37℃、5％ CO₂条件下培养。取对数生长期的细胞100μL，以密度为1×10⁵cell/mL接种于96孔板中，每组3个复孔。待细胞完全贴壁后，吸去培养基，给药组给予50μM含药培养基，对照组给予100μL正常培养基，空白组仅含正常培养基，继续于上述培养条件下培养24h后，加入10μL CCK-8后培养2h，随后用酶标仪于450nm下检测各孔吸光度值，计算化合物physolamide A和physolamide B对RAW264.7细胞毒性。

(2)抗炎活性：

取对数生长期的RAW264.7细胞100μL，以密度为1×10⁵cell/mL接种于96孔板中，每组3个复孔。吸取培养基，除空白组外，其余加入100μL含1μg/mL LPS的DMEM培养基孵育24h后，空白组和模型组加入100μL DMEM培养基，给药组加入100μL含各浓度(终浓度为5，10，20，30，50μM/L)药物的DMEM培养基，吲哚美辛(indomethacin)作为阳性药。培养结束后取上清100μL转至另一个96孔板中，分别加入Griess试剂A液和B液各50μL，避光显色30min，于540nm下检测各孔吸光度值。

根据公式计算其抑制率：抑制率＝(模型组吸光度值-给药组吸光度值)/(模型组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。

表2.化合物physolamide A和physolamide B对LPS诱导的RAW264.7的NO释放的抑制作用

实验结论：

(1)细胞毒实验结果表明，在浓度为1-50μM/mL之间时，化合物physolamide A和physolamide B对RAW264.7细胞均无细胞毒性作用；

(2)化合物physolamide A和physolamide B对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的NO释放具有抑制作用，IC₅₀分别为15.27μM和17.54μM。因此，化合物physolamide A和physolamide B在开发成抗炎药物方面具有一定的潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种酰胺类化合物，具有式(I)或式(II)所示结构式：

2.权利要求1所述酰胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述乙醇的体积浓度为50％-95％；

所述乙醇的用量为所述华山参重量的10-20倍；

所述浸提的温度为室温；

所述浸提的次数为1-3次；

4.根据权利要求2或3所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述萃取的条件为：

水与所述石油醚、所述乙酸乙酯和所述水饱和的正丁醇的体积比为1：1～3：1～3：1～3；

每种溶剂萃取的次数为2-5次。

5.根据权利要求2-4任一所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述正丁醇部位浸膏经正相硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱，洗脱比例依次为50:0，50:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:1，薄层色谱检识各洗脱液并合并相似流分，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到15个组分，标记为Fr.1-15；

6.根据权利要求5所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：所述正相硅胶柱色谱分离过程中，每一洗脱比例所述流动相的用量为2～4个柱体积，每一份洗脱液按所述柱体积的1/4为一份收集，得到120份洗脱液；

7.根据权利要求5或6所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：式(I)所示酰胺类化合物的制备条件如下：

8.根据权利要求5或6所述的酰胺类化合物的制备方法，其特征在于：所述Fr.8组分经所述反相ODS柱色谱分离，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，浓度依次为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％甲醇，薄层色谱检识各洗脱液并合并相似流分，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到组分Fr.8A～8J；

9.权利要求1所述酰胺类化合物在制备治疗炎性疾病的药物中的应用；

所述药物为前药或药学上可接受的盐。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物为具有抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎性因子NO功能的药物。