CN117658777A - 艾里莫酚型倍半萜化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种艾里莫酚型倍半萜化合物，所述艾里莫酚型倍半萜化合物从乌药根部提取，通过硅胶柱层析等方法分离纯化，得到的两种化合物都对乳腺癌细胞具有良好的抗增殖活性，可用于制备抗肿瘤化合物。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体而言，涉及乌药根中两个新艾里莫酚型倍半萜类化合物及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤。尽管临床医生和基础科学家对乳腺癌进行了广泛的研究，但是乳腺癌患者的治疗效果仍不理想。乳腺癌患者个性治疗是癌症治疗的重要原则之一。手术切除、放射疗法、化学疗法和靶向药物治疗已经成功应用于乳腺癌患者的治疗，然而手术切除针对早期乳腺癌治疗较为有效，但其中75-80％已经发生淋巴结转移的患者将会在10年内出现复发或者为转移性乳腺癌，最终死于乳腺癌，同时手术切除针对转移性乳腺患者效果是不佳的。放射疗法和化学疗法具有较大的副作用，严重影响乳腺癌患者的生活质量。因此中药在乳腺癌患者的治疗方案中越来越被人们广泛的关注。例如人参皂苷R3能够抑制雌激素阳性人乳腺癌细胞MC℉-7增殖和转移，并诱导其凋亡，抑制MCF-7细胞侵袭能力(陈云，张竝，俞勇.人参皂苷Rg3对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的影响[J].中国现代应用药学，2013,30(7)：722-725)。
乌药(Lindera aggregata(Sims)Kosterm)又名天台乌药、铜钱树、香叶子、香柴等，是樟科山胡椒属植物。乌药在我国资源丰富，主要分布于浙江、安徽、湖南、广东及广西等省区，具有较大的开发价值。2018年，乌药因其道地性强、疗效突出、产量规模大等优点，被浙江省确定为新“浙八味”之一。乌药的药用部位是呈纺锤形的块根，中心颜色较深，气香，味辛性温，归肺、脾、肾、膀胱四经。乌药入药最早记载于宋代《开宝本草》，该药内服主治恶心腹痛，消化不良、遗尿尿频等。此外，乌药还具有疏肝理气解郁的疗效，天合乌药散、四磨汤和暖肝煎以乌药入厥阴肝经，行气疏肝，温肝散寒为君药。而主治肝癌，瘀血凝结，两胁刺痛的疏肝散瘀汤中乌药也发挥其柔肝养肝的作用。现代天然药物化学研究表明，乌药具有抗肿瘤、抗炎、抑菌、抗凝血和保肝等活性，其次级代谢产物有极大开发前景。本发明中涉及的源自乌药根中的艾里莫酚型倍半萜类化合物(1、2)，具有良好的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的是提供乌药根中艾里莫酚型倍半萜类化合物(1、2)及其制备方法与其在抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
第一方面，本发明提供一种艾里莫酚型倍半萜化合物，所述艾里莫酚型倍半萜类化合物为下列之一：
优选地，所述艾里莫酚型倍半萜类化合物为式1所示化合物。
第二方面，本发明还提供所述艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法。本发明所述半萜类化合物1、2是从乌药(Lindera aggregata(Sims)Kosterm)根部提取得到。乌药，为樟科植物乌药的干燥块根，广泛分布于中国南方地区，具有顺气止痛，温肾散寒之功效。具体所述方法为：
(1)将干燥的乌药(Lindera aggregata(Sims)Kosterm)根的碎片(优选为粉碎、过筛(80目)所得的乌药根粉末)用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提，过滤，所得滤液减压浓缩，得到粗浸膏；
(2)将步骤(1)所述的粗浸膏均匀分散于水中，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)步骤(2)所述的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析依次以体积比为15：1、10：1、8：1、6：1、4：1、2：1、1：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2～3个柱体积，分别收集体积比为4：1和2:1的洗脱部分，减压浓缩，得到组分A和组分B；
(4)取步骤(3)中所述的组分B以体积比为50:50的甲醇和水的混合溶剂进行MCI柱洗脱，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物B1；
所述浓缩物B1进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析依次以体积比为5:1、4:1、3：1、2：1、1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物B2；
所述浓缩物B2溶解在甲醇中，进行ODS C-18柱层析，所述ODS C-18柱层析依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0的甲醇和水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得式1所示艾里莫酚型倍半萜化合物；
(5)取步骤(3)所述的组分A用MCI柱依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A1；
将所述浓缩物A1以体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A2；
所述浓缩物A2溶解在甲醇中，以体积比为40：60的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行ODS C-18柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A3；
所述浓缩物A3以体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A4；
所述浓缩物A4通过半制备型高效液相色谱、以体积比为79:21的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，收集tR＝22.3min部分的洗脱液，减压浓缩，得到式2所示艾里莫酚型倍半萜化合物。
进一步，步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积以所述乌药根的质量计为5L/kg。
本发明推荐步骤(1)中所述浸提的操作为：常温(20～30℃)下，将乌药根的碎片浸没于所述乙醇水溶液，静置浸泡7天。
在本发明的实施例中，出于经济考虑，步骤(1)所述滤液在减压浓缩过程中回收的乙醇可以用于再次对滤渣进行浸提两次，然后合并三次得到的粗浸膏用于下一步提取。
进一步，步骤(2)中所述水的体积以所述粗浸膏的质量计为9-11L/kg(优选10L/kg)。
进一步，步骤(2)中所述硅胶柱层析用200～300目硅胶干法装柱，所述硅胶与所述乙酸乙酯萃取物的质量比为1∶1。
进一步，步骤(5)中所述半制备型高效液相色谱的柱选用Zorbax SB-C18，直径：9.4mm，L：250mm，粒径：5μm；所述洗脱剂的流速为1.5mL/min。
上述洗脱过程包括步骤(3)中都可进行TLC检测，以氯仿：甲醇体积比50：1为展开剂，在紫外灯下无吸收，将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3为目标化合物2的点；以氯仿：甲醇体积比30：1为展开剂，在紫外灯下无吸收，将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3为目标化合物1的点。
第三方面，本发明提供所述艾里莫酚型倍半萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述艾里莫酚型倍半萜类化合物为式1所示化合物。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为MCF-7细胞。
本发明所涉及的新倍半萜类化合物，能够抑制抗MCF-7细胞增值作用，具有良好的抗肿瘤活性作用，可用于制备抗肿瘤药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明涉及两种结构新颖的化合物1和2，在现有抗乳腺癌药物中未见报道。经过细胞水平实验验证，该化合物对乳腺癌细胞具有良好的抗增殖活性，可用于制备抗肿瘤化合物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1:新化合物1、2的分离提取
将乌药根10kg粉碎打磨至粉末状，用80目筛子过筛。室温(20～30℃)下用50L95％(体积分数)乙醇(含水)浸泡提取，静置浸泡七天，过滤，所得滤液减压回收乙醇，得到粗浸膏，回收的乙醇再次浸泡滤渣。重复浸提3次，合并粗浸膏共1200g。粗浸膏悬浮于13L水中，用乙酸乙酯3L萃取3次，减压浓缩乙酸乙酯层，得乙酸乙酯萃取物265g。
将乙酸乙酯萃取物256g，与200-300目硅胶(256g)拌样，用200-300目硅胶干法装柱(5120g)，硅依次以石油醚:乙酸乙酯＝15:1→1:1(15:1,10:1,8:1,6:1,4:1,2:1,1:1)梯度洗脱，每一个梯度依次洗脱2～3个柱体积，收集石油醚：乙酸乙酯体积比4：1和2:1洗脱部分，分别减压浓缩为A段和B段。梯度洗脱过程中，可进行TLC检测，A段中，以氯仿：甲醇体积比50：1为展开剂，在紫外灯下无吸收，将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3为目标化合物2的点；B段中，以氯仿：甲醇体积比30：1为展开剂，在紫外灯下无吸收，将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3为目标化合物1的点。
组分B减压浓缩，MCI柱以甲醇-水体积比50:50等度洗脱，以氯仿：甲醇体积比30：1为展开条件，在365、254nm的紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩。后经硅胶柱色谱依次以石油醚：乙酸乙酯体积比5:1、4:1、3：1、2：1、1:1梯度洗脱，每一个梯度依次洗脱两个柱体积，以氯仿：甲醇体积比30：1为展开条件，在365、254nm的紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩。将122mg浓缩物溶解在1mL甲醇中，进一步通过ODS C-18柱层析以甲醇：水体积比30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0梯度洗脱，以氯仿：甲醇体积比30：1为展开条件，在365、254nm的紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩，得化合物1(34mg)。
组分A，使用MCI柱以甲醇：水体积比30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0梯度洗脱，每一个梯度依次洗脱两个柱体积，以氯仿：甲醇体积比50：1为展开条件，在365、254nm的紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显色，显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩。后硅胶层析以石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1等度洗脱，以氯仿：甲醇体积比50：1为展开条件，在365、254nm的紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩。浓缩物溶解在甲醇中，之后经过ODS C-18柱层析以甲醇：水体积比40:60等度洗脱，以氯仿：甲醇体积比50：1为展开条件，在紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流份合并减压浓缩。随后经过硅胶层析以氯仿:甲醇体积比100:1等度洗脱，以氯仿:甲醇＝50:1(体积比)为展开条件,在紫外灯下无显色，随后将TLC浸泡于10％的硫酸乙醇显色剂中，加热显黄绿色且Rf值为0.3的流分合并减压浓缩。随后，通过半制备型高效液相色谱，以甲醇：水体积比为79:21为溶液进行洗脱，收集tR＝22.3min部分的洗脱液，减压浓缩得到化合物2(16mg)。
实施例2：化合物1-2的结构鉴定
通过质谱核磁确定新化合物1、2的结构式如下：
化合物1的理化数据如下：无色单斜晶体，C15H26O2；(c 0.09,MeOH)；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ5.31(s,1H),4.26(s,1H),2.43(dd,J＝13.2,8.8Hz,1H),2.27–2.18(m,1H),1.99(dd,J＝8.7,3.6Hz,2H),1.71(d,J＝13.7Hz,1H),1.54–1.50(m,2H),1.48(d,J＝10.5Hz,2H),1.31(s,3H),1.19(s,3H),1.18–1.14(m,1H),0.97(s,3H),0.92(d,J＝6.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CD3OD)δ142.3,123.1,73.9,71.8,46.4,41.2,39.5,35.6,30.9,28.6,28.5,28.1,26.1,21.0,16.4.；IR(νmax):3328,2966,2920,1464,1435,1380,1276,1215,1146,1031,994,956,839,693cm-1；HR-ESI-MS:m/z 261.1827[M+Na]+(calcd.for C15H26NaO2 261.1825).
化合物2的理化数据如下：无色单斜晶体，C17H28O3；63.6(c 0.11,MeOH)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.38(d,J＝3.7Hz,1H),5.22–5.14(m,1H),2.74(dd,J＝13.7,8.9Hz,1H),2.16–2.10(m,1H),2.09(d,J＝1.3Hz,3H),1.99(d,J＝7.6Hz,2H),1.81–1.75(m,1H),1.53–1.49(m,2H),1.48–1.46(m,1H),1.47–1.43(m,1H),1.38–1.32(m,1H),1.21(d,J＝1.4Hz,3H),1.18(d,J＝1.4Hz,3H),0.96(d,J＝1.4Hz,3H),0.93–0.89(m,3H).；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.4,139.8,123.9,75.1,72.0,45.0,38.3,37.4,34.6,30.9,28.5,28.4,26.9,25.3,21.7,20.7,16.1.；IR(νmax):3423,1734,1463,1374,1245,1145,1025,963,834cm-1；HR-ESI-MS:m/z 303.1928[M+Na]+(calcd.for C17H28NaO3 303.1931).
实施例3：化合物抗肿瘤活性测试
实验方法：
1、细胞培养：MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素和链霉素)的达尔伯克(氏)必须培养基(DMEM)，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时，进行相关实验。
2、细胞活性检测：将对数生长期的MCF-7细胞制备成细胞悬液，按照5×103/孔密度加入96孔板，每孔100μL细胞悬液，24h后分别使用20μM浓度的化合物1、2处理细胞，以0.2μM的PTX(紫杉醇)作为对照组，培养24h后弃去培养液，将CCK-8(Cell Counting Kit-8)与DMEM完全培养液按1:10的比例稀释后，每孔加入100μL稀释液，避光在培养箱中继续孵育2h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD)值。
实验结果：细胞活性检测结果(表1)说明，用20μM的1-2作用于MCF-7细胞24h，20μM的化合物1对细胞活力有显著影响。
表1化合物1-2对MCF-7细胞的增值抑制活性
Claims (10)
1.一种艾里莫酚型倍半萜化合物，其特征在于所述艾里莫酚型倍半萜类化合物为下列之一：
2.如权利要求1所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于所述方法为：
(1)将干燥的乌药(Lindera aggregata(Sims)Kosterm)根的碎片用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提，过滤，所得滤液减压浓缩，得到粗浸膏；
(2)将步骤(1)所述的粗浸膏均匀分散于水中，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)步骤(2)所述的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析依次以体积比为15：1、10：1、8：1、6：1、4：1、2：1、1：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2～3个柱体积，分别收集体积比为4：1和2:1的洗脱部分，减压浓缩，得到组分A和组分B；
(4)取步骤(3)中所述的组分B以体积比为50:50的甲醇和水的混合溶剂进行MCI柱洗脱，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物B1；
所述浓缩物B1进行硅胶柱层析，所述硅胶柱层析依次以体积比为5:1、4:1、3：1、2：1、1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物B2；
所述浓缩物B2溶解在甲醇中，进行ODS C-18柱层析，所述ODS C-18柱层析依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0的甲醇和水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比30：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得式1所示艾里莫酚型倍半萜化合物；
(5)取步骤(3)所述的组分A用MCI柱依次以体积比为30:70、40:60、50:50、60:60、70:30、80：20、90:10、100:0的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A1；
将所述浓缩物A1以体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A2；
所述浓缩物A2溶解在甲醇中，以体积比为40：60的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行ODS C-18柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A3；
所述浓缩物A3以体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析，以体积比50：1的氯仿和甲醇的混合溶剂为展开剂进行TLC检测，合并Rf值为0.3的流份，减压浓缩，得到浓缩物A4；
所述浓缩物A4通过半制备型高效液相色谱、以体积比为79:21的甲醇与水的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，收集tR＝22.3min部分的洗脱液，减压浓缩，得到式2所示艾里莫酚型倍半萜化合物。
3.如权利要求2所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积以所述乌药根的质量计为5L/kg。
4.如权利要求2所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述浸提的操作为：常温下将所述乌药根的碎片浸没于所述乙醇水溶液，静置浸泡7天。
5.如权利要求2所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述水的体积以所述粗浸膏的质量计为9-11L/kg。
6.如权利要求2所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述硅胶柱层析用200～300目硅胶干法装柱，所述硅胶与所述乙酸乙酯萃取物的质量比为1∶1。
7.如权利要求2所述的艾里莫酚型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述半制备型高效液相色谱的柱选用Zorbax SB-C18，直径：9.4mm，L：250mm，粒径：5μm；所述洗脱剂的流速为1.5mL/min。
8.如权利要求1所述的艾里莫酚型倍半萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述艾里莫酚型倍半萜类化合物为式1所示化合物。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为MCF-7细胞。
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