CN1302823A - 一种聚羟基烷酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚羟基烷酸的生产方法,其技术特征是:采用圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G－3菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G－6菌株混合培养生产聚羟基烷酸。本发明消除了固氮菌培养过程中产生的荚膜多糖物质,提高了菌体的生物量,进而增高PHA的比产率,降低了生产成本,生物量最多达到53g/l,PHA量达42.4g/l,使PHA的成本降至每公斤4美元,只有现报道的世界最低成本每公斤16美元的1/4。
Description
本发明涉及一种聚羟基烷酸的生产方法。
20世纪随着石油化学工业的发展，合成塑料产品同人们的日常生活愈来愈密切，使合成塑料工业目前成为人类社会经济的一大主导产业，给人类社会带来了一定的繁荣。然而化学合成塑料制品的废弃物，却成为地球上一种无法处理的“白色垃圾”，给人类有限的生存环境带来严重的污染。因此，寻求一种理想的可被生物降解的塑料来替换石油化学合成塑料，就显得极为重要。用微生物生产可降解性塑料----聚羟基烷酸(简称PHA)，是替代化学合成塑料的一类热塑性材料。
PHA许多微生物在非平衡生长条件下合成的细胞内碳源和能源的贮藏物质，其分子通式可表述为
其中m=1,2或3，在大多数情况下m=1即β-羟基烷酸。n为单体的数目，R则代表侧链，多为不同的链长的正烷酸，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷酸，多数微生物产生的PHA中的R为甲基即聚β-聚羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate简称PHB)PHB是分布最广、发现最早的，是PHA中的主要成员，关于PHA的分子结构和PHA颗粒状况方面的大量研究集中于PHB。在PHB中，n=600-2500，分子量为6000-250000。熔点为180℃,PHB分子经X-射线分析表明PHB由多个D型3HB单元组成，呈右手α-螺旋结构，螺距为0.596nm，每圈有两个β-羟基丁酸组成。由于R基的不同，目前已发现了90多种不同单体组成的PHA，根据单体中碳原子的数目可以将PHA分为短链PHA,(short-chain-length PHA,scl PHA)，单体为含3-5个碳原子的羟基脂肪酸即PHB和P(HB-CO-HV)(聚β-羟基丁酸与β-羟基戊酸的共聚物)；另一类为中链PHA(medium-chain-lengthPHA,mcl PHA)，单体为含6-14个碳原子的羟基脂肪酸。
PHA除具有与化学合成塑料相类似的理化性质外，还具有可完全降解性，其制品同化学合成塑料一样，在工农业生产中具有广阔的应用前景。但不同的是PHA制品的废弃物不但可以完全降解，消除“白色污染”，而且降解物还可作为农用肥料，对农业发展大有好处。同时，PHA除具有可完全降解性外，生物合成还赋予它好的生物相容性、光学活性、压电性、无毒性和天然性等优良性状。因此，它也是医学上医疗植入和组织工程用最具应用前景的可降解性医用高分子材料。因此，PHA的开发研究一直引起世界科技界的关注。
目前国外对这一产品的研究，在理论上对微生物合成PHA的遗传背景、代谢途径，调控机制，PHA的分子结构、理化性质等已研究清楚。而且从应用上也获得了几株高产PHA的优良菌株及这些菌株的小规模生产工艺。另英国、韩国、美国亦有产品问世。从生产成本上看，目前PHA的生产成本太高，在占领市场上，无法与化学合成塑料相竞争。因此，降低PHA的生产成本，就成为目前该领域研究的关键课题。
80年代英国帝国化学公司(ICI)就工业规模生产PHB的技术和经济问题评估中，选取固氮菌、甲基营养菌和真养产碱杆菌作为首选菌株，但在评估中，因甲基营养菌PHB产率中等，PHB分子量小，提取较困难，故被放弃；固氮菌虽PHB胞内产率高，分子量又大，但由于它生长中还产多糖，而降低了PHB的比产率也被淘汰；最终选择了真养产碱杆菌。因为该菌株不但PHB含量高，分子量大，而且能利用各种较经济的碳源。自此以后真养产碱杆菌就成为全世界开发研究生产PHB的主要菌株，于是全世界也掀起了一股真养产碱杆菌的研究热。经过十多年的研究，人们以真养产碱杆菌为出发菌株，对PHB的遗传背景、代谢途径、调控机制、分子结构、理化性质已研究清楚，使真养产碱杆菌目前成为最具应用前景的一株产PHB的优良菌株，但其产率仍没有超过80％。
Page.W.J在Applied and Environmental Microbiology(1992,58:2866-2873)杂志中研究了采用固氮菌以葡萄糖为主要碳源，以戊酸、庚酸、壬酸等为辅助碳源合成P(HB-CO-HV)，以甜菜糖蜜和戊酸为碳源，38h到40h在2.5升发酵罐中得到19-22g P(HB-CO-HV),HV组分8.5-23mol％。Page.w.J在Appliedand Environmental Microbiology(1993,59:4236-4244)杂志中研究了采用固氮菌以葡萄糖为碳源，加0.1％鱼蛋白胨，在2.5升发酵罐中47h后，PHB占细胞干重79％，达32克/升；用甜菜糖蜜为碳源36h达66％,PHB为22克/升。
本发明的目的是提供一种PHA的高积累生产方法，并且使积累的PHA易于提取，以克服现有技术产率低、成本高的不足。
使用的微生物
用来生产本发明所述的聚羟基烷酸的微生物是：①圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G-3(以下简称G-3菌株)，其于1999年5月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC N0:M 99006。②巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G-6(以下简称G-6菌株)，已经由他人在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC AB92075，此菌株也可以从陕西省微生物研究所获得。
诱变改造G-3菌株
将30℃培养16h的圆褐固氮菌菌液，离心去除上清液，用PH=6.0、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤菌体2次，再用此缓冲液配成108细胞/ml菌悬液，加入化学诱变剂亚硝基胍(NTG)液使终浓度为600μg/ml,30℃水浴处理30min，间歇摇动，离心除去NTG，再用磷酸缓冲液洗1次，重悬在同样体积的缓冲液中，取1ml悬液加入50X 5min的小试管内，将试管置于激光束前方，从侧面照射菌悬液，激光器功率20mw，波长λ=632.8nm，扩束光斑直径0.3cm，照射距离30cm，照射时间15min，照射后的菌液作适当稀释后涂布平皿，30℃培养28-32h，挑单菌落接斜面，经上述诱变重复多次后，最后通过初筛和复筛获得一株产荚膜较弱的突变株，编号为固氮菌G-3菌株，该突变株除上述特性外，还表现出对葡萄糖利用能力减弱，而在蔗糖培养基中生长繁殖速度较快，利用蔗糖能力非常强的特性。
上述圆褐固氮菌G-3的生物学特性：固氮菌G-3在无氮培养基上生长旺盛，菌落为圆形，中凸，初起为乳白色，不粘，不光滑，老令时菌落为浅咖啡色，菌落较粘，有皱纹。G-3菌株发酵液的粘度比原始固氮菌低，且产生荚膜的时间比原菌株晚10多个小时，菌体易分离。
本发明的技术方案是采用圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G-3菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G-6菌株混合培养生产聚羟基烷酸，G-6菌株主要是利用G-3菌株在培养过程中积累的多糖进行生长。
混合培养能解决G-3菌株因培养液中还原糖浓度过高，粘度过大而引起的代谢阻遏作用，因为圆褐固氮菌在生长繁殖过程中能产生多糖物质作为荚膜的主要组分，在采用圆褐固氮菌进行分批补糖发酵过程中，补糖量高时上述荚膜物质积累增加，将影响发酵体系的氧和营养物质传递，而且还原糖过高将引起反馈阻遏，抑制菌的继续增殖，而巨大芽孢杆菌G-6在生长繁殖过程中，通过自身的代谢活动能产生一种聚糖酶而分泌到胞外，此酶能将环境中的聚糖降解成单糖或双糖，作为芽孢菌自身的营养物质而利用，并将多余的糖作为碳源在体外以PHA的形式积累起来。G-3菌株在利用蔗糖的情况下产生的大量聚糖物质，可作为G-6菌株生长所需的碳源，而G-6菌株在利用蔗糖物质作为营养物质进行繁殖的同时降低了发酵液的粘度，改善了发酵液的传质，为G-3菌株解除了生化反应的反馈抑制，提高了蔗糖的利用率。
发酵过程中菌体还原糖浓度随菌体的生物量的增加而增加，但在培养初期，10h开始补糖并没有影响到菌体的生物量增加，但当菌体培养到28h时还原糖浓度达6％时，补糖只能增加发酵液的粘度，发酵无法进行下去，这时菌体的生物量只能达到20g/L左右，这时如果接入G-6菌株，通过菌株繁殖就可利用还原糖而降低发酵液粘度，使补糖能进一步进行下去，促进菌体生长增加培养过程的生物量。
巨大芽孢杆菌G-6菌株适宜的培养条件。实验分两组进行，第一组在BM液体培养基中接入G-6菌株；第二组将G-3菌株在液体固氮菌培养基下培养至26h的培养物灭菌后，接入G-6菌株，两组均在30℃条件下进行摇床培养，并每隔一定时间测其各组培养物的OD600值，由表1可见，G-6菌株在G-3菌株的灭活培养液中，在无任何碳源物质加入的情况下比第一组生长良好，即G-6菌株更适合于在G-3菌株培养液中进行生长繁殖，其碳源可能是G-3菌株在胞外组成荚膜的多糖组分。表1第一组与第二组的结果对比时间(h) 4.5 9 12 15 18
第一组 1.8 2.4 2.8 3.0 2.9(OD600值)第二组 14 18 20 22 18.8注：第二组实验中接入G-6菌株的PH为6.5，同时补入NH4NO3
单独和混合培养G-3菌株与G-6菌株的生长和PHA的积累。G-3菌株先在2％蔗糖为碳源的液体选择培养基(以0.1％蛋白胨为氮源)培养至26h，其间分两次补入1.5g蔗糖，再接入10％G-6菌株种子培养物，同时加0.05％NH4NO3和0.05％蛋白胨培养至42h，对照分别为相同条件下的G-3菌株和G-6菌株的单独培养。结果如下表2所示。表2单独和混合培养G-3菌株与G-6菌株的生长和PHA的积累菌株 培养时间 生物量 PHA含量(％) YX/S RSG-3 42 14.8 80 0.37 3.2％G-6 16 1.2 21 0.05 1.5％G-3+G-6 42 17.9 81 0.45 0.24％注：YX/S为Yg生物量/g蔗糖，RS：还原糖
图1为混合培养物细胞形态；
图2为G-6菌株单独培养物细胞形态；
图3为G-3菌株单独培养物细胞形态；
由表2、图1、图2和图3可见，混合培养有利于G-3菌株提高生物量和PHA的转化率。G-6菌株的混合培养物细胞形态(图1)比G-6单独培养的细胞形态生长好(图2)；而G-3菌株在混合培养时由于降低多糖物质对其繁殖的抑制作用，并且发酵液的粘度下降，传质效果改变，有利于其生长繁殖，因此可见，也比单独培养G-3菌株生长良好，说明这两株菌具有良好、稳定的配伍性，可以建立一种互惠共生关系。
G-3菌株接入2％的蔗糖培养液中，在30℃、搅拌速度200rpm下培养26h后，接入G-6菌株，接入量为15％，并同时补加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3，向上述混合液中间歇补加30％蔗糖，测残糖达0.2-0.1％，放罐收集菌体，离心、干燥得干菌体，提取PHA。
PHA的提取可以采用以下三种方法：
1、CHCl3-H2O提取法
发酵液经4000rpm,20min离心后，收集细胞，水洗二次，无水乙醇洗脱一次，90℃干燥至恒重，转至回流提取器中，加入80倍体积的CHCl3溶液，在55℃下搅拌8小时，加入少量蒸馏水，剧烈搅拌1小时，滤膜过滤，收集有机相，减压浓缩回收CHCl3，浓缩液用冷甲醇沉淀，过滤、弃滤液，过滤产物干燥得PHA纯品。
2、NaClO-CHCl3两相萃取法
发酵液经4000rpm，20min离心后，收集细胞，水洗二次，无水乙醇洗脱一次，90℃干燥至恒重，向菌体中加入25倍体积的NaClO-CHCl3溶液在55℃下搅拌，4000rpm,30min离心，分为三层，用移液管吸取有机相，向有机相中加水，剧烈搅拌30min，静止使分层，过滤、取有机相，减压浓缩，浓缩液用冷甲醇沉淀，过滤、弃滤液，自然干燥，得PHA纯品。
3、SDS-NaClO法
发酵结束后，经100℃加热处理1分钟后，迅速冷却55℃，水洗三次，然后进行冷冻处理，收集菌体，向菌体中加入1％(W/V)SDS溶液，55℃搅拌下水浴15min，用3倍体积水洗涤，4000rpm离心20分钟，55℃下加入30％NaClO(V/V)作用30min，立即用10倍体积水洗涤，4000rpm离心20min，得沉淀再次用3倍体积水洗涤，4000rpm离心20分钟后，干燥得PHA白色粉末。
发酵过程中参数检测分析方法
1、还原糖测定方法。使用721分光光度计，使用3,5-二硝基水杨酸比色
定糖法。
2、蔗糖测定方法。Roe比色法。
3、生物量的测定法。
A、菌体浓度：发酵液稀释后用721分光光度计测600nm处OD值。
B、菌体干重：发酵液经离心(4000rpm/min)，再离心水洗1-2次，乙醇离心洗脱一次，90℃恒温干燥，至恒重，冷却后称量。
4、PHA含量的测定法，使用硫酸降解测定PHA法。
A、PHA紫外吸收(209nm)标准曲线的制作
称取系列标准PHB(sigma产品)，经100℃15分钟浓硫酸降解后，等梯度稀释，在209nm处测定紫外吸收，绘制标准曲线。
B、样品的测定
称取干菌体，加浓硫酸100℃作用15分钟后，稀释测其209nm的紫外吸收，
经查标准曲线得出PHA的浓度，最后计算出PHA占菌体干重的百分含量。
本发明消除了固氮菌培养过程中产生的荚膜多糖物质，提高了菌体的生物量，进而增高PHA的比产率，降低了生产成本。运用本混合培养方法生产PHA，菌体量即生物量最多达到53g/L，PHA量达42.4g/L，糖的转化率稳定在0.34左右，并且解决了圆褐固氮菌发酵生产PHA产生多糖，增加粘度而降低PHA的比产率问题。G-6菌株在混合培养中不产芽孢，且胞内PHA颗粒要比纯培养时大的多，PHA分子量大，达百万数量级，且PHA颗粒外无被膜，成熟细胞壁易破碎，这就使后工序提取变得容易。经过分析可能的原因是在混合培养中G-3菌株为G-6菌株提供了丰富的营养物质，在混合培养期间无限的延长了G-6菌株的生长对数期，使G-6菌株无法形成芽孢，而将过剩的碳源物质贮存在体内形成PHA颗粒。
本发明的实施例：
1、P(HB-CO-HV)的生产
将G-3、G-6菌株分别接入2％蔗糖发酵培养基中，摇瓶培养24h。
取G-3菌株上述培养物，以10％的量接入发酵罐中，并同时补加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3,30℃、200rpm继续培养，其间以30％浓度的蔗糖液进行3次间歇补糖，到34h，向发酵罐内加入0.5％的戊酸，并补糖一次，继续培养至42h放罐，收集菌体，采用连续离心法，得湿菌体。
上述湿菌体经100℃加热处理1分钟后，迅速冷却至55℃，水洗三次，然后进行冷冻处理(-20℃)，收集菌体，向菌体中加入1％(W/V)SDS溶液，55℃搅拌下水浴15min，用3倍体积水洗涤，4000rpm离心20分钟，55℃下加入30％NaClO(V/V)作用30min，立即用10倍体积水洗涤，4000rpm离心20min，得沉淀再次用3倍体积水洗涤，4000rpm离心20分钟后，干燥得P(HB-CO-HV)白色粉末，计算其产率占干细胞重量的86％。
2、PHB的生产
将G-3、G-6菌株分别接入2％蔗糖发酵培养基中，摇瓶培养24h。
取G-3菌株上述培养物，以10％的量接入发酵罐中，并同时补加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3,30℃、200rpm继续培养，其间以30％浓度的蔗糖液进行3次间歇补糖，继续培养至42h放罐，收集菌体，采用连续离心法，得湿菌体。
采用实施例1的提取方法提取PHB。
A、样品的定性检测
使用Fx-90Q核磁共振仪测1H谱。
检测条件：溶剂：CDCl3；温度：55℃；标准：TMS；谱宽：100HZ；观察频率：89.55MHZ；观察偏置：54.3KHZ；重复时间：1秒；累加16 X 15次。
检测样品为PHA中的P(HB-CO-HV)产品，HB和HV的比例为74∶26。
B、样品的分子量测定
采用粘度法(乌氏粘度计)。
实验条件：溶液浓度：C=0.25mg/ml；温度：30℃；溶剂：三氯甲烷，流出时间t0=45秒；溶液：流出时间t=124秒(四次平均)
计算得PHB分子量M=1.5 X 106。
C、熔点和结晶度的测定
采用差示扫描仪(DERKW-ELMER DSCT)测定PHB熔点为：166.35℃；PHB结晶度为57％。
3、将实施例1或2所得的湿菌体经过冷冻预处理(-20℃)，再干燥，直接用此干菌体注塑或模压加工化妆品盒和一次性包装袋，使PHA的成本降至每公斤4美元，只有现报道的世界最低成本每公斤16美元的1/4，且所得产品经过枪测符合应用要求，其检测结果见下表。以上检测结果由西安市产品质量监督检测所检测。
Claims (5)
1、一种聚羟基烷酸的生产方法，其特征是：采用圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)G-3菌株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G-6菌株混合培养生产聚羟基烷酸。
2、根据权利要求1所述的聚羟基烷酸的生产方法，其特征是：G-3菌株接入2％的蔗糖培养液中，在30℃、搅拌速度200rpm下培养26h后，接入G-6菌株。
3、根据权利要求2所述的聚羟基烷酸的生产方法，其特征是：G-6菌株的接入量为15％。
4、根据权利要求2或3所述的聚羟基烷酸的生产方法，其特征是：G-6菌株接入同时补加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3。
5、根据权利要求4所述的聚羟基烷酸的生产方法，其特征是：向混合液中间歇补加30％蔗糖。
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