CN1301811A - 一种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母及其生产方法,方法包括:工程菌酵母的制备及其高密度培养,所述的高密度培养的培养基配方为发芽黄豆10克,水100ml,煮后,溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克,配方中还含微量元素(铜、钻、钙、锌、钼、锰)各10－5—10－4克分子/升,6ml饱和延胡索酸铁溶液。本发明生产工艺简单,铁蛋白酵母的铁蛋白表达量高、每升可得15克干富铁酵母产品含铁量达5%,可用于正常人体铁的补充,也可用于缺铁病人的补铁。
Description
本发明涉及一种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母及其制备方法。
人体容易缺铁，特别是儿童和孕妇，目前医药上用无机铁(如硫酸亚铁)补充人体需要，以减少因缺铁而引起贫血症，但效果很差，因无机铁不易吸收，且口感不好，易引起恶心和降低食欲，国际上都正在以铁蛋白补铁为研究方向。我们曾用植物中的铁氧还蛋白(Ferredoxin)基因转化到大肠杆菌中用于提取补铁蛋白(申请号：98125609.0)。
本发明目的是提供一种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母及其生产方法，该方法中获得的工程菌酵母的铁蛋白表达量高，含铁量多。
为达到上述的目的，本发明采用以下技术方案：这种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母，它含有铁蛋白，每分子8.9KD的蛋白含有8个铁原子。
用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母的方法包括以下步骤：
①工程菌酵母的制备，它包括：重组质粒的构建，得到pYES2-psaC表达载体；酵母的转化，经电击法将表达载体进入酵母；
②转基因铁蛋白酵母的生产，它包括：转基因酵母在高密度的液体培养基上培养，再经破壁、干燥、粉碎得到粉末产品。
现在我们使用的铁蛋白(PsaC)是植物中广泛存在的一种蛋白质，例如，聚球兰藻中的铁蛋白，在它的每分子中含有8个铁原子，其分子量是8900道尔顿，也是一种非血晶质的铁。
以下结合实施例及附图对本发明作详细说明
图1．重组质粒pYES2-psaC构建图
图2．聚球兰藻psaC的基因序列和蛋白序列
图3．重组质粒pYES2-psaC的酶切鉴定图谱
图4．转PsaC基因酵母的Southern鉴定
图5．psaC基因在酵母中高效表达鉴定图谱
图2中，蛋白中的氨基酸用一字英文字母表示法。图3中，M为标准DNA(pBR322/BstNⅠ Marker)，Ⅰ为质粒的酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)结果。证明重组质粒构建正确。
图4中，1．质粒酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)；2．pYES2-psaC质粒；3．转基因酵母总DNA酶切(EcoRⅠ+BamHⅠ)：4．未转基因酵母总DNA对照。0.45kb为含有psaC基因片段，结果证明psaC基因已转化进入酵母。
图5中，1．标准蛋白分子量；2．pET3a-psaC在大肠杆菌中被表达的全蛋白对照；3．含pYES2空载酵母全蛋白对照；4．含pYES2-psaC的酵母全蛋白。证明psaC基因已在酵母中高效表达。
实施例1．工程菌酵母的制备
1．重组质粒的构建
首先将载有psaC基因的载体pUC19用XbaⅠ和NdeⅠ双酶切，获得的psaC DNA片段被克隆在pET-3a原核表达载体上。再将pET3a-psaC表达载体用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，所得psaC片段克隆在pYES2载体上，从而获得pYES2-psaC表达载体。构建策略见图1。
以重组质粒pYES2-psaC为模板，用T7启动子引物进行测序，经ABI PRISMTM777DNA测序仪测定，结果表明psaC序列完全正确，其核苷酸序列和氨基酸序列见图2，全序列由81个氨基酸残基组成。
2．重组质粒的酶切鉴定
pYES2-psaC表达载体的酶切鉴定图谱见图3。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到两条各为5.9kb和0.45kb的预期片断，0.45kb片段中含有psaC基因，证明构建完全正确。
3．酵母的转化
酵母在增殖培养基(1％酵母提取物(市场有售)，2％蛋白胨和2％葡萄糖)中30℃震荡培养至对数生长期，4000×g离心收集菌体。菌体用重蒸水洗涤一次，并用预冷山梨醇溶液(1mol/L)洗涤两次，得酵母悬液(OD值为200)。取40ul酵母悬液与5ul质粒DNA(100ug)混合，在150V,25uF和200Ω下电击4.2-4.9ms。电击后加入1ml预冷山梨醇溶液(1mol/L)，在选择性培养基(1mol/L山梨醇，0.17％YNB-AA/As,0.5％(NH4)2SO4，2％葡萄糖，0.01％L-His,0.01％L-Leu,0.01％L-Trp和2％琼脂)上，30℃培养，2-3天后出现克隆斑。
4．转化酵母的鉴定
经电击法将表达载体转化进入酵母后，对酵母的PsaC进行Southern杂交分析，分析结果如图4。由图4表明psaC基因已被整合到酵母中。
实施例2．转基因铁蛋白酵母的生产
转基因酵母在高密度的液体培养基上30℃通气培养12小时内即可达到对数生长期高峰，每升培养液可获得15克酵母干粉，产品含铁量达5％。培养基配方为：发芽黄豆10克，沸水100ml，煮30分后，溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克，配方中还含微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)各10-5-10-4克分子/升，6ml饱和延胡索酸铁溶液。
上述培养的酵母经高压细胞破碎仪破璧，上清液进行SDS-PAGE电泳测定，表明psaC基因被表达，电泳结果见图5。
大量生产上可经板框过滤得湿酵母，再加热干燥粉碎即可得富铁酵母粉。
本发明优点：
①首次用转植物铁蛋白基因到酵母中，并用于给人补铁。
②工程菌酵母的产物表达量高，不用纯化即可为人补铁，有利于工业化生产。
③面包酵母中除含有大量铁外，还有其它丰富的营养有助于人体健康。
④由于使用高密度培养基，酵母产量高，每升培养基可产生15克酵母干粉，产品含铁量达5％。
Claims (3)
1、一种可用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母，其特征在于：它含有铁蛋白，每分子8.9KD的蛋白含有8个铁原子。
2、一种生产权利要求1所述的用于人体补铁的转基因铁蛋白酵母的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
①工程菌酵母的制备，它包括：重组质粒的构建，得到pYES2-psaC表达载体；酵母的转化，经电击法将表达载体进入酵母；
②转基固铁蛋白酵母的生产，它包括：转基因酵母在高密度的液体培养基上培养，再经破壁、干燥、粉碎得到粉末产品。
3、按权利要求2所述铁蛋白酵母生产方法其特征在于所用的高密度培养基配方为：发芽黄豆10克，水100ml，煮后，溶液中加入蔗糖8克、酵母提取物1克、胰蛋白胨1克，配方中还含微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)各10-5-10-4克分子/升，6ml饱和延胡索酸铁溶液。
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