CN1297486A - 抗病毒载体 - Google Patents
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Abstract
提供一种病毒载体生产系统,该系统包含:(i)一种包含至少一条第一核苷酸序列的病毒基因组,所述的第一核苷酸序列编码一种基因产物,该基因产物能结合第二核苷酸序列或其转录产物,并直接或间接地影响第二核苷酸序列或其转录产物的裂解,所述第二核苷酸序列编码一种对病毒颗粒装配必须的病毒多肽;(ii)一种编码病毒基因组装配成病毒颗粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列,所述的第三核苷酸序列拥有与第二核苷酸序列不同的核苷酸序列,结果所述的第三核苷酸序列或其转录产物抵抗由所述的基因产物指导的裂解。可以用该病毒载体生产系统生产用于治疗或预防病毒感染的病毒颗粒。
Description
发明领域
本发明涉及新的病毒载体，所述的病毒载体能把抗病毒的抑制性RNA分子传递到靶细胞中。
发明背景
基因治疗应用于治疗AIDS和HIV感染已经进行了广泛的讨论(14)。提出的治疗基因的类型一般归入二种主要类型之一。在第一类型中，所述的基因编码蛋白产物，这些产物以许多可能的方式抑制病毒。上述蛋白的一个实例是HIV Rev蛋白的RevM10衍生物(16)。RevM10蛋白起反式显性(transdominant)负突变作用，所以在病毒中竞争性地抑制Rev的功能。象许多基于蛋白的策略，RevM10蛋白是天然HIV蛋白的衍生物。尽管该蛋白提供抗HIV效应的基础，但也有严重的缺点。尤其是，这种类型的策略需要在缺乏病毒时极少或没有基因表达。反之，携带该基因的健康细胞成为宿主细胞毒T淋巴细胞(CTL)系统的靶物，CTL系统识另外来蛋白(17,25)。治疗基因的第二种主要类型克服了这些CTL的问题。该治疗基因编码抑制性RNA分子；RNA不是CTL识别的靶物。所述的RNA分子可以是反义RNA(15,31)，核酶(5)或竞争性假目标(1)。
核酶是有酶活性的RNA分子，它催化序列特异的RNA加工。在近几年的文献中，广泛描述了核酶的设计和结构(3,7,31)。其中最强有力的系统是那些传递多靶核酶的种类，该多靶核酶能在多个位点裂解靶病毒RNA(5,21)。
近几年来，许多实验室开发了基于HIV的逆转录病毒载体系统(2,4,18,19,22-24,27,32,35,39,43)。在抗HIV基因治疗方面，相对于基于鼠的更常规载体如鼠白血病病毒(MLV)载体，这些载体有许多优点。首先，HIV载体将精确地靶向那些易受HIV感染的细胞(22,23)。其次，基于HIV的载体能转导一般难以被鼠载体转导的细胞诸如巨噬细胞(19,20)。第三，抗HIV基因组能通过任何逃逸治疗策略的病毒(HIV)，经CD4+细胞群体增殖(7)。这是因为该载体基因组具有能被病毒颗粒包装系统识别的包装信号。这些各种特征使HIV载体在抗HIV基因治疗领域成为一个有力的工具。
多靶核酶和基于HIV的载体的组合作为一种治疗策略是吸引人的。不过，直到现在这种策略才有可能。载体颗粒的产生，发生在表达该颗粒的包装组分并包装该载体基因组的生产细胞中。因此，设计成摧毁病毒RNA的核酶也将在载体产生过程中，能打断基于HIV载体系统的组分的表达。本发明的目的是克服这个问题。
本发明概述
因而本发明的一个目的是提供一种系统和方法，用于产生病毒颗粒，尤其是HIV颗粒，这些颗粒携带编码诸如核酶和/或反义RNAs的抑制性RNA分子的核苷酸构建体，这些分子在靶细胞中针对相应的病毒如HIV，从而解决上面所提到的问题。所述的系统包括一种编码抑制性RNA分子的病毒基因组，和编码在生产细胞中包装病毒基因组所需要的组分的核苷酸构建体。然而，与以前的技术相反，尽管包装组分拥有基本上与相应的靶病毒组分相同的氨基酸序列，但是该抑制性RNA分子在生产细胞中不影响病毒颗粒的生产，因为在病毒系统中所用的包装组分的核苷酸序列已经被修饰，以避免抑制性RNA分子影响从构建体产生的RNA转录物的裂解或降解。上述的病毒颗粒可以用于治疗病毒感染，尤其是HIV的感染。
因此，本发明提供一种病毒载体系统，该系统包括：
(ⅰ)一种编码下列基因产物的第一核苷酸序列，所述的基因产物能结合第二核苷酸序列或其转录产物，并直接或间接地影响第二核苷酸序列或其转录产物的裂解，所述第二核苷酸序列编码一种对病毒颗粒的装配必须的病毒多肽；
(ⅱ)一种编码病毒颗粒装配所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列拥有与第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，结果所述的第三核苷酸序列或其转录产物抵抗由所述的基因产物指导的裂解。
在另一方面，本发明提供一种病毒载体生产系统，该系统包括：
(ⅰ)一种包含至少一条第一核苷酸序列的病毒基因组，所述的第一核苷酸序列编码一种基因产物，该基因产物能结合第二核苷酸序列或其转录产物，并直接或间接影响第二核苷酸序列或其转录产物的裂解，所述第二核苷酸序列编码一种对病毒颗粒的装配必须的病毒多肽；
(ⅱ)一种编码病毒基因组装配进病毒颗粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列拥有与第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，结果所述的第三核苷酸序列或其转录产物抵抗由所述的基因产物指导的裂解。
一般来说，该基因产物是一种选自核酶或反义核酸的RNA抑制性序列，优选的是核酶。
优选地是，所述的病毒载体是一种逆转录病毒载体，更优选的是一种慢病毒载体，如HIV载体。一般来说，第二核苷酸序列和第三核苷酸序列来自相同的病毒物种，更优选的是来自相同的病毒株。一般来说，该病毒基因组来自相同的病毒物种，更优选的是来自相同的病毒株。
在逆转录病毒载体的情况下，病毒颗粒装配所需的多肽选自gag、pol和env蛋白。优选地是，至少gag和pol序列是慢病毒的序列，更优选的是HIV的序列。此外或另外，env序列是一种慢病毒的序列，更优选的是HIV的序列。
在一优选的实施方案中，第三核苷酸序列抵抗由基因产物所指导的裂解，该是因为由至少一个基因产物识别的裂解位点和/或针对至少一个基因产物的结合位点被移去的核苷酸序列中，一种或多种保守性改变引起。例如，当基因产物是一种核酶时，所述的第三核苷酸序列适合于抵抗由该核酶引起的裂解。
优选地，第三核苷酸序列是优化适于在宿主细胞中表达的密码子。宿主细胞(该术语包括生产细胞和包装细胞)一般是哺乳动物细胞。
在一特别优选的实施方案中，(ⅰ)病毒基因组是一种包含下列核苷酸序列的HIV基因组，所述的核苷酸序列编码抗HIV的核酶和/或抗HIV的反义序列，对抗在靶HIV中的HIV包装组分序列(如gag.pol)，以及(ⅱ)用于产生包装HIV颗粒的病毒系统进一步包含编码与靶HIV中相同的包装组分(如gag.pol蛋白)的核苷酸构建体，其中，该核苷酸构建体的序列与靶HIV中发现的序列不同，所以抗HIV的核酶和/或反义HIV序列，在生产细胞产生HIV颗粒的过程中，不影响gag.pol转录体的裂解或降解。
本发明也提供一种包含根据本发明病毒载体的病毒颗粒，和一种或多种由根据本发明的第三核苷酸序列编码的多肽。例如，本发明提供一种用本发明的病毒载体生产系统所产生的病毒颗粒。
在另一方面，本发明提供一种生产病毒颗粒的方法，该方法包括导入到宿主细胞中的下列物质：(ⅰ)一种根据本发明的病毒基因组载体；(ⅱ)一种或多种根据本发明的第三核苷酸序列；和(ⅲ)编码不是由一种或多种第三核苷酸序列编码的其他必须的病毒包装组分的核苷酸序列。
本发明进一步提供一种用本发明的方法所产生的病毒颗粒。
本发明也提供一种药物组合物，该组合物包括根据本发明的病毒颗粒与药学可接受的载体或稀释剂合用。
本发明的病毒系统或本发明的病毒颗粒可以用于治疗病毒感染，尤其是逆转录病毒感染，如包括HIV感染的慢病毒感染。因此，本发明提供一种治疗病毒感染的方法，该方法包括给患病毒感染的人或动物患者，施用有效量的本发明的病毒系统、病毒颗粒或药用组合物。
本发明特别涉及携带抗HIV核酶的基于HIV载体。然而，本发明可应用于任何其他的病毒，尤其是任何其他的慢病毒，用基因治疗来对付这些病毒可能是合乎需求的。本发明在此针对HIV进行说明，但是，不能认为这是把本发明的范围限制为基于HIV的抗HIV载体。本发明详述
术语“病毒载体”指的是一种核苷酸构建体，它包含能在宿主细胞中转录的一种病毒基因组，所述的基因组包含足够的病毒遗传信息，在包装组分的存在下允许包装病毒RNA基因组进入一种能感染靶细胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括逆转录并整合到适于具体病毒的靶细胞基因组中。一般来说，所用的病毒载体携带异源的编码序列(目的核苷酸)，该编码序列能被载体传递到靶细胞中，例如编码核酶的第一核苷酸序列。所述的病毒载体不能进行独立复制，以在最终的靶细胞中产生感染性病毒颗粒。
可以认为，术语“病毒载体系统”意指一套含有各部分的药盒，当与病毒颗粒产生所必须的其他组分组合时，用该药盒可在宿主细胞中产生病毒颗粒。例如，第一核苷酸序列一般可存在于一种质粒载体构建体中，该构建体适合于把第一核苷酸序列克隆到一种病毒基因组载体构建体中。当在药盒中和第三核苷酸序列(一般也存在于不同的质粒载体构建体中)组合时，含有第一核苷酸序列的质粒和含有第三核苷酸序列的质粒的组合结果包括了本发明的基本要素。然后，上述药盒可被技术人员用于产生合适的病毒载体基因组构建体，当和含有第三核苷酸序列的质粒或者编码其他病毒装配所需组分的核酸构建体一起转染到宿主细胞时，该表达载体基因组构建体可导致产生感染性病毒颗粒。
此外，第三核苷酸序列可稳定地存在于包装细胞系中，本药盒也包括该细胞系。
所述的药盒可以包括产生病毒颗粒所需的其他组分，如宿主细胞和编码病毒装配所需的基本病毒多肽的其他质粒。举例来说，该药盒可含有(ⅰ)一种含编码抗HIV核酶的第一核苷酸序列的质粒以及(ⅱ)一种含编码修饰的HIV gag.pol构建体的第三核苷酸序列的质粒，所述的HIV gag.pol构建体不能被抗HIV的核酶裂解。然后，选择性组分是(a)一种具有合适的限制酶识别位点的HIV病毒基因组构建体，通过这些位点把第一核苷酸序列克隆到病毒基因组中；(b)一种编码VSV-G env蛋白的质粒。另外，编码病毒颗粒装配所需的病毒多肽的核苷酸序列也在药盒中作为含有所述核苷酸序列的包装细胞系形式提供，例如表达VSV-G的细胞系。
术语“病毒载体产生系统”指的是上面所述的病毒载体系统，其中，第一核苷酸序列已经被插入到合适的病毒载体基因组中。
一般来说，病毒载体是逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体如HIV载体。本发明的逆转录病毒载体可衍生于或者来源于任何合适的逆转录病毒。大量的不同逆转录病毒已经被鉴定出来。这些例子包括：鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳头瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病毒-29(MC29)以及鸟成红细胞瘤病病毒(AEV)。逆转录病毒的详细表可在如下的书中找到，见Coffin等，1997，“逆转录病毒”，冷泉港实验室出版社，编著者JM Coffin,SM Hughes,HEVamus,758-763页。
某些逆转录病毒的基因组结构的细节可以在本领域找到。举例来说，有关HIV和Mo-MLV的详细资料可从NCBI基因库获得(基因组入库号分别为AF033819和AF033811)。
慢病毒组甚至能进一步分为“灵长类”和“非灵长类”二组。灵长类慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV，它是引起人自身免疫缺陷综合症(AIDS)的病原)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(VMV)、和相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)以及最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
逆转录病毒基因组的基本结构是一个5′LTR和一个3′LTR(能使基因组包装的包装信号位于之间或其中)，一个引物结合位点，能整合到宿主细胞基因组中的整合位点，以及编码包装组分的gag、pol和env基因一这些是病毒颗粒装配所需的多肽。更复杂的逆转录病毒有其他的特征，如在HIV中的ren和RRE序列，它们能把整合前病毒的RNA转录体有效地从细胞核运输到被感染靶细胞的细胞质中。
在前病毒中，这些基因的两端侧翼是称为长末端重复(LTRs)的区域。所述的LTRs负责前病毒的整合和转录。LTRs也用作增强子启动子的序列并能控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNAs的颗粒化通过位于病毒基因组的5′末端的psi序列开始。
LTRs本身是相同的序列，这些序列可分为三个元件，称为U3、R和U5。U3来源于RNA 3′端特有的序列。R来源于在RNA二个末端重复的序列而U5来源于RNA的5′末端特有的序列。三个元件的大小在不同的逆转录病毒中变化较大。
在一缺陷逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以缺乏或没有功能。位于RNA二个末端的所述R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5′和3′末端的特有序列。
在一典型的用于基因治疗的逆转录病毒载体中，可从病毒中移去至少一个或多个复制所需的gag、pol和env蛋白编码区的部分。这样制得复制缺陷的逆转录病毒载体。移去的部分甚至可被诸如本发明的第一核苷酸序列等目的核苷酸序列(NOI)取代，以产生能把其基因组整合到宿主基因组中的病毒，但是，其中修饰过的病毒基因组由于缺乏结构蛋白，其自身不能增殖。当在宿主基因组中整合时，出现NOI的表达-例如，结果表现出治疗和/或诊断效应。因此，把NOI转移到目的位点一般可通过下述方法获得，该方法把NOI整合到重组病毒载体中；把修饰病毒载体包装到病毒颗粒外壳上；然后使其转导到目的位点-如靶细胞或靶细胞群体中。
因此，用于本发明的最小逆转录病毒基因组可包括(5′)R-U5-1个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于在宿主细胞/包装细胞中产生逆转录病毒基因组的质粒载体，也包括转录调节控制序列，该调节控制序列操作性地与逆转录病毒基因组连接，以指导该基因组在宿主细胞/包装细胞中转录。这些调节序列可以是和转录逆转录病毒序列相连的天然序列，即5′U3区，或者它们是诸如另一种病毒启动子的异源启动子，例如CMV启动子。
某些逆转录病毒基因组为了有效地产生病毒，需要另外的序列。例如，在HIV的情况下，优选地包括rev和RRE序列。不过，对rev和RRE序列的需求能通过密码子优化而减少或取消。
一旦逆转录病毒载体基因组作为前病毒DNA被整合到其靶细胞的基因组中，必然表达核酶序列。在逆转录病毒中，启动子位于前病毒的5′LTR U3区。在逆转录病毒载体中，驱动治疗基因表达的启动子可以是在5′U3区的天然逆转录病毒启动子，或是被构建到载体中的替代启动子。该替代启动子基本上可取代逆转录病毒天然的5′U3启动子，或者，它可被整合到载体基因组之中如LTRs之间的不同位置。
因此，第一核苷酸序列也将操作性地与转录调节控制序列连接，以使第一核苷酸序列的转录在靶细胞中出现。该控制序列一般在哺乳动物细胞中具有活性。例如，所述的控制序列可以是一种病毒启动子，如天然病毒启动子或CMV启动子，或者它可以是哺乳动物启动子。特别优选地应用下列的启动子，该启动子优先地在该病毒最初感染的特殊细胞类型或组织类型中有活性。因此，在一实施方案中，可用组织特异调节的序列。驱动一个或多个第一核苷酸序列表达的调节控制序列可以是组成性的或调节的启动子。
例如，通过应用包装或辅助细胞系和重组载体结合的方法，可增殖复制缺陷的逆转录病毒载体，以制备用于下一步转导的逆转录病毒载体的合适滴度。那就是说，以反式方式提供三个包装蛋白。
“包装细胞系”含有一个或多个逆转录病毒的gag、pol和env基因。该包装细胞系产生用于包装逆转录病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi区，它不能颗粒化。然而，当携带一个NOI和psi区的重组载体被导入到包装细胞系中时，所述的辅助蛋白能包装psi阳性的重组载体，以产生重组病毒贮存物。该病毒贮存物能用于转导细胞，以把NOI导入到靶细胞的基因组中。应用称为psi阳性的psi包装信号是优选的，psi阳性含有横跨从拼接供体的上游至gag起始密码子下游的附加序列(Bender等(46))，因为已经表明该包装信号增加病毒的滴度。
基因组缺乏形成病毒蛋白所需的全部基因的重组病毒仅能一次性转导，却不能增殖。这些仅能转导靶细胞一个循环的病毒载体被称为复制缺陷载体。所以，所述的NOI导入到宿主/靶细胞基因组中却不产生潜在的有害逆转录病毒。有效的包装系总结表见Coffin等，1997(同上)的文章中。
优选地使用下述的逆转录病毒包装细胞系，在这些细胞系中，gag、pol和env病毒编码区在不同的表达质粒中携带，这些质粒独立地被转染进包装细胞系中。有时称为三质粒转染法(Soneoka等(33))的这种策略，能降低产生有复制活性的病毒的潜力，因为产生野生型病毒需要三个重组事件。由于同源性大大地有利于重组，也用降低或消除载体和辅助体的基因组之间的同源性的方法，以降低产生有复制活性的辅助病毒的问题。
一种稳定地转染包装细胞系的替代方法是应用瞬时转染的细胞系。当正在开发载体时，使用瞬时转染法测定载体的产生水平具有优势。在这一方面，瞬时转染法避免了出现稳定的产生载体细胞系所需的较长时间，并且也可用于如果载体或逆转录病毒包装组分对细胞有毒性的情况。一般用于产生逆转录病毒载体的组分包括编码gag/pol蛋白的质粒，编码env蛋白的质粒和含有NOI的质粒。载体的生产涉及一种或多种这些组分瞬时转染到含有所需其他组分的细胞中。如果所述的载体编码毒性基因或干扰宿主细胞复制的基因，如细胞周期抑制蛋白或诱导凋亡的基因，出现稳定产生载体的细胞系就可能困难，但能用瞬时转染法，在细胞死亡之前产生载体。另外，应用瞬时转染法开发出了许多细胞系，这些细胞产生的载体滴度水平可与从稳定产生载体的细胞系的水平相比拟(Pear等(47))。
生产细胞/包装细胞可以是任何合适的细胞类型。最常用的是哺乳动物生产细胞，但是其他细胞如昆虫细胞也不排除在外。显然，生产细胞必须能有效地翻译gag、pol和env的mRNA。许多合适的生产/包装细胞系在本领域众所周知。例如，本领域的技术人员通过把编码包装组分的核苷酸构建体稳定地导入细胞系中，也能制取合适的包装细胞系。
正如下面讨论的那样，如果逆转录病毒基因组编码一种能影响gag、pol和/或env RNA转录体裂解的抑制性RNA分子，所述的核苷酸序列以整合或质粒携带的方式存在于包装细胞系中，或者存在于瞬时转染的生产细胞中，编码gag、pol和/或env蛋白的这些核苷酸序列将被修饰，这样降低或防止与抑制性RNA分子的结合。用这种方法，抑制性RNA分子不能阻止在包装细胞系中病毒颗粒包装所需的组分的表达。
在实验和实际用途中，使用高滴度的病毒制品是十分合乎要求的。增加病毒滴度的技术包括使用上面讨论的psi阳性包装信号和一定浓度的病毒贮存物。此外，使用不同的包膜蛋白，如来自疱性口炎病毒的G蛋白，可提高滴度，使其浓度达到每毫升109(Cosset等(48))。不过，一般选择包膜蛋白，这样病毒颗粒优先地感染被需要治疗的病毒感染的细胞。例如，如果一种HIV载体被用于治疗HIV感染，所用的env蛋白是HIV env蛋白。
按照本发明所用的合适的第一核苷酸序列编码下述的基因产物，这些基因产物导致靶核苷酸序列的裂解和/或酶促降解，它们一般是核糖核酸。作为具体的实例，所指的是核酶和反义序列。
核酶是在特异的位点裂解RNA的RNA酶。可以这样构建核酶，使其特异地针对任何选择的含有核酶裂解位点的序列。因此，在转录病毒序列中选择识别位点而构建核酶。举例来说，由第一核苷酸序列编码的核酶，识别和裂解产生病毒颗粒所需的病毒基因组的必要元件，如包装组分。所以，对逆转录病毒基因组来说，上述必要元件包括gag、pol和env基因产物。一种能识别至少gag、pol和env基因序列之一，或更典型地识别从这些基因转录的RNA序列的合适的核酶，能结合和裂解上述序列。作为合适的方法，这将降低或阻止gag、pol或env蛋白的产生，因而降低或阻止逆转录病毒颗粒的产生。
核酶以几种形式存在，包括锤头、发夹和肝炎δ型抗基因组核酶。本发明优选地使用锤头核酶，部分原因是它们的体积相对较小，也因为它们的靶裂解位点的序列要求最小，以及它们的特性已得到全面的描述。在本发明研究中最常用的核酶是锤头核酶和发夹核酶。
每一个单独的核酶有一个基序，该基序识别在靶RNA中的识别位点并与之结合。该基序采取一个或多个“结合臂”的形式，一般是二个结合臂。在锤头核酶中的结合臂是侧翼序列螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ，它们位于螺旋Ⅱ的侧翼。这些序列的长度是可变的，一般每种为6-10个核苷酸，但可以更短或更长。侧翼序列的长度能影响裂解率。例如，已经发现降低侧翼序列中的核苷酸总数，从20降低到12，能增加核酶裂解HIV序列的转换率，达到10倍(44)。在锤头核酶中，核酶螺旋Ⅱ的催化基序，在一个称为裂解位点的位点中裂解靶RNA。核酶是否裂解任何给定的RNA，可通过存在或缺乏针对含合适的裂解位点的核酶的识别位点确定。
每一类型的核酶识别其自身的裂解位点。锤头核酶裂解位点拥有直接位于上游的核苷酸碱基三联体GUX，其中，G是鸟嘌呤，U是尿嘧啶而X是任何的核苷酸碱基。发夹核酶拥有一个BCUGNYR的裂解位点，其中，B是任何不是腺嘌呤的核苷酸碱基，N是任何核苷酸，Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶而R是鸟嘌呤或腺嘌呤。由发夹核酶引起的裂解发生在裂解位点的G和N之间。
编码包装组分的核酸序列(第三核苷酸序列)可以抵抗所述的核酶或多种核酶，因为它们缺乏针对所述的核酶或多种核酶的任何裂解位点。这将阻止由所述的核酶或多种核酶引起的酶活性，因此不存在针对所述的核酶或多种核酶的有效识别位点。另外或此外，潜在的识别位点可在侧翼序列中改变，这些序列构成核酶与之结合的识别位点的一部分。这种改变消除核酶基序与识别位点的结合，或者足以使任何核酶-靶复合物的去稳定而降低结合能力，因此降低该核酶的特异性和催化活性。如果仅改变侧翼序列，它们优选地进行如下改变，结果在该改变的靶序列上的核酶催化活性可以被忽略或有效地消除。
优选地是，本发明使用了几种抗HIV的核酶系列(5,7,10,13,21,36,38,40)。这些核酶可以是任何的抗HIV的核酶，但是必须包括一种或多种裂解表达gag、pol或env所需的RNA的种类。优选地是，利用多个核酶，同时在多个位点能裂解原始逆转录病毒的gag、pol或env的RNA。由于HIV以准物种群存在，并不是所有的核酶的靶序列包括在全部的HIV变体中。由该变异性所出现的问题能通过使用多靶核酶解决。多靶核酶包括成系列存在于单一载体中，并且当作为一条单一的RNA序列表达时，能独立起作用。一种含有二个或多个具有不同靶识别位点的核酶的单一RNA可以称为多靶核酶。已经表明：成系列地设置核酶可增强裂解作用。使用多个核酶并不局限于治疗HIV感染，而是可用于有关的其他病毒、逆转录病毒或其他病毒。
反义技术在本领域众所周知。一般认为反义序列通过各种机制抑制基因表达。据信反义序列起作用的一种机制是细胞蛋白RNAseH被招募到靶序列/反义构建体的异源双链体处，结果引起异源双链体的裂解和降解。因此反义构建体，与核酶的作用相反，据说能间接地引起靶序列的裂解/降解。因此根据本发明，第一核苷酸序列可以编码一种反义RNA，该反义RNA与一种编码基本/包装组分的基因结合或与来自该基因转录的RNA结合，结果抑制该基因的表达，例如导致得到的异源双链体的RNAseH降解。对反义构建体来说，没有必要编码与下列基因互补的全长序列，所述的基因编码一种基本/包装组分-一部分就足以起作用。技术人员可容易地确定如何设计合适的反义构建体。
相反，在宿主细胞/生产细胞/包装细胞中，编码病毒颗粒装配必需的病毒颗粒的基本/包装组分的核酸序列(第三核苷酸序列)，抵抗由第一核苷酸序列编码的抑制性RNA分子。例如，在核酶的情况下，该抗性一般利用在序列中取消核酶识别位点的变异而实现。同时，保留针对基本/包装组分的氨基酸编码序列，这样由所述的序列编码的病毒组分仍然相同，或者至少十分相似，结果基本/包装组分的功能不被损害。
术语“病毒颗粒装配必需的病毒多肽”指的是一种一般由病毒基因组编码的被包装到病毒颗粒中的多肽，在缺乏该多肽时，病毒基因组就不能包装。例如，就逆转录病毒来说，上述多肽包括gag、pol和env。术语“包装组分”和“基本组分”也包括在本定义之中。
在反义序列的情况下，第三核苷酸序列与编码靶病毒包装组分的反义序列的第二核苷酸序列不同，因为尽管反义序列能与第二核苷酸序列或其转录体结合，所述的反义序列不能有效地与第三核苷酸序列或从该序列转录的RNA结合。在第二和第三核苷酸序列之间的变化一般是保守性变化，虽然也可以忍受少数的氨基酸变化，只要基本/包装组分的功能不被明显地损害就可。
优选地，除了取消核酶识别位点外，针对病毒组分的编码序列的改变可改善在哺乳动物细胞或其他细胞中的密码子使用性，其中这些细胞作为产生逆转录病毒载体颗粒的生产细胞。在密码子使用方面的这种改善被称为“密码子优化”。包括HIV和其他慢病毒的许多病毒使用大量的稀有密码子，通过把这些密码子改变成相应的常规使用的哺乳动物密码子，能获得在哺乳动物生产细胞中包装组分的增加表达。针对哺乳动物细胞以及各种其他生物的密码子使用表，在本领域众所周知。
因而优选地，编码包装组分的序列是密码子优化的。更优选地是，该序列作为整体来说是密码子优化的。密码子优化后，可以发现，在野生型gag、pol和env序列中出现许多位点，它们能用作核酶识别位点并且不再存在于编码包装组分的序列中。在一替代但更不实用的策略中，编码包装组分的序列能通过靶向保守性改变而改变，只要使它们抵抗选出的能裂解野生型序列的核酶就行。
密码子优化的HIV包装组分的一个另外优点是能增加基因的表达。尤其是，它能使gag，pol的表达不依赖于Rev，这样在基因组中就不需要包括rev和RRE(11)。因而有可能得到不依赖Rev的载体。结果这种特点能在逆转录病毒载体中使用抗rev或RRE因子。
如上所述，用于逆转录病毒载体的包装组分包括gag、pol和env基因的表达产物。按照本发明，在包装系统中使用的gag和pol来源于该载体基因组以之为基础的靶逆转录病毒。因此，在RNA转录体形式中，gag和pol一般可被存在于载体基因组中的核酶裂解。在包装系统中使用的env基因来源于不同的病毒，包括诸如MLV的其他逆转录病毒和诸如VSV(棒状病毒)的非逆转录病毒，在该情况下，为使其抵抗核酶裂解，不需要任何序列改变。此外，env可来源于与gag和pol相同的逆转录病毒，在该情况下，任何针对核酶的识别位点需要通过序列改变而消除。
产生包被蛋白不是逆转录病毒的原始包被的逆转录病毒载体的过程，被称为“假型化”(“pseudotyping”)。某些包被蛋白，如MLV包被蛋白和疱性口炎病毒G(VSV-G)蛋白，非常有效地使逆转录病毒假型化。假型化能用于改变逆转录病毒的靶细胞范围。此外，为了维持需要治疗的被特异病毒感染的靶细胞的靶细胞特异性，该包被蛋白可与诸如HIV等靶病毒的包被蛋白相同。
其他治疗性编码序列可和第一核苷酸序列或各类序列一起存在。其他治疗性编码序列包括，但不局限于，编码下列分子的序列，这些分子是细胞因子、激素、抗体、免疫球蛋白融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、反义RNA、靶蛋白的反式显性阴性突变体、毒素、条件性毒素、抗原、单链抗体、肿瘤抑制蛋白和生长因子。当包括上述分子时，上述编码序列操作性与一合适的启动子连接，该启动子可以是驱动第一核苷酸序列表达的启动子，或不同的启动子或各类启动子。
因此本发明包含两种组分。第一种组分是一种基因组构建体，该构建体被病毒包装组分包装并携带一系列抗病毒的抑制性RNA分子，如抗HIV的核酶(5,7,10,13,21,36,38,40)。这些分子可以是任何抗HIV的核酶，但是，本发明的关键问题是某些分子裂解表达天然或野生型HIV gag、pol或env编码序列所需的RNA。第二种组分是下述的包装系统，该包装系统含有一种表达HIV gag、pol的表达盒，和一种表达HIV env的表达盒或一种编码假型化包被蛋白的包被基因一该包装系统能抵抗抑制性RNA分子。
因此，本发明的病毒颗粒和病毒载体系统以及所用的产生载体的方法，可用于治疗或预防病毒感染，优选地治疗或预防逆转录病毒感染，尤其是慢病毒(具体来说HIV)的感染。具体而言，本发明的病毒颗粒，一般用本发明的病毒载体系统产生，能用于把抑制性RNA分子传递到需要针对病毒感染治疗的人和动物中。
另外或此外，可用病毒产生系统转染离体从病人获得的细胞，然后回输到该病人体内。离体转染的病人细胞，在重新给病人施用之前，可制成一种药用组合物(见下面的描述)。
优选地是，所述的病毒颗粒可与药用上可接受的载体或稀释剂结合使用，以产生药用组合物。由此，本发明也提供一种用于治疗个体的药用组合物，其中，该组合物包含治疗有效量的本发明的病毒颗粒，与药用上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂一起施用。该药用组合物可用于人类或动物。
药用的载体、赋形剂或稀释剂可根据施用的预定途径和标准的药学实践选择。合适的载体和稀释剂包括等渗的盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。该药用组合物可包括-除了载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的结合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、溶剂和其他载体药剂，这些药剂可辅助或增加靶位点的病毒进入(例如脂类传递系统)。
该药用组合物可制成制剂，适于胃肠道外、肌肉内、静脉内、颅内、皮下、眼内或透皮施用。
当条件合适时，该药学组合物可通过下列任何一种或多种制剂方式施用：吸入剂，以栓剂或阴道栓剂的形式，用洗剂、液体剂、乳剂、药膏或粉末剂形式，通过皮肤垫在体表施用；口服施用可以是含诸如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂形式，或单独或与赋形剂形成混合剂的胶囊或卵状囊形式，或者含有香味剂或增色剂的酏剂、液体剂或悬浮剂的形式；或它们在肠胃外，例如体腔内、静脉内、肌肉内或皮下注射使用。用于肠胃外施用时，该组合物最好以含有其他物质的无菌水溶液形式使用，例如含有足够的盐类或单糖以制成与血液等渗的溶液。用于口腔或舌下施用时，该组合物可以用常规的方法制成片剂或锭剂的形式施用。
所施用的病毒数量一般是103-1010pfu的范围，优选地为105-108pfu，更优选地为106-107pfu。当使用注射方法时，一般施用1-10μl在药用上可接受的合适载体或稀释剂中的病毒。
当多核苷酸/载体作为裸核酸施用时，施用的核酸的数量一般为1μg-10mg的范围，优选地为100μg-1mg。
如果第一核苷酸序列(或其他治疗用的序列)在可诱导的调节序列控制之下时，仅有必要在治疗期间诱导基因表达。一旦所述的病情被治愈，就可移去诱导剂而停止NOI的表达。这种方法显然具有临床优势。例如，上述体系可包含施用抗生素四环素，以通过其对tet阻遏物/VP16融合蛋白的影响而活化基因表达。
现在本发明进一步用实施例的方式描述，这些实施例的本意是用于帮助本领域的技术人员实施本发明，而无论如何也不能认为是限制本发明的范围。实施例可参考附图。在附图中：
图1概括性显示插入到4个不同HIV载体中的核酶；
图2概括性显示如何用PCR制造一个合适的3′LTR。
图3显示用于HXB2株的野生型HIV gag,pol的密码子使用表(保藏号：K03455)。
图4显示命名为gag,pol-SYNgp的密码子优化序列的密码子使用表。
图5显示称为env-mn的野生型HIV env的密码子使用表。
图6显示命名为SYNgp160mn的HIV env密码子优化序列的密码子使用表。
图7显示用于本发明的3个质粒构建体。
图8显示用于产生逆转录病毒载体颗粒的2个系统的原理。
现在本发明进一步用下列实施例描述，这些实施例仅用作阐述本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例
实施例1-基因组的构建
HIV gag.pol序列是密码子优化的(图4和SEQ I.D.NO.1)，并用大约40个核苷酸的重叠寡聚物合成。该序列具有三个优点。首先，它允许基于HIV的载体携带核酶和其他的治疗因子。其次，密码子优化由于更高水平的基因表达而产生更高的载体滴度。第三，gag.pol的表达成为rev非依赖性，可允许应用抗rev或RRE因子。
在gag.pol中的保守序列参照HIV序列数据库鉴定，并用于设计核酶，所述的数据库位于Los Alamos国家实验室(http：//hiv-web.lanl.gov/)。由于HIV-1亚型之间的变异性，所设计的核酶裂解属于B亚型的北美洲、拉丁美洲和加勒比、欧洲、日本和澳大利亚的主要亚型。所选择的位点相互参考合成的gagpol序列，以保证较低可能切割密码子优化的gagpol mRNA。设计核酶分别在5′和3′末端具有XhoⅠ和SalⅠ位点。这种设计可构建分隔并串联的核酶。
该核酶是下列普通结构的锤头结构(25)：
螺旋Ⅰ 螺旋Ⅱ 螺旋Ⅲ
5′-NNNNNNNN～CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAA～NNNNNNNN～
在不降低催化转换率的前提下，该核酶的催化结构域(螺旋Ⅱ)能忍受一些变化。
具有基本GUX(其中X是任何的核苷酸碱基)三联体，靶向gag和pol的裂解位点见如下：GAG 1 5′UAGUAAGAAUGUAUAGCCCUACGAG 2 5′AACCCAGAUUGUAAGACUAUUUGAG 3 5′UGUUUCAAUUGUGGCAAAGAAGGAG 4 5′AAAAAGGGCUGUUGGAAAUGUGPOL 1 5′ACGACCCCUCGUCACAAUAAAGPOL 2 5′GGAAUUGGAGGUUUUAUCAAAGPOL 3 5′AUAUUUUUCAGUUCCCUUAGAUPOL 4 5′UGGAUGAUUUGUAUGUAGGAUCPOL 5 5′CUUUGGAUGGGUUAUGAACUCCPOL 6 5′CAGCUGGACUGUCAAUGACAUAPOL 7 5′AACUUUCUAUGUAGAUGGGGCAPOL 8 5′AAGGCCGCCUGUUGGUGGGCAGPOL 9 5′UAAGACAGCAGUACAAAUGGCA
所述的核酶被插入到4个不同的HIV载体中(pH4(10)、pH6、pH4.1或pH6.1)(图1)。在pH4和pH6中，核酶的转录通过一个内部HCMV启动子驱动(9)。根据pH4.1和pH6.1，该核酶从5′LTR表达。在pH4和pH6(pH4.1和pH6.1)之间的主要差异在于生产质粒中的3′LTR。pH4和pH4.1在3′LTR中拥有HIV U3。pH6或pH6.1在3′LTR中拥有HCMV。HCMV启动子取代了大部分的U3，以高组成水平地驱动表达，而HIV-1 U3仅在Tat的存在下支持高水平表达。
用3个PCR引物通过重组PCR产生HCMV/HIV-1杂交体3′LTR(图2)。用RIB1和RIB2引物以及pH4(12)作为模板，进行第一轮PCR，以扩增HIV-1 HXB2序列8900-9123。经第二轮PCR从pH4扩增杂交体5′LTR，制得HIV-1 U3的5′末端和HCMV启动子之间的连接序列。来自第一轮PCR反应的PCR产物和RIB3，分别用作5′引物和3′引物。 RIB1：5′-CAGCTGCTCGAGCAGCTGAAGCTTGCATGC-3′RIB2：5′-GTAAGTTATGTAACGGACGATATCTTGTCTTCTT-3′RIB3：5′-CGCATAGTCGACGGGCCCGCCACTGCTAGAGATTTTC-3′
然后用SphⅠ和SalⅠ切下该PCR产物，并插入到pH4中，因而取代了3′LTR。所得到的质粒命名为pH6。为了构建pH4.1和pH6.1，在pH4和pH6中的内部HCMV启动子(SpeⅠ-XhoⅠ)，用pBluescriptⅡKS+(Stratagene)的多克隆位点取代(SpeⅠ-XhoⅠ)。
所述的核酶被插入到基因组载体骨架的XhoⅠ位点上。以任何构象出现的任何核酶，用相似的方式使用。实施例2-包装体系的构建
包装系统能制成各种形式。在第一形式的包装系统中，HIV gag、pol的组分与HIV env编码序列共表达。在该情况下，改变了gag、pol和env的编码序列，结果它们抵抗构建到基因组中的抗HIV的核酶。在改变密码子的使用性而获得抵抗性的同时，可选择密码子与最高水平表达的哺乳动物基因的密码子使用类型相匹配。这极大地增加表达水平(28，29)，因而增加了滴度。一种密码子优化的HIV env编码序列已被Haas等(9)描述。在本实施例中，使用一种修饰的密码子优化的HIV env序列(SEQ I.D.No.3)。相应的env表达质粒被命名为pSYNgp160mn。该修饰序列含有未被Haas等使用的外加基序。该外加序列取自MN株的HIV env序列，并进行了密码子优化。只要使用的密码子与冗余tRNAs相应(42)，任何相似修饰的核酸序列会起相似的作用，并且引起对基因组中的核酶的抗性。
在一个使用优化密码子的gag、pol的编码序列的实施例中，合成了重叠的寡核苷酸，然后连接在一起而产生合成的编码序列。野生型的序列(基因库编号K03455)和合成的(gagpol-SYNgp)gagpol序列分别在SEQ I.D.Nos1和2中显示，而它们的密码子使用性分别在图3和图4显示。野生型env编码序列的序列(基因库编号M17449)在SEQ I.D.No 3中给出，合成的密码子优化序列的序列在SEQ I.D.No 4中给出，而它们的密码子使用表分别在图5和图6给出。与env编码序列一样，可使用任何获得对各种核酶有抗性的gag、pol序列。所显示的合成序列被命名为gag,pol-SYNgp，在其5′末端有一个EcoRⅠ位点和在3′末端有一个NotⅠ位点。它被插入到pClneo(Promega)中而产生质粒pSYNgp。
在第二形式的包装系统中，一种合成的gag，pol表达盒与一种非HIV的包被编码序列共表达，该非HIV的包被编码序列产生一种假型化HIV的表面蛋白。例如，该蛋白可以是VSV-G(20,41)，双向MLV env(6,34)或任何能掺入HIV颗粒中的其他蛋白(37)。这也包括能把载体靶向到特异组织的分子。非HIV包被蛋白的编码序列不被各种核酶裂解，因此不需要序列修饰(虽然由于其他的原因，例如在哺乳动物细胞中密码子使用性的优化，某些序列的修饰是合乎需要的)。
实施例3-产生载体颗粒
载体颗粒既能从与Soneoka等(33)描述相似的瞬时三质粒转染系统中产生，也可从用其他逆转录病毒载体(20,35,39)相似的生产细胞系中产生。这些原理在图7和8中阐明。例如，按照Soneoka等(33)描述的方法，用pH6Rz、pSYNgp和pRV67(VSV-G表达质粒)的三种质粒转染293T细胞(图8)，产生了命名为H6Rz-VSV的载体颗粒。这些方法把H6Rz基因组转导到诸如C1866或Jurkat的CD4+细胞中，而产生多靶核酶。至此在这些细胞中的HIV复制被严格限制。
在以上说明中提到的全部出版物，在此引入仅供参考。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，本发明描述的方法和系统的各种修饰和修改方法，对本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管结合具体优选实施方案的形式描述了本发明，但应该明白，要求保护的本发明仅限制为上述的具体实施方案是不恰当的。事实上，应该认为：对分子生物学或相关领域的技术人员来说明显的，用于执行本发明的上述模式的各种修改方法，属于下列权利要求的范围之中。
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说明书的序列表部分
SEQ.ID.NO.1-HXB2株的野生型gagpol序列(登记号K03455)ATGGGTGCGA GAGCGTCAGT ATTAAGCGGG GGAGAATTAG ATCGATGGGA AAAAATTCGG 60TTAAGGCCAG GGGGAAAGAA AAAATATAAA TTAAAACATA TAGTATGGGC AAGCAGGGAG 120CTAGAACGAT TCGCAGTTAA TCCTGGCCTG TTAGAAACAT CAGAAGGCTG TAGACAAATA 180CTGGGACAGC TACAACCATC CCTTCAGACA GGATCAGAAG AACTTAGATC ATTATATAAT 240ACAGTAGCAA CCCTCTATTG TGTGCATCAA AGGATAGAGA TAAAAGACAC CAAGGAAGCT 300TTAGACAAGA TAGAGGAAGA GCAAAACAAA AGTAAGAAAA AAGCACAGCA AGCAGCAGCT 360GACACAGGAC ACAGCAATCA GGTCAGCCAA AATTACCCTA TAGTGCAGAA CATCCAGGGG 420CAAATGGTAC ATCAGGCCAT ATCACCTAGA ACTTTAAATG CATGGGTAAA AGTAGTAGAA 480GAGAAGGCTT TCAGCCCAGA AGTGATACCC ATGTTTTCAG CATTATCAGA AGGAGCCACC 540CCACAAGATT TAAACACCAT GCTAAACACA GTGGGGGGAC ATCAAGCAGC CATGCAAATG 600TTAAAAGAGA CCATCAATGA GGAAGCTGCA GAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATGCA 660GGGCCTATTG CACCAGGCCA GATGAGAGAA CCAAGGGGAA GTGACATAGC AGGAACTACT 720AGTACCCTTC AGGAACAAAT AGGATGGATG ACAAATAATC CACCTATCCC AGTAGGAGAA 780ATTTATAAAA GATGGATAAT CCTGGGATTA AATAAAATAG TAAGAATGTA TAGCCCTACC 840AGCATTCTGG ACATAAGACA AGGACCAAAG GAACCCTTTA GAGACTATGT AGACCGGTTC 900TATAAAACTC TAAGAGCCGA GCAAGCTTCA CAGGAGGTAA AAAATTGGAT GACAGAAACC 960TTGTTGGTCC AAAATGCGAA CCCAGATTGT AAGACTATTT TAAAAGCATT GGGACCAGCG 1020GCTACACTAG AAGAAATGAT GACAGCATGT CAGGGAGTAG GAGGACCCGG CCATAAGGCA 1080AGAGTTTTGG CTGAAGCAAT GAGCCAAGTA ACAAATTCAG CTACCATAAT GATGCAGAGA 1140GGCAATTTTA GGAACCAAAG AAAGATTGTT AAGTGTTTCA ATTGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200ACAGCCAGAA ATTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGTT GGAAATGTGG AAAGGAAGGA 1260CACCAAATGA AAGATTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440AAGGAACTGT ATCCTTTAAC TTCCCTCAGG TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500TAAAGATAGG GGGGCAACTA AAGGAAGCTC TATTAGATAC AGGAGCAGAT GATACAGTAT 1560TAGAAGAAAT GAGTTTGCCA GGAAGATGGA AACCAAAAAT GATAGGGGGA ATTGGAGGTT 1620TTATCAAAGT AAGACAGTAT GATCAGATAC TCATAGAAAT CTGTGGACAT AAAGCTATAG 1680GTACAGTATT AGTAGGACCT ACACCTGTCA ACATAATTGG AAGAAATCTG TTGACTCAGA 1740TTGGTTGCAC TTTAAATTTT CCCATTAGCC CTATTGAGAC TGTACCAGTA AAATTAAAGC 1800CAGGAATGGA TGGCCCAAAA GTTAAACAAT GGCCATTGAC AGAAGAAAAA ATAAAAGCAT 1860TAGTAGAAAT TTGTACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT TTCAAAAATT GGGCCTGAAA 1920ATCCATACAA TACTCCAGTA TTTGCCATAA AGAAAAAAGA CAGTACTAAA TGGAGAAAAT 1980TAGTAGATTT CAGAGAACTT AATAAGAGAA CTCAAGACTT CTGGGAAGTT CAATTAGGAA 2040TACCACATCC CGCAGGGTTA AAAAAGAAAA AATCAGTAAC AGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100CATATTTTTC AGTTCCCTTA GATGAAGACT TCAGGAAGTA TACTGCATTT ACCATACCTA 2160GTATAAACAA TGAGACACCA GGGATTAGAT ATCAGTACAA TGTGCTTCCA CAGGGATGGA 2220AAGGATCACC AGCAATATTC CAAAGTAGCA TGACAAAAAT CTTAGAGCCT TTTAGAAAAC 2280AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACA TGGATGATTT GTATGTAGGA TCTGACTTAG 2340AAATAGGGCA GCATAGAACA AAAATAGAGG AGCTGAGACA ACATCTGTTG AGGTGGGGAC 2400TTACCACACC AGACAAAAAA CATCAGAAAG AACCTCCATT CCTTTGGATG GGTTATGAAC 2460TCCATCCTGA TAAATGGACA GTACAGCCTA TAGTGCTGCC AGAAAAAGAC AGCTGGACTG 2520TCAATGACAT ACAGAAGTTA GTGGGGAAAT TGAATTGGGC AAGTCAGATT TACCCAGGGA 2580TTAAAGTAAG GCAATTATGT AAACTCCTTA GAGGAACCAA AGCACTAACA GAAGTAATAC 2640CACTAACAGA AGAAGCAGAG CTAGAACTGG CAGAAAACAG AGAGATTCTA AAAGAACCAG 2700TACATGGAGT GTATTATGAC CCATCAAAAG ACTTAATAGC AGAAATACAG AAGCAGGGGC 2760AAGGCCAATG GACATATCAA ATTTATCAAG AGCCATTTAA AAATCTGAAA ACAGGAAAAT 2820ATGCAAGAAT GAGGGGTGCC CACACTAATG ATGTAAAACA ATTAACAGAG GCAGTGCAAA 2880AAATAACCAC AGAAAGCATA GTAATATGGG GAAAGACTCC TAAATTTAAA CTGCCCATAC 2940AAAAGGAAAC ATGGGAAACA TGGTGGACAG AGTATTGGCA AGCCACCTGG ATTCCTGAGT 3000GGGAGTTTGT TAATACCCCT CCCTTAGTGA AATTATGGTA CCAGTTAGAG AAAGAACCCA 3060TAGTAGGAGC AGAAACCTTC TATGTAGATG GGGCAGCTAA CAGGGAGACT AAATTAGGAA 3120AAGCAGGATA TGTTACTAAT AGAGGAAGAC AAAAAGTTGT CACCCTAACT GACACAACAA 3180ATCAGAAGAC TGAGTTACAA GCAATTTATC TAGCTTTGCA GGATTCGGGA TTAGAAGTAA 3240ACATAGTAAC AGACTCACAA TATGCATTAG GAATCATTCA AGCACAACCA GATCAAAGTG 3300AATCAGAGTT AGTCAATCAA ATAATAGAGC AGTTAATAAA AAAGGAAAAG GTCTATCTGG 3360CATGGGTACC AGCACACAAA GGAATTGGAG GAAATGAACA AGTAGATAAA TTAGTCAGTG 3420CTGGAATCAG GAAAGTACTA TTTTTAGATG GAATAGATAA GGCCCAAGAT GAACATGAGA 3480AATATCACAG TAATTGGAGA GCAATGGCTA GTGATTTTAA CCTGCCACCT GTAGTAGCAA 3540AAGAAATAGT AGCCAGCTGT GATAAATGTC AGCTAAAAGG AGAAGCCATG CATGGACAAG 3600TAGACTGTAG TCCAGGAATA TGGCAACTAG ATTGTACACA TTTAGAAGGA AAAGTTATCC 3660TGGTAGCAGT TCATGTAGCC AGTGGATATA TAGAAGCAGA AGTTATTCCA GCAGAAACAG 3720GGCAGGAAAC AGCATATTTT CTTTTAAAAT TAGCAGGAAG ATGGCCAGTA AAAACAATAC 3780ATACTGACAA TGGCAGCAAT TTCACCGGTG CTACGGTTAG GGCCGCCTGT TGGTGGGCGG 3840GAATCAAGCA GGAATTTGGA ATTCCCTACA ATCCCCAAAG TCAAGGAGTA GTAGAATCTA 3900TGAATAAAGA ATTAAAGAAA ATTATAGGAC AGGTAAGAGA TCAGGCTGAA CATCTTAAGA 3960CAGCAGTACA AATGGCAGTA TTCATCCACA ATTTTAAAAG AAAAGGGGGG ATTGGGGGGT 4020ACAGTGCAGG GGAAAGAATA GTAGACATAA TAGCAACAGA CATACAAACT AAAGAATTAC 4080AAAAACAAAT TACAAAAATT CAAAATTTTC GGGTTTATTA CAGGGACAGC AGAAATTCAC 4140TTTGGAAAGG ACCAGCAAAG CTCCTCTGGA AAGGTGAAGG GGCAGTAGTA ATACAAGATA 4200ATAGTGACAT AAAAGTAGTG CCAAGAAGAA AAGCAAAGAT CATTAGGGAT TATGGAAAAC 4260AGATGGCAGG TGATGATTGT GTGGCAAGTA GACAGGATGA GGATTAG 4307SEQ.ID.NO.2-gagpol-SYNgp-密码子优化的gagpol序列ATGGGCGCCC GCGCCAGCGT GCTGTCGGGC GGCGAGCTGG ACCGCTGGGA GAAGATCCGC 60CTGCGCCCCG GCGGCAAAAA GAAGTACAAG CTGAAGCACA TCGTGTGGGC CAGCCGCGAA 120CTGGAGCGCT TCGCCGTGAA CCCCGGGCTC CTGGAGACCA GCGAGGGGTG CCGCCAGATC 180CTCGGCCAAC TGCAGCCCAG CCTGCAAACC GGCAGCGAGG AGCTGCGCAG CCTGTACAAC 240ACCGTGGCCA CGCTGTACTG CGTCCACCAG CGCATCGAAA TCAAGGATAC GAAAGAGGCC 300CTGGATAAAA TCGAAGAGGA ACAGAATAAG AGCAAAAAGA AGGCCCAACA GGCCGCCGCG 360GACACCGGAC ACAGCAACCA GGTCAGCCAG AACTACCCCA TCGTGCAGAA CATCCAGGGG 420CAGATGGTGC ACCAGGCCAT CTCCCCCCGC ACGCTGAACG CCTGGGTGAA GGTGGTGGAA 480GAGAAGGCTT TTAGCCCGGA GGTGATACCC ATGTTCTCAG CCCTGTCAGA GGGAGCCACC 540CCCCAAGATC TGAACACCAT GCTCAACACA GTGGGGGGAC ACCAGGCCGC CATGCAGATG 600CTGAAGGAGA CCATCAATGA GGAGGCTGCC GAATGGGATC GTGTGCATCC GGTGCACGCA 660GGGCCCATCG CACCGGGCCA GATGCGTGAG CCACGGGGCT CAGACATCGC CGGAACGACT 720AGTACCCTTC AGGAACAGAT CGGCTGGATG ACCAACAACC CACCCATCCC GGTGGGAGAA 780ATCTACAAAC GCTGGATCAT CCTGGGCCTG AACAAGATCG TGCGCATGTA TAGCCCTACC 840AGCATCCTGG ACATCCGCCA AGGCCCGAAG GAACCCTTTC GCGACTACGT GGACCGGTTC 900TACAAAACGC TCCGCGCCGA GCAGGCTAGC CAGGAGGTGA AGAACTGGAT GACCGAAACC 960CTGCTGGTCC AGAACGCGAA CCCGGACTGC AAGACGATCC TGAAGGCCCT GGGCCCAGCG 1020GCTACCCTAG AGGAAATGAT GACCGCCTGT CAGGGAGTGG GCGGACCCGG CCACAAGGCA 1080CGCGTCCTGG CTGAGGCCAT GAGCCAGGTG ACCAACTCCG CTACCATCAT GATGCAGCGC 1140GGCAACTTTC GGAACCAACG CAAGATCGTC AAGTGCTTCA ACTGTGGCAA AGAAGGGCAC 1200ACAGCCCGCA ACTGCAGGGC CCCTAGGAAA AAGGGCTGCT GGAAATGCGG CAAGGAAGGC 1260CACCAGATGA AAGACTGTAC TGAGAGACAG GCTAATTTTT TAGGGAAGAT CTGGCCTTCC 1320TACAAGGGAA GGCCAGGGAA TTTTCTTCAG AGCAGACCAG AGCCAACAGC CCCACCAGAA 1380GAGAGCTTCA GGTCTGGGGT AGAGACAACA ACTCCCCCTC AGAAGCAGGA GCCGATAGAC 1440AAGGAACTGT ATCCTTTAAC TTCCCTCAGA TCACTCTTTG GCAACGACCC CTCGTCACAA 1500TAAAGATAGG GGGGCAGCTC AAGGAGGCTC TCCTGGACAC CGGAGCAGAC GACACCGTGC 1560TGGAGGAGAT GTCGTTGCCA GGCCGCTGGA AGCCGAAGAT GATCGGGGGA ATCGGCGGTT 1620TCATCAAGGT GCGCCAGTAT GACCAGATCC TCATCGAAAT CTGCGGCCAC AAGGCTATCG 1680GTACCGTGCT GGTGGGCCCC ACACCCGTCA ACATCATCGG ACGCAACCTG TTGACGCAGA 1740TCGGTTGCAC GCTGAACTTC CCCATTAGCC CTATCGAGAC GGTACCGGTG AAGCTGAAGC 1800CCGGGATGGA CGGCCCGAAG GTCAAGCAAT GGCCATTGAC AGAGGAGAAG ATCAAGGCAC 1860TGGTGGAGAT TTGCACAGAG ATGGAAAAGG AAGGGAAAAT CTCCAAGATT GGGCCTGAGA 1920ACCCGTACAA CACGCCGGTG TTCGCAATCA AGAAGAAGGA CTCGACGAAA TGGCGCAAGC 1980TGGTGGACTT CCGCGAGCTG AACAAGCGCA CGCAAGACTT CTGGGAGGTT CAGCTGGGCA 2040TCCCGCACCC CGCAGGGCTG AAGAAGAAGA AATCCGTGAC CGTACTGGAT GTGGGTGATG 2100CCTACTTCTC CGTTCCCCTG GACGAAGACT TCAGGAAGTA CACTGCCTTC ACAATCCCTT 2160CGATCAACAA CGAGACACCG GGGATTCGAT ATCAGTACAA CGTGCTGCCC CAGGGCTGGA 2220AAGGCTCTCC CGCAATCTTC CAGAGTAGCA TGACCAAAAT CCTGGAGCCT TTCCGCAAAC 2280AGAACCCCGA CATCGTCATC TATCAGTACA TGGATGACTT GTACGTGGGC TCTGATCTAG 2340AGATAGGGCA GCACCGCACC AAGATCGAGG AGCTGCGCCA GCACCTGTTG AGGTGGGGAC 2400TGACCACACC CGACAAGAAG CACCAGAAGG AGCCTCCCTT CCTCTGGATG GGTTACGAGC 2460TGCACCCTGA CAAATGGACC GTGCAGCCTA TCGTGCTGCC AGAGAAAGAC AGCTGGACTG 2520TCAACGACAT ACAGAAGCTG GTGGGGAAGT TGAACTGGGC CAGTCAGATT TACCCAGGGA 2580TTAAGGTGAG GCAGCTGTGC AAACTCCTCC GCGGAACCAA GGCACTCACA GAGGTGATCC 2640CCCTAACCGA GGAGGCCGAG CTCGAACTGG CAGAAAACCG AGAGATCCTA AAGGAGCCCG 2700TGCACGGCGT GTACTATGAC CCCTCCAAGG ACCTGATCGC CGAGATCCAG AAGCAGGGGC 2760AAGGCCAGTG GACCTATCAG ATTTACCAGG AGCCCTTCAA GAACCTGAAG ACCGGCAAGT 2820ACGCCCGGAT GAGGGGTGCC CACACTAACG ACGTCAAGCA GCTGACCGAG GCCGTGCAGA 2880AGATCACCAC CGAAAGCATC GTGATCTGGG GAAAGACTCC TAAGTTCAAG CTGCCCATCC 2940AGAAGGAAAC CTGGGAAACC TGGTGGACAG AGTATTGGCA GGCCACCTGG ATTCCTGAGT 3000GGGAGTTCGT CAACACCCCT CCCCTGGTGA AGCTGTGGTA CCAGCTGGAG AAGGAGCCCA 3060TAGTGGGCGC CGAAACCTTC TACGTGGATG GGGCCGCTAA CAGGGAGACT AAGCTGGGCA 3120AAGCCGGATA CGTCACTAAC CGGGGCAGAC AGAAGGTTGT CACCCTCACT GACACCACCA 3180ACCAGAAGAC TGAGCTGCAG GCCATTTACC TCGCTTTGCA GGACTCGGGC CTGGAGGTGA 3240ACATCGTGAC AGACTCTCAG TATGCCCTGG GCATCATTCA AGCCCAGCCA GACCAGAGTG 3300AGTCCGAGCT GGTCAATCAG ATCATCGAGC AGCTGATCAA GAAGGAAAAG GTCTATCTGG 3360CCTGGGTACC CGCCCACAAA GGCATTGGCG GCAATGAGCA GGTCGACAAG CTGGTCTCGG 3420CTGGCATCAG GAAGGTGCTA TTCCTGGATG GCATCGACAA GGCCCAGGAC GAGCACGAGA 3480AATACCACAG CAACTGGCGG GCCATGGCTA GCGACTTCAA CCTGCCCCCT GTGGTGGCCA 3540AAGAGATCGT GGCCAGCTGT GACAAGTGTC AGCTCAAGGG CGAAGCCATG CATGGCCAGG 3600TGGACTGTAG CCCCGGCATC TGGCAACTCG ATTGCACCCA TCTGGAGGGC AAGGTTATCC 3660TGGTAGCCGT CCATGTGGCC AGTGGCTACA TCGAGGCCGA GGTCATTCCC GCCGAAACAG 3720GGCAGGAGAC AGCCTACTTC CTCCTGAAGC TGGCAGGCCG GTGGCCAGTG AAGACCATCC 3780ATACTGACAA TGGCAGCAAT TTCACCAGTG CTACGGTTAA GGCCGCCTGC TGGTGGGCGG 3840GAATCAAGCA GGAGTTCGGG ATCCCCTACA ATCCCCAGAG TCAGGGCGTC GTCGAGTCTA 3900TGAATAAGGA GTTAAAGAAG ATTATCGGCC AGGTCAGAGA TCAGGCTGAG CATCTCAAGA 3960CCGCGGTCCA AATGGCGGTA TTCATCCACA ATTTCAAGCG GAAGGGGGGG ATTGGGGGGT 4020ACAGTGCGGG GGAGCGGATC GTGGACATCA TCGCGACCGA CATCCAGACT AAGGAGCTGC 4080AAAAGCAGAT TACCAAGATT CAGAATTTCC GGGTCTACTA CAGGGACAGC AGAAATCCCC 4140TCTGGAAAGG CCCAGCGAAG CTCCTCTGGA AGGGTGAGGG GGCAGTAGTG ATCCAGGATA 4200ATAGCGACAT CAAGGTGGTG CCCAGAAGAA AGGCGAAGAT CATTAGGGAT TATGGCAAAC 4260AGATGGCGGG TGATGATTGC GTGGCGAGCA GACAGGATGA GGATTAG 4307SEQ.ID.NO.3-来自HIV-1 MN的包被基因(基因库登记号M17449)ATGAGAGTGA AGGGGATCAG GAGGAATTAT CAGCACTGGT GGGGATGGGG CACGATGCTC 60CTTGGGTTAT TAATGATCTG TAGTGCTACA GAAAAATTGT GGGTCACAGT CTATTATGGG 120GTACCTGTGT GGAAAGAAGC AACCACCACT CTATTTTGTG CATCAGATGC TAAAGCATAT 180GATACAGAGG TACATAATGT TTGGGCCACA CAAGCCTGTG TACCCACAGA CCCCAACCCA 240CAAGAAGTAG AATTGGTAAA TGTGACAGAA AATTTTAACA TGTGGAAAAA TAACATGGTA 300GAACAGATGC ATGAGGATAT AATCAGTTTA TGGGATCAAA GCCTAAAGCC ATGTGTAAAA 360TTAACCCCAC TCTGTGTTAC TTTAAATTGC ACTGATTTGA GGAATACTAC TAATACCAAT 420AATAGTACTG CTAATAACAA TAGTAATAGC GAGGGAACAA TAAAGGGAGG AGAAATGAAA 480AACTGCTCTT TCAATATCAC CACAAGCATA AGAGATAAGA TGCAGAAAGA ATATGCACTT 540CTTTATAAAC TTGATATAGT ATCAATAGAT AATGATAGTA CCAGCTATAG GTTGATAAGT 600TGTAATACCT CAGTCATTAC ACAAGCTTGT CCAAAGATAT CCTTTGAGCC AATTCCCATA 660CACTATTGTG CCCCGGCTGG TTTTGCGATT CTAAAATGTA ACGATAAAAA GTTCAGTGGA 720AAAGGATCAT GTAAAAATGT CAGCACAGTA CAATGTACAC ATGGAATTAG GCCAGTAGTA 780TCAACTCAAC TGCTGTTAAA TGGCAGTCTA GCAGAAGAAG AGGTAGTAAT TAGATCTGAG 840AATTTCACTG ATAATGCTAA AACCATCATA GTACATCTGA ATGAATCTGT ACAAATTAAT 900TGTACAAGAC CCAACTACAA TAAAAGAAAA AGGATACATA TAGGACCAGG GAGAGCATTT 960TATACAACAA AAAATATAAT AGGAACTATA AGACAAGCAC ATTGTAACAT TAGTAGAGCA 1020AAATGGAATG ACACTTTAAG ACAGATAGTT AGCAAATTAA AAGAACAATT TAAGAATAAA 1080ACAATAGTCT TTAATCAATC CTCAGGAGGG GACCCAGAAA TTGTAATGCA CAGTTTTAAT 1140TGTGGAGGGG AATTTTTCTA CTGTAATACA TCACCACTGT TTAATAGTAC TTGGAATGGT 1200AATAATACTT GGAATAATAC TACAGGGTCA AATAACAATA TCACACTTCA ATGCAAAATA 1260AAACAAATTA TAAACATGTG GCAGGAAGTA GGAAAAGCAA TGTATGCCCC TCCCATTGAA 1320GGACAAATTA GATGTTCATC AAATATTACA GGGCTACTAT TAACAAGAGA TGGTGGTAAG 1380GACACGGACA CGAACGACAC CGAGATCTTC AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT 1440TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA GTAACAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCC 1500ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA GAAAAAAGAG CAGCGATAGG AGCTCTGTTC 1560CTTGGGTTCT TAGGAGCAGC AGGAAGCACT ATGGGCGCAG CGTCAGTGAC GCTGACGGTA 1620CAGGCCAGAC TATTATTGTC TGGTATAGTG CAACAGCAGA ACAATTTGCT GAGGGCCATT 1680GAGGCGCAAC AGCATATGTT GCAACTCACA GTCTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCAAGA 1740GTCCTGGCTG TGGAAAGATA CCTAAAGGAT CAACAGCTCC TGGGGTTTTG GGGTTGCTCT 1800GGAAAACTCA TTTGCACCAC TACTGTGCCT TGGAATGCTA GTTGGAGTAA TAAATCTCTG 1860GATGATATTT GGAATAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAAA GAGAAATTGA CAATTACACA 1920AGCTTAATAT ACTCATTACT AGAAAAATCG CAAACCCAAC AAGAAAAGAA TGAACAAGAA 1980TTATTGGAAT TGGATAAATG GGCAAGTTTG TGGAATTGGT TTGACATAAC AAATTGGCTG 2040TGGTATATAA AAATATTCAT AATGATAGTA GGAGGCTTGG TAGGTTTAAG AATAGTTTTT 2100GCTGTACTTT CTATAGTGAA TAGAGTTAGG CAGGGATACT CACCAITGTC GTTGCAGACC 2160CGCCCCGCAG TTCCGAGGGG ACCCGACAGG CCCGAAGGAA TCGAAGAAGA AGGTGGAGAG 2220AGAGACAGAG ACACATCCGG TCGATTAGTG CATGGATTCT TAGCAATTAT CTGGGTCGAC 2280CTGCGGAGCC TGTTCCTCTT CAGCTACCAC CACAGAGACT TACTCTTGAT TGCAGCGAGG 2340ATTGTGGAAC TTCTGGGACG CAGGGGGTGG GAAGTCCTCA AATATTGGTG GAATCTCCTA 2400CAGTATTGGA GTCAGGAACT AAAGAGTAGT GCTGTTAGCT TGCTTAATGC CACAGCTATA 2460GCAGTAGCTG AGGGGACAGA TAGGGTTATA GAAGTACTGC AAAGAGCTGG TAGAGCTATT 2520CTCCACATAC CTACAAGAAT AAGACAGGGC TTGGAAAGGG CTTTGCTATA A 2571SE Q.ID.NO.4-SYNgp-160mn-密码子优化的env序列ATGAGGGTGA AGGGGATCCG CCGCAACTAC CAGCACTGGT GGGGCTGGGG CACGATGCTC 60CTGGGGCTGC TGATGATCTG CAGCGCCACC GAGAAGCTGT GGGTGACCGT GTACTACGGC 120GTGCCCGTGT GGAAGGAGGC CACCACCACC CTGTTCTGCG CCAGCGACGC CAAGGCGTAC 180GACACCGAGG TGCACAACGT GTGGGCCACC CAGGCGTGCG TGCCCACCGA CCCCAACCCC 240CAGGAGGTGG AGCTCGTGAA CGTGACCGAG AACTTCAACA TGTGGAAGAA CAACATGGTG 300GAGCAGATGC ATGAGGACAT CATCAGCCTG TGGGACCAGA GCCTGAAGCC CTGCGTGAAG 360CTGACCCCCC TGTGCGTGAC CCTGAACTGC ACCGACCTGA GGAACACCAC CAACACCAAC 420AACAGCACCG CCAACAACAA CAGCAACAGC GAGGGCACCA TCAAGGGCGG CGAGATGAAG 480AACTGCAGCT TCAACATCAC CACCAGCATC CGCGACAAGA TGCAGAAGGA GTACGCCCTG 540CTGTACAAGC TGGATATCGT GAGCATCGAC AACGACAGCA CCAGCTACCG CCTGATCTCC 600TGCAACACCA GCGTGATCAC CCAGGCCTGC CCCAAGATCA GCTTCGAGCC CATCCCCATC 660CACTACTGCG CCCCCGCCGG CTTCGCCATC CTGAAGTGCA ACGACAAGAA GTTCAGCGGC 720AAGGGCAGCT GCAAGAACGT GAGCACCGTG CAGTGCACCC ACGGCATCCG GCCGGTGGTG 780AGCACCCAGC TCCTGCTGAA CGGCAGCCTG GCCGAGGAGG AGGTGGTGAT CCGCAGCGAG 840AACTTCACCG ACAACGCCAA GACCATCATC GTGCACCTGA ATGAGAGCGT GCAGATCAAC 900TGCACGCGTC CCAACTACAA CAAGCGCAAG CGCATCCACA TCGGCCCCGG GCGCGCCTTC 960TACACCACCA AGAACATCAT CGGCACCATC CGCCAGGCCC ACTGCAACAT CTCTAGAGCC 1020AAGTGGAACG ACACCCTGCG CCAGATCGTG AGCAAGCTGA AGGAGCAGTT CAAGAACAAG 1080ACCATCGTGT TCAACCAGAG CAGCGGCGGC GACCCCGAGA TCGTGATGCA CAGCTTCAAC 1140TGCGGCGGCG AATTCTTCTA CTGCAACACC AGCCCCCTGT TCAACAGCAC CTGGAACGGC 1200AACAACACCT GGAACAACAC CACCGGCAGC AACAACAATA TTACCCTCCA GTGCAAGATC 1260AAGCAGATCA TCAACATGTG GCAGGAGGTG GGCAAGGCCA TGTACGCCCC CCCCATCGAG 1320GGCCAGATCC GGTGCAGCAG CAACATCACC GGTCTGCTGC TGACCCGCGA CGGCGGCAAG 1380GACACCGACA CCAACGACAC CGAAATCTTC CGCCCCGGCG GCGGCGACAT GCGCGACAAC 1440TGGAGATCTG AGCTGTACAA GTACAAGGTG GTGACGATCG AGCCCCTGGG CGTGGCCCCC 1500ACCAAGGCCA AGCGCCGCGT GGTGCAGCGC GAGAAGCGGG CCGCCATCGG CGCCCTGTTC 1560CTGGGCTTCC TGGGGGCGGC GGGCAGCACC ATGGGGGCCG CCAGCGTGAC CCTGACCGTG 1620CAGGCCCGCC TGCTCCTGAG CGGCATCGTG CAGCAGCAGA ACAACCTCCT CCGCGCCATC 1680GAGGCCCAGC AGCATATGCT CCAGCTCACC GTGTGGGGCA TCAAGCAGCT CCAGGCCCGC 1740GTGCTGGCCG TGGAGCGCTA CCTGAAGGAC CAGCAGCTCC TGGGCTTCTG GGGCTGCTCC 1800GGCAAGCTGA TCTGCACCAC CACGGTACCC TGGAACGCCT CCTGGAGCAA CAAGAGCCTG 1860GACGACATCT GGAACAACAT GACCTGGATG CAGTGGGAGC GCGAGATCGA TAACTACACC 1920AGCCTGATCT ACAGCCTGCT GGAGAAGAGC CAGACCCAGC AGGAGAAGAA CGAGCAGGAG 1980CTGCTGGAGC TGGACAAGTG GGCGAGCCTG TGGAACTGGT TCGACATCAC CAACTGGCTG 2040TGGTACATCA AAATCTTCAT CATGATTGTG GGCGGCCTGG TGGGCCTCCG CATCGTGTTC 2100GCCGTGCTGA GCATCGTGAA CCGCGTGCGC CAGGGCTACA GCCCCCTGAG CCTCCAGACC 2160CGGCCCCCCG TGCCGCGCGG GCCCGACCGC CCCGAGGGCA TCGAGGAGGA GGGCGGCGAG 2220CGCGACCGCG ACACCAGCGG CAGGCTCGTG CACGGCTTCC TGGCGATCAT CTGGGTCGAC 2280CTCCGCAGCC TGTTCCTGTT CAGCTACCAC CACCGCGACC TGCTGCTGAT CGCCGCCCGC 2340ATCGTGGAAC TCCTAGGCCG CCGCGGCTGG GAGGTGCTGA AGTACTGGTG GAACCTCCTC 2400CAGTATTGGA GCCAGGAGCT GAAGTCCAGC GCCGTGAGCC TGCTGAACGC CACCGCCATC 2460GCCGTGGCCG AGGGCACCGA CCGCGTGATC GAGGTGCTCC AGAGGGCCGG GAGGGCGATC 2520CTGCACATCC CCACCCGCAT CCGCCAGGGG CTCGAGAGGG CGCTGCTGTA A 2571
Claims (22)
1．一种病毒载体系统，包括：
(ⅰ)一种编码下列基因产物的第一核苷酸序列，所述的基因产物能结合第二核苷酸序列或其转录产物，并直接或间接地影响第二核苷酸序列或其转录产物的裂解，所述第二核苷酸序列编码一种对病毒颗粒的装配必须的病毒多肽；
(ⅱ)一种编码病毒颗粒装配所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列拥有与第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，使得所述的第三核苷酸序列或其转录产物抵抗由所述的基因产物指导的裂解。
2．一种病毒载体生产系统，包括：
(ⅰ)一种包含至少一条第一核苷酸序列的病毒基因组，所述的第一核苷酸序列编码一种基因产物，该基因产物能结合第二核苷酸序列或其转录产物，并直接或间接地影响第二核苷酸序列或其转录产物的裂解，所述的第二核苷酸序列编码一种对病毒颗粒的装配必须的病毒多肽；
(ⅱ)一种编码病毒基因组装配成病毒颗粒所需的所述病毒多肽的第三核苷酸序列，所述的第三核苷酸序列拥有与第二核苷酸序列不同的核苷酸序列，使得所述的第三核苷酸序列或其转录产物抵抗由所述的基因产物指导的裂解。
3．一种根据权利要求1或2的系统，其中该基因产物选自核酶或反义核糖核酸。
4．一种根据权利要求1-3之任一项的系统，其中该病毒载体是一种逆转录病毒载体。
5．一种根据权利要求4的系统，其中该逆转录病毒载体是一种慢病毒载体。
6．一种根据权利要求5的系统，其中该慢病毒载体是一种HIV载体。
7．一种根据权利要求4-6之任一项的系统，其中病毒颗粒装配所需的该多肽选自gag、pol和env蛋白。
8．一种根据权利要求7的系统，其中至少gag和pol蛋白来自一种慢病毒。
9．一种根据权利要求7的系统，其中env蛋白来自一种慢病毒。
10．一种根据权利要求8或9的系统，其中该慢病毒是HIV。
11．一种根据前述权利要求之任一项的系统，其中该第三核苷酸序列，由于在核苷酸序列中，由至少一个基因产物识别的裂解位点和/或针对至少一个基因产物的结合位点被移去而产生的一种或多种保守性改变导致对所述的基团产物所指导的裂解具有抗性。
12．一种根据权利要求1-10之任一项的系统，其中该第三核苷酸序列适应于抵抗由所述的至少一种基因产物所指导的裂解。
13．一种根据前述权利要求之任一项的系统，其中该第三核苷酸序列已被密码子优化，适于在生产细胞中表达。
14．一种根据权利要求13的系统，其中该生产细胞是哺乳动物细胞。
15．一种根据前述权利要求之任一项的系统，其中该系统包括多个由本文所定义的第一核苷酸序列和第三核苷酸序列。
16．一种病毒颗粒，该病毒颗粒含有一种根据权利要求2-15之任一项所定义的病毒载体基因组和一种或多种根据权利要求2-15之任一项所定义的第三核苷酸序列。
17．一种病毒颗粒，该病毒颗粒用一种根据权利要求2-15之任一项的病毒载体生产系统产生。
18．一种产生病毒颗粒的方法，该方法包括导入到宿主细胞中的下列物质：(ⅰ)一种根据权利要求2-15之任一项所定义的病毒基因组；(ⅱ)一种或多种根据权利要求2-1 5之任一项所定义的第三核苷酸序列；(ⅲ)不是由一种或多种第三核苷酸序列编码但编码其他必须的病毒包装组分的核苷酸序列。
19．一种用权利要求18的方法产生的病毒颗粒。
20．一种药物组合物，该组合物包括一种根据权利要求16，17或19的病毒颗粒，与药学上可接受的载体或稀释剂。
21．一种根据权利要求1-16之任一项的病毒系统，或一种根据权利要求16，17或19的病毒颗粒用于治疗病毒感染。
22．一种根据权利要求1-16之任一项的病毒系统，用于产生病毒颗粒的方法中。
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