CN1296703C - 鉴定蛋白质的方法、装置和系统 - Google Patents

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Abstract

一种鉴定多肽的方法，包括提供内有分离缓冲液的第一毛细管通道(104)，其中分离缓冲液包含非交联的聚合物溶液、缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。使得检测时分离缓冲液中的洗涤剂浓度不高于临界胶束浓度。将多肽引入毛细管通道的一端。以不同的速度施加横跨聚合物溶液的电场。然后在多肽通过沿毛细管通道长度的检测点(176)时检测该多肽。

Description

鉴定蛋白质的方法、装置和系统
                        相关申请交叉文献
本申请是1999年2月2日提交的美国专利申请09/243,149的部分续展申请，该文的全部公开内容纳入本文作为参考。
                           发明背景
鉴定生物学化合物是努力了解生命、了解维持生命的过程以及影响这些过程的活动和元素所必需的。通常，了解生命过程和控制生命过程的努力首先侧重于了解生命的基础构件模块，即将活生物与纯粹的无生命原始软泥区别开来的大分子化合物和复合物。在了解和控制生命过程中特别值得感兴趣的是核酸及其编码的蛋白质。
对于蛋白质，数十年来，许多鉴定方法基本上保持不变。例如，目前的蛋白质鉴定方法通常至少部分依靠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(即SDS-PAGE)通过其相对分子量来鉴定蛋白质。这些方法采用了交联聚丙烯酰胺板或片。将待分离鉴定的蛋白质与含洗涤剂的缓冲液(SDS)混合，并置于凝胶板的一边(通常在孔中)。施加跨越该板的电场，将含有蛋白质的带大量电荷的洗涤剂胶束吸引通过凝胶。较大的蛋白质移动通过平板凝胶的速度比较小蛋白质慢，从而从较大的胶束中分离出来。分离后，使凝胶与染色剂接触，该染料通常是“考马斯蓝”或银络合剂，它们与凝胶中的不同蛋白质结合。在考马斯蓝染色的凝胶中，必须对平板凝胶进行脱色，以除去过量的染色剂。这些方法在平板凝胶上产生了根据大小分开的不同蛋白质的梯条带。同样，银染法也很耗时间，通常产生定性而非定量的染色凝胶。对这些方法进行改进产生了操作更迅速的较小的凝胶、购买后就可使用的凝胶以及其它染色方法。然而，基础的SDS-PAGE方法作为蛋白质鉴定方法仍然基本上没有变化。
人们已经作了许多努力，试图将其它领域得到的进展应用于蛋白质鉴定。例如在核酸分析中获得成功的毛细管电泳方法已被尝试用于鉴定蛋白质。尽管已证实这些方法能用于分离蛋白质，但是可获得的标记化学物质的差别以及蛋白质与核酸之间的基础结构和化学上的差别都给毛细管电泳方法在蛋白质鉴定中的广泛使用带来了很大障碍。具体地说，要检测移动通过毛细管的分离的蛋白质通常需要标记基团通过相当复杂的化学原理与所有蛋白质都共价连接。另外，在蛋白质分离中确保根据大小进行分离而存在的SDS给在毛细管系统进行标记和分离带来了困难。
因此，希望提供处理量和灵敏度有所提高、而对空间、时间和试剂要求降低的鉴定蛋白质和多肽的方法、装置、系统和试剂盒。本发明满足了这些需要以及其它各种需要。
                            发明概述
本发明一方面提供对第一液体样品材料进行分析操作的方法。该方法通常包括：提供微流体装置，该装置具有一个体部，体部内至少有一个第一通道。该第一通道包括第一和第二通道段，第一通道段包括与进行第一操作相容的第一液体环境。第一样品材料流动经过第一通道段进行第一操作。然后，它从第一通道段流入第二通道段。第一稀释剂流入第二通道段，该稀释剂在第二通道段产生了第二液体环境，该第二环境比第一环境更与第二操作相容。
在一个有关的方面，本发明提供对样品材料进行分析操作的装置。该装置通常包括一个体部结构，该体部内部有第一通道段，该第一通道段含有第一环境。该装置还包括在体部内与第一通道段液体相连的第二通道段。至少第一稀释剂源也与第二通道段呈液体相连。该装置通常还包括一个用于将第一稀释剂输送入第二通道段为第二通道段内提供第二环境的与第一稀释剂源可操作相连的流量控制器。在较佳的方案中，该装置还至少包括与第二通道段流体相连的第二稀释剂源。
本发明另一方面提供一种鉴定多肽的方法，该方法包括提供其中装有分离缓冲液的第一毛细管通道。该分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。将多肽引入毛细管通道的一端。施加跨越毛细管通道长度的电场，使不同大小的多肽以不同的速度输送通过聚合物基质。然后当多肽经过沿毛细管通道长度的某点时检测多肽。
本发明另一方面是一种分离多肽的装置。该装置包括一个体部结构，该体部结构有至少其中含分离缓冲液的第一毛细管通道。该分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、洗涤剂以及能与一种或多种多肽结合的亲脂性染料。体部结构中的一个端口与第一毛细管通道液体相连沟通，以便将多肽引入第一毛细管通道。
本发明另一方面是用于鉴定多肽的试剂盒。该试剂盒包括一个微流体装置，该装置包含上述装置的诸元件。分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂和亲脂性染料。每一包装含有体部结构、分离缓冲液和亲脂性染料。
本发明另一方面是鉴定多肽的系统。该系统包括一个体部结构，该体部结构中有至少其中含有分离缓冲液的第一毛细管通道。分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。电源与第一毛细管通道的相对末端操作性相连，以便施加跨越毛细管通道长度的电场。检测器在第一点与毛细管通道传感沟通，以便当多肽通过该第一点时检测多肽。
                        附图简述
图1描述了结合本发明使用的微流体装置。
图2描述了本发明用于鉴定多肽的整个系统。
图3描述了用于在给定缓冲液中测定临界胶束浓度的荧光强度对洗涤剂浓度的曲线。
图4描述了用本发明方法在微流体装置中进行的蛋白质分离色谱图。该色谱图展示成模拟凝胶的形式，显示出12个分开的分离物，每一个在模拟凝胶的一个分开的泳道。
图5是图4所示分离的蛋白质标准品分子量对数值对迁移时间的曲线。
图6是显示洗涤剂-染料前沿峰的分子量标准品色谱图。
图7示意性地描述了根据本文描述的方法进行分离后处理的微流体装置。
图8(A-D)显示了说明分离后稀释效果的分离数据曲线。
                        发明详述
I.方法、装置和试剂
A.综述
本发明提供了用于鉴定多肽、蛋白质及其片段(本文总称“多肽”)的方法、装置、系统和试剂盒。本发明的方法、装置、系统和试剂盒特别适用于通过多肽电泳迁移通过毛细管通道内含的聚合物分离基质根据其分子量来鉴定多肽(通常也统称为“毛细管电泳”)。
如上所述，已有人尝试用毛细管电泳方法来分离蛋白质和多肽。由于毛细管电泳采用封闭的系统(例如毛细管)，因此，蛋白质通常在分离前进行标记。这通常是采取标记基团与待分离混合物中所有蛋白质共价相连的形式。一旦分离后，就可检测每个蛋白质上的标记。共价标记技术通常涉及到复杂的化学机理，至少在分离蛋白质之前需要额外的步骤。另外，标记物通常是相当大的结构，它可能会对蛋白质分子量的测定有不利的影响。尽管有人曾尝试用非共价缔合性染料，但是这些尝试的结果大都不令人满意。
然而，至少本发明第一方面提供了用毛细管电泳方法来鉴定和/或分离蛋白质的方法，该方法迅速、可重复，且在进行分离前没有复杂的样品准备步骤。具体地说，本发明方法提供了第一毛细管通道，该通道内有分离缓冲液，该分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。根据本发明的较佳方案，洗涤剂和缓冲剂在分离缓冲液中的浓度为等于或低于临界胶束浓度(“CMC”)。通过维持洗涤剂和缓冲剂浓度等于或低于CMC，就可最大程度地减少染料与洗涤剂胶束结合等不利影响。不希望受具体操作理论的束缚，认为在以前描述的毛细管系统中染料与洗涤剂胶束的结合产生了很大的本底信号，并且在分离期间产生了不规则信号，例如在信号基线上下扰动(bumps and dips)。相反，本发明方法仔细地控制了系统各组件，从而避免或最大程度地减少了这些不良作用。特别佳的是，至少在操作待检测的分离的组分位置处，使缓冲剂和洗涤剂的水平等于或低于CMC，得以避免染料与胶束结合而产生较高的本底信号。这可以使整个系统维持和/或运行在低于CMC的水平下(如缓冲液和洗涤剂浓度)来实现，或可通过原位处理样品、缓冲液、洗涤剂流体(例如稀释、加入试剂或用其它方式改变溶液)使该系统受检测部分的分离缓冲液降低至低于CMC的水平。
在实践中，通常对待分析和/或鉴定的蛋白质或多肽样品进行预处理，用洗涤剂使蛋白质变性并足量地包裹蛋白质，并对样品中包裹的蛋白质充分地标记。
然后将待鉴定的蛋白质或多肽(或待分离的多肽混合物)加入毛细管通道中，通常在通道段一端。通过施加跨越毛细管通道长度的电场，不同大小的多肽将以不同的速度迁移通过聚合物溶液。包裹在洗涤剂中、结合大量电荷的多肽将以一个方向迁移通过毛细管通道。然而，不同分子量的多肽将以不同的速度迁移通过聚合物溶液，从而被分离。在移动通过通道内分离缓冲液的时候，多肽将吸纳分离缓冲液中的亲脂性染料，并携带有例如在样品预处理、稀释等步骤中任选加入样品的缔合的染料。
至于分离，一旦相互分开，就可在毛细管通道中多肽引入位置下游的某部位利用结合的亲脂性染料来检测多肽(在此部位多肽结合了一定水平的缔合性亲脂性染料)。
B.样品预处理
如上所述，在鉴定前，通常用含有合适洗涤剂的缓冲液对含有蛋白质或多肽的样品进行预处理。特别佳的是用以下缓冲液对多肽样品混合物进行预处理，该缓冲液所含缓冲剂、洗涤剂与分离缓冲液相同，以确保蛋白质在分离前变性。蛋白质变性确保了它在分离期间是线状分子，从而使蛋白质的分离图与其分子量更密切相关，而不论天然蛋白质是球形、线性、丝状还是具有其它一些构型。预处理通常在洗涤剂存在下进行，该洗涤剂的浓度高于样品中的蛋白质浓度(w/v)，较佳的是高于样品蛋白质浓度(w/v)的1.4倍。
为了避免洗涤剂结合染料的干扰影响，通常宜以洗涤剂(其浓度低于或约等于电泳缓冲液中洗涤剂浓度，是电泳缓冲液中洗涤剂浓度的0.05倍到大约3倍)进行样品预处理。
较佳的，预处理缓冲液中的SDS浓度低于电泳缓冲液中所用的浓度。因此，样品预处理通常在浓度约为0.05-2％(较佳的约0.05-1％，更佳的小于0.5％)的洗涤剂存在下进行。如果上样样品中的样品材料以1∶2到1∶20的稀释度稀释，这将使上样样品中的洗涤剂水平在大约0.0025％-1％之间，较佳的在大约0.0025％-0.5％之间，更佳的小于大约0.5％。
这些水平与常规的SDS-PAGE分离相反(在常规SDS-PAGE中，样品在比分离缓冲液高5-20倍的洗涤剂浓度下进行预处理)。具体地说，对于典型的SDS-PAGE方法，样品预处理通常在洗涤剂(如SDS)浓度为2％或更高的50mM加样缓冲液中进行(例如参见美国专利5,616,502)，而电泳缓冲液只含0.1％洗涤剂。然而，在本文所述的毛细管系统中，当加样缓冲液中采用比电泳缓冲液高的洗涤剂水平时，产生了大得多的干扰性洗涤剂前沿，它会与分子量在所需范围内的多肽一起被共同洗脱。例如，图6显示了一套分子量标准品的色谱图(见下文实施例部分)。在下文实施例中，与洗涤剂前沿相结合的峰在大约43秒处洗脱，它对应于分子量60-70kD范围内的蛋白质或多肽的洗脱时间，这是在蛋白质分析中很重要的分子量范围。
通过降低样品预处理步骤中的洗涤剂浓度，还可减少干扰峰。尽管本领域中以前坚持认为样品预处理需要高水平的洗涤剂(例如2％或更高)，但降低洗涤剂浓度已被证实是有效的。另外，根据本文设置的参数来控制样品预处理以及分离缓冲液的离子强度和洗涤剂浓度，可以在一定程度上控制洗涤剂前沿的洗脱曲线，例如使其在待鉴定的多肽之前或之后洗脱。
另外，在较佳的方面，用于预处理的洗涤剂与分离缓冲液中所用的洗涤剂相同(如SDS)。通常，预处理条件可根据总体分离条件(如待分离蛋白质的性质、样品所处的介质如缓冲液和盐浓度等，如下文分离缓冲液部分所述)而异。具体地说，SDS和盐浓度可在如本文所述的参数内变化，以便针对给定的分离操作进行优化。
B.分离缓冲液
根据本发明，分离缓冲液被用于实施本文所述的方法，该缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。本发明可采用各种聚合物，包括交联的和或可胶凝的聚合物。然而，较佳的是采用非交联的聚合物作为聚合物基质。适用于本发明所述方法的非交联的聚合物溶液以前曾描述用于毛细管电泳分离核酸(例如参见美国专利No.5,246,101，5,552,028，5,567,292和5,948,227，这些专利均纳入本文作为参考)。这些非交联的或“线状”聚合物比交联的或胶凝的聚合物更好的优点是易于使用。具体地说，由于这些聚合物溶液的液体性质，它们更容易引入毛细管通道内，使用方便，而胶凝的聚合物通常需要聚合物在毛细管内发生交联反应。
通常，最常用的非交联聚合物溶液是聚丙烯酰胺聚合物，它宜为聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液，可以是中性、带正电或带负电。特别佳的是使用带负电的聚二甲基丙烯酰胺聚合物，例如聚二甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(例如参见美国专利5,948,227)。令人惊奇的是，采用聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液不会导致弄脏毛细管系统中正在分离的蛋白质/多肽。不希望受具体理论的束缚，认为该聚合物溶液在本文所述的系统中具有两个功能。第一个功能是提供一个基质，较大物质移动迁移通过该基质比较小物质所受阻碍更大。这些聚合物溶液的第二个功能是降低或消除毛细管通道内物质的电渗透流动。认为聚合物溶液是通过吸附到毛细管表面而阻断壳套流动(sheath flow)(这是电渗透流动的特征)来实现这一点的。
通常，非交联的聚合物在分离缓冲液中的浓度在大约0.01％-30％(w/v)之间。当然，根据待进行的分离类型(如待鉴定的多肽的性质和/或大小)、进行分离的毛细管通道大小等，可采用不同的聚合物浓度。对于大多数多肽的分离而言，较佳的分离缓冲液中聚合物的浓度为大约0.01％-20％，更佳的在大约0.01％-10％之间。
聚合物溶液中聚合物的平均分子量在一定程度上因聚合物溶液所需应用场合而异。例如，需要较高分辨率的应用场合可采用较高分子量的聚合物溶液，而严谨度较低的应用场合可采用较低分子量的聚合物溶液。通常，本发明所用聚合物溶液的平均分子量在大约1-6000kD范围内，较佳的在大约1-1000kD之间，更佳的在大约100-1000kD之间。
除了上述电荷百分数和分子量，用于本发明的聚合物另一特征为其粘度。具体地说，本文所述系统的聚合物组分当用于毛细管通道内时通常具有在大约2-1000厘泊范围内的溶液粘度，较佳的在大约2-200厘泊范围内，更佳的在大约5-100厘泊范围内。
除了加入非交联聚合物溶液外，本发明所用分离缓冲液中还可包含缓冲剂、洗涤剂和亲脂性染料。
如前所述，多肽的理化性质、尤其是它们的荷质比有很大不同，这取决于它们的氨基酸组成。因此，不同的多肽在施加的电场下通常有不同的电泳迁移率。因此，蛋白质和其它多肽的电泳分离通常利用了在电泳缓冲液中的洗涤剂，以确保所有蛋白质/多肽在电场下以相同方向迁移。例如，在典型的蛋白质分离(如SDS-PAGE)中，样品缓冲液中加入了洗涤剂(十二烷基硫酸钠或SDS)。样品中的蛋白质/多肽被洗涤剂包裹，从而向各种蛋白质/多肽提供了大量负电荷。然后，带负电的蛋白质/多肽在电流作用下向阴极迁移。然而，在筛选基质存在时，较大蛋白质的移动比较小蛋白质慢，从而使它们分离。
根据本发明的某些方面，对分离缓冲液的每一种洗涤剂、缓冲剂和染料组分都进行选择并以一定浓度提供，以最大程度地减少它们之间的不利的相互作用(该相互作用可能干扰蛋白质或多肽的分离和鉴定，例如降低分离效率、信号灵敏度、产生异常的信号等)。具体地说，缓冲剂和洗涤剂通常以能优化多肽分离效率、但最大程度地减小本底信号和基线信号不规则性的浓度来提供。如前所述，已经发现在毛细管分离期间染料与洗涤剂胶束结合产生了高水平的本底信号，并产生了各种基线不规则现象，如上下扰动。
因此，在第一方面，通过使缓冲液中缓冲剂和洗涤剂的浓度低于洗涤剂开始形成过量独立胶束(该胶束可结合染料)时的浓度，实现多肽的分离和/或鉴定。开始形成胶束时的浓度称为临界胶束浓度(“CMC”)。也就是说，CMC是可获得的最高的单体洗涤剂浓度，因此是可能获得的最高的洗涤剂浓度。Helenius dr，Methods in Enzymol.56(63)：734-749(1979)。
洗涤剂溶液的CMC随非极性部分(或烃尾部)大小的增加而减小，在较小程度上随极性基团的大小和极性而减小。Helenius等人，同上。因此，洗涤剂溶液是高于还是低于其CMC不仅取决于洗涤剂浓度，而且还取决于溶液中对CMC可能有影响的其它组分(即缓冲剂)的浓度以及整个溶液的离子强度。因此，在本发明的方法、系统和装置中，分离缓冲液具有一定的洗涤剂浓度和缓冲剂浓度，从而维持分离缓冲液等于或低于CMC。
有许多方法可用于确定缓冲液是否低于其CMC。例如，Rui等人，Anal.Biochem.152：250-255(1986)描述了用N-苯基-1-萘胺荧光染料来测定洗涤剂溶液的CMC。就本文所述的分离缓冲液而言，洗涤剂的浓度通常等于或低于分离缓冲液的CMC。特别佳的是，洗涤剂浓度等于或刚好低于缓冲液的CMC。洗涤剂最优浓度的确定可根据实验来测定。具体地说，用本文所述的亲脂性染料，可通过测定作为随洗涤剂浓度的函数的溶液荧光来测定洗涤剂溶液中的相对胶束浓度。例如，图3描述了含有10μM荧光亲脂性染料(Syto 61，Molecular Probes Inc.)的SDS溶液的荧光强度作为SDS浓度的函数的曲线。临界胶束浓度用A处所示的荧光强度急剧增加来表示。因此，根据本发明，当表明洗涤剂浓度等于或低于CMC时，应理解成洗涤剂浓度落在所示曲线陡峭部分处或以下的浓度，特别是在B处所示曲线点以下，更佳的在点A所示区域内或以下。
应注意，洗涤剂的CMC视洗涤剂而各不相同，而且还会因洗涤剂所处缓冲液的离子强度而异。在典型的分离操作和缓冲液中，分离缓冲液的洗涤剂浓度高于大约0.01％(w/v)，但是低于大约0.5％，而缓冲剂的浓度通常约为10-500mM，条件是缓冲液维持等于或低于CMC。
掺入分离缓冲液的洗涤剂可以选自被描述用于电泳分离的众多洗涤剂中的任何一种。通常，采用阴离子洗涤剂。烷基硫酸盐和烷基磺酸盐洗涤剂通常是较佳的，如十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)和癸基硫酸钠。特别佳的洗涤剂是SDS。在SDS的实施方案中，洗涤剂浓度通常维持在上述浓度。因此，分离缓冲液中较佳的SDS浓度通常大于0.01％(以确保样品的蛋白质被充分包裹)，但小于大约0.5％(以防止形成过量的胶束)。较佳的洗涤剂浓度在大约0.02％-0.15％之间，较佳的在大约0.03％-0.1％之间。
在采用较佳洗涤剂浓度的缓冲液中，缓冲剂通常选自众多不同的缓冲剂。例如，通常和SDS-PAGE应用结合使用的缓冲液也可特别用于本发明，如tris、tris-甘氨酸、HEPES、CAPS、MES、Tricine、这些缓冲剂的组合物等。然而，特别佳的缓冲剂选自离子强度非常低的缓冲剂。使用这样的缓冲液可增加洗涤剂浓度而不超过CMC。较佳的此类缓冲液包括两性离子缓冲液，诸如组氨酸和Tricine等的氨基酸(它们在相关pH下有较高的缓冲能力，但是离子强度非常低，因为它们具有两性离子的性质)。包含较大离子、在系统内具有较低迁移率的缓冲剂也是较佳的，因为它们明显具有使信号基线平滑的能力(例如用Tris作为反荷离子)。
较佳的洗涤剂溶液(例如SDS、十八烷基硫酸钠、癸基硫酸钠等，在上述浓度下)，缓冲剂的浓度通常在大约10-200mM之间，较佳的在10-100mM之间。特别佳的是，用浓度在大约20-100mM之间的Tris-Tricine作为缓冲剂。
参照上述讨论可以看出，当在整个系统/方法的正常操作条件下操作时，最佳的分离缓冲液SDS浓度在大约0.03-0.1％之间，以及浓度约20-100mM之间的缓冲剂Tris-Tricine，两者使得缓冲液等于或低于CMC。
除了前述组分，分离缓冲液通常还包含与待鉴定/分离的蛋白质或多肽结合的缔合性染料或其它可检测的标记基团。这样就能在蛋白质和/或多肽通过分离缓冲液时对它们进行检测。本文所用的术语“缔合性染料”指可检测的标记化合物或部分，它与给定混合物中的其它分子相比优先与感兴趣的一类分子(如蛋白质或肽)结合。就蛋白质或多肽鉴定而言，亲脂性染料特别可用作蛋白质或多肽的缔合性染料。
用于本发明的亲脂性染料的特别佳的例子包括荧光染料，如纳入本文作为参考的美国专利No.5,616,502中描述的步花菁染料。特别佳的染料包括通常以Sypro RedTM、Sypro OrangeTM和Syto 61TM的染料名称购自Molecular Probes，Inc.(Eugene OR)的那些染料。这些染料通常用于对平板凝胶进行染色(在平板凝胶中，过量的染料可被洗去)，且通过洗涤可除去凝胶中SDS的不利影响。然而，令人惊奇的是，本发明者已经发现，当如上所述配制缓冲液时，这些染料特别适用于SDS毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)，它们提供了令人惊奇的灵敏度，很少有或没有“弄脏”或洗涤剂干扰。
另外，比染料与分离缓冲液相容性更出人意料的是，将亲脂性染料加入毛细管通道中的分离缓冲液内不会产生过量的降低试验灵敏度的本底信号。具体地说，将染料加入分离缓冲液中，预计会观察到缓冲液中有来自染料的较高的本底信号。因此，预计需要将染料加入样品溶液中而不是通道内的分离缓冲液中。然而，后一技术在分离时产生了非常低的信号。通过将染料加入毛细管通道内的分离缓冲液中，信号保持较高，而本底信号之低令人惊奇。用于本发明的亲脂性染料在分离缓冲液中的浓度通常在大约0.1μM-1mM之间，更佳的在大约1μM-20μM之间。
C.分离后处理
与上述方法相反，在针对所用染料系统进行优化的缓冲剂和洗涤剂浓度下(例如维持低于具体洗涤剂的CMC)对样品进行预处理和分离，在某些方面，在分离那些组分后以及在检测那些组分期间或之前，改变样品组分所在的缓冲液/洗涤剂条件，这样可以减少或消除洗涤剂胶束的不利影响。具体地说，样品组分(如多肽)可在优化的分离缓冲液和洗涤剂条件或浓度(可等于、高于或低于CMC)下进行分离。一旦分离出样品组分，就改变这些条件，从而优化检测点的缓冲液和/或洗涤剂浓度利于检测步骤，例如将其水平降低至低于CMC的水平。具体地说，通常一旦将洗涤剂水平和/或缓冲液浓度调至低于CMC，胶束就会分散，染料与胶束结合的不利影响就会减少或消除。
通常，就多肽分离而言，改变环境是这样来实现的：在分离的样品组分通过检测器之前向其中加入一种或多种稀释剂，从而使含有样品的分离缓冲液等于或低于CMC。任选地，这也可通过改变洗涤剂与缓冲剂之比使CMC升高至等于或高于洗涤剂的操作浓度，和/或稀释洗涤剂使其浓度低于CMC。因此，可加入稀释剂来维持或降低缓冲剂的浓度，同时通常也会降低洗涤剂的浓度；或可维持洗涤剂浓度，同时降低缓冲剂的浓度。在两种情况之一下，所要达到的目的是消除检测点和检测时的洗涤剂胶束。还可以类似的方式加入能有效破坏洗涤剂胶束的材料，如协同洗涤剂(co-detergent)。
当采用分离后处理时，分离缓冲液组合物可在宽的缓冲液和洗涤剂浓度范围内。例如，分离缓冲液通常包括如上所述的浓度为大约10-200mM的缓冲剂，洗涤剂浓度约为0.01-1.0％，通常高于CMC，例如高大约0.05％，较佳的高大约0.1％。另一方面，亲脂性染料的检测宜在没有过量洗涤剂胶束下进行，过量洗涤剂胶束会结合染料并产生过量的本底信号。因此，稀释分离缓冲液通常是将洗涤剂浓度降低至低于洗涤剂CMC的水平，例如低于大约0.1％。因此，稀释步骤宜在检测前将分离缓冲液稀释大约1∶2-1∶30。尽管这也稀释了待检测的样品组分，但是稀释引起的本底大幅度下降使非常低的水平样品材料很容易检测。
根据本发明的这一方面，微流体装置特别适用于实施这些方法。特别是，装置内包含整合的流体通道网络结构使得易于在流动的料流中加入稀释剂和其它试剂。具体地说，使稀释剂通道紧靠检测区上游，以便将稀释剂和分离的样品组分一起输送入检测区。然后在没有干扰性洗涤剂胶束存在下检测样品组分。图7显示了实现该分离后处理的微流体装置的特别佳的通道设计布局的例子，该例子在下文有更详细的描述。本文所用的术语“上游”和“下游”指在所述系统正常运作期间，从感兴趣材料(如液流、样品组分等)的流动方向来考虑的所述元件的相对位置。通常，术语“上游”指朝向与具体通道相连的样品或缓冲液贮器的方向，而下游指朝向与具体通道相连的废水贮器的方向。
D.毛细管通道和装置
1.综述
本发明还提供了用于进行上述蛋白质鉴定方法的装置和系统。本发明的装置通常包括一个支持基材，该基材包括其中盛有分离缓冲液的分离区。将待分离/鉴定的样品置于分离区的一端，施加跨越该分离区的电场，使样品内的蛋白质/多肽电泳分离。然后用与分离区毗邻且与分离区传感沟通的检测系统，分别检测所分离的蛋白质/多肽。
2.常规的毛细管系统
第一，本发明方法至少适用于常规的基于毛细管的分离系统。因此，在这些方面中，支持基材通常包括毛细管，例如熔融二氧化硅、玻璃或聚合物制的毛细管，它包括穿过其中的毛细管通道。管中至少一部分的毛细管通道是毛细管分离区。将分离缓冲液通过诸如压力泵、毛细管作用等方式加入毛细管通道中，然后将待分离/鉴定的样品注入毛细管通道的一端。将毛细管的一端与阴极贮器(具有与该贮器接触的阴极)放置成流体接触关系，另一端与阳极贮器(具有与该贮器接触的阳极)成流体接触关系，施加通过该毛细管的电场，使样品材料电泳通过毛细管和管内所含的分离缓冲液。当蛋白质和多肽移动经过分离缓冲液时，它们与亲脂性染料结合，然后在毛细管阴极端被检测系统检测到。
在上述分离后处理步骤中，通常在分离后将额外的流体途径或毛细管连接到主分离毛细管上，将额外的缓冲液加入样品组分的流动途径中，使离开分离毛细管的分离的组分与额外的缓冲液或稀释剂混合。该接头处还连接了检测室或毛细管，从而使所有材料都流入待检测的检测区。
3.微流体装置
特别佳的是在微流体装置中进行本发明的方法，该装置提供了置于单块整合固体基材上的微量毛细管通道网。具体地说，支持基材通常包括一个整合的体部结构，它包括了置于其中的一个或多个微量通道的网，这些微量通道中至少有一个是分离通道。分离缓冲液置于至少分离通道内。较佳的是，微流体通道网至少包括第一分离通道，它至少与第一样品注射通道相交。这两个通道相交形成了所称的“注射交叉”。在操作中，样品材料通过注射通道注入并通过分离通道。然后，相交处的部分材料注入分离通道中，于是它通过分离缓冲液进行分离。检测器与分离通道毗邻，以检测分离的蛋白质。
在特别佳的方案中，用于本发明的微流体装置包括多个与样品注射通道流体沟通的样品孔，而这些注射通道又与分离通道流体沟通。这样就能在一个整合的微流体装置中进行多种不同样品的分析。用于本发明的特别佳的微流体装置例子在1998年10月2日提交的共同拥有的美国专利申请No.09/165,704中有所揭示和描述，该文出于所有目的全部纳入本文作为参考。图1描述了该微流体装置的一个例子。如图所示，装置100包括一个平的体部结构102，该结构在其内部包括多个互相连接的通道，如通道104-138。体部结构202中还有多个贮器140-170，这些贮器与各个通道104-138流体沟通。这些贮器中放置了待分析的样品和缓冲液，用于导入该装置的通道内。
在操作时，首先将用于分离/鉴定的分离缓冲液加入一个贮器(如贮器166)中，使其靠毛细作用进入装置的所有通道，从而这些通道中充满分离缓冲液。将待分离/鉴定的样品分别加入贮器140-162中。然后将分离缓冲液加入贮器164、168和170中(它已经存在于贮器166中)。通过施加合适的电流，使第一样品材料从其贮器(如贮器140)经过通道120和116输送或电泳至或通过通道104的主要注射相交部172。这通常是通过在贮器140和168之间施加电流来实现的。通常在相交处施加低水平的紧缩电流(pinching current)，以防样品材料在相交处扩散，例如可从贮器166和170向贮器168施加低水平的电流(例如参见WO96/04547)。短时间后，切换电流(如在贮器170和166之间施加电流)，使相交处的材料向下电泳至主分析通道104。通常，在注射后施加小电流，将通道116和134中的物质拉回相交处，以防渗漏入分离通道。当第一样品向下电泳通道主通道104时，预先装载下一个待分析的样品，使该样品材料从其贮器(如贮器142)通过预先装载的相交处174向预先装载贮器164电泳。使样品材料从其预先装载的位置移动到注射相交处172只要很短的输送时间。一旦第一样品完成分析，就使第二样品材料和前面一样电泳通过注射相交处172，向下注入主分析通道。对于装载入装置的每个样品重复进行该过程。
检测区176通常沿主分析通道104设置，以便提供可从通道检测信号的检测点。本文所述装置通常用透明材料制成。因此，光学检测分析的检测窗实际上可位于分析通道104长度上的任何一点。当分离的样品通过检测窗时，与多肽片段缔合的亲脂性染料被检测。然后，每种多肽片段移动通过分离通道所需的时间就可用来鉴定特定的多肽，例如作为其分子量的测量指标。具体地说，将未知多肽的滞留时间与分子量已知的标准品的滞留时间相比，从标准品内插或外推可确定未知多肽的近似分子量。
如上所述，本文所述的分离后处理方法对于使用微流体通道系统特别有好处。具体地说，将稀释剂源与主分离通道相连接是在合适位置(例如在发生分离后、但检测区或窗口之前的部位)提供与该通道相连的通道的一种简单的方式。图7描述了实现该方案的微流体通道网的例子。如图所示，微流体装置700包括体部702，该体部包括在其内部的一个通道网。通常，图7所示装置参照图1相同的方式制造。该通道网包括主通道704，它分别通过样品通道706a-722a和728a与多个不同的样品材料贮器706-722和728液体沟通。图中还示出了预先装载/废液贮器通道/贮器724/724a以及726/726a。主通道704与缓冲液贮器736以及废液贮器732相连，并包括一个检测区738。如图所示，在主通道104的相对侧有两个稀释剂通道730a和734a与主通道704相沟通，沟通部位紧靠检测区上游(在材料操作流动方向上)，但在主通道704主要部分(在此处该通道有诸如分离的功能)的下游。稀释剂通道730a和734a也与稀释剂源(例如分别是贮器730和734)相连，从而可将稀释剂从这些来源输送至主通道704。
在多肽分离的操作中，当希望鉴定样品(如含多肽的混合物)时，可用分离缓冲液填充装置700的通道。在分离后处理的情况下，该缓冲液无需与上述结构粘附，因为很大程度上没有形成过量胶束的顾虑。通常，在这些情况下，洗涤剂浓度并不象预处理方法中那样重要。具体地说，分离缓冲液可具有较高的洗涤剂浓度，例如约0.1％-2.0％。洗涤剂浓度通常会超过0.1％。填充通道网通常是通过将分离缓冲液加入一个孔(如废液贮器732)来实现的。然后，分离缓冲液会靠毛细作用进入通道网，直至其到达其它每一个贮器706-730以及743-736。任选地，可对废液贮器732稍稍施压，以加速通道网的填充。在缓冲液贮器736和加样/废液贮器724和726中加入额外量的缓冲液(如分离缓冲液)。将稀释剂材料加入稀释剂贮器730和734。
将样品材料加入样品贮器706-722和728的一个或多个中。任选地，将许多不同样品材料置于不同贮器内。然后将该装置放入控制器/检测器仪器(如AgilentTechnologies的2100型生物分析仪)内，该仪器通过控制的电动力学方法(如美国专利No.5,976,336中所述，该专利出于全部目的纳入本文作为参考)引导样品材料移动通过装置的通道。放在诸如贮器706中的样品沿样品通道706a移动，直至其经过通道704，经通道726a流向加样废液贮器726。然后，将样品加样通道706a和主通道704相交处的样品材料部分注入分离通道704并移动通过。在施加的电场下，移动通过分离缓冲液的该部分样品在沿通道704移动时分离出其组分。在其移动时，样品组分(在一些情况下是洗涤剂胶束)吸纳分离缓冲液中存在的亲脂性染料。将含有低浓度或不含洗涤剂的稀释缓冲剂经通道730a和734a连续加入通道704中。该稀释剂将分离缓冲液稀释至低于洗涤剂CMC的点，从而除去了过量的洗涤剂胶束。然后，在检测窗738处检测携带亲脂性染料的稀释的样品组分。在一些情况下，液体稀释实际上是通过侧通道引入液体来实现的。然而，较佳的是侧通道730a和734a通常含有与整个通道网中相同的分离基质。因此，稀释是电泳引入通过电泳进入分离通道的缓冲液的离子物质来实现的，以有效地稀释分离通道中的物质。或者，侧通道703a和734a没有基质，例如它们能支撑压力或电渗流，大量液体导入主通道704中，以稀释分离的样品组分。应注意，选择向通道中加入稀释剂的速度，以使通道中测定点处的洗涤剂浓度降低至低于该洗涤剂在具体条件下的CMC。通常，这包括大约1∶2到1∶30的洗涤剂稀释度。因此，当分离缓冲液包括例如含2％SDS的30mM Tris Tricine缓冲液时，通常希望将洗涤剂水平稀释至低于大约0.1％，较佳的大约0.05％SDS。这样，稀释大约2-3倍至大约4倍。当然，如上所述，具体洗涤剂的CMC将因缓冲液的性质和浓度而异。
尽管前面主要针对将多肽分离缓冲液稀释至低于该缓冲液中洗涤剂的CMC作了描述，但是可以知道本文所述的分离后处理的方法有更广泛的应用。具体地说，这些方法可用于各种分析操作，其中一连串分析方法步骤的随后操作需要与前一步或操作不同的环境，该环境可通过加入用于随后操作的试剂、缓冲液或稀释剂来充分改变。在上述方法描述的例子中，针对多肽分离进行优化的环境可能与最优的检测环境并不最相容。因此，根据对本发明该方面的最宽理解，术语“稀释剂”指改变其所加入的环境的组分，如液体、缓冲剂等。在这种意义上，改变环境包括改变环境的物理性质(如洗涤剂胶束的存在，降低溶液粘度)，而且还包括改变化学环境(如滴加缓冲液以使溶液pH变化从而为pH敏感的染料或其它标记物质提供可操作的环境，改变溶液盐浓度以改变疏水性/亲水性，或影响溶液中的离子相互作用)。
类似地，标记物质可在最初的操作后加入，此时标记物质可能会影响前一操作。这些标记例如包括在特异性蛋白质中加入标记的抗体，从而使该系统起到基于芯片的Western印迹系统的作用。具体地说，在蛋白分离后、检测前，在分离的蛋白质中加入标记的抗体，以优先结合携带识别表位的蛋白质。然后利用蛋白质的大小以及被所选抗体识别的能力来检测蛋白质。
D.整体系统
本发明的装置和试剂通常和分析系统结合使用，该分析系统控制和监测微流体装置和采用本文所述试剂所进行的操作和分析。具体地说，除微流体装置或毛细管系统外，整体系统通常包括与微流体装置或毛细管元件可操作相连的电控制仪，与装置的分离区或通道传感沟通的检测器。
图2显示了本发明系统的一个例子。如图所示，系统200包括微流体装置100，该微流体装置内部有通道网，而该通道网与多个贮器或样品/试剂孔相连。电控制仪202通过多个与微流体装置100贮器中的液体相接触的电极204-234与微流体装置100操作相连。电控制仪202施加了跨越该装置分离通道长度的合适电场，以推动样品材料的电泳，随之推动本发明蛋白质和多肽的分离。微流体装置包括如图所示的相交的通道网，电控制仪施加电流还可使不同材料移动通过各个通道并将这些材料注入其它通道。为控制材料的移动，能提供通过该装置通道的可选择电流水平的电控制仪特别适合用于本发明。这些“电流控制仪”的例子例如在纳入本文作为参考的美国专利No.5,800,690中有详细描述。
整体系统200还包括检测仪204，该检测仪与微流体装置100中通道网的分离通道部分传感沟通。本文所用的术语“传感沟通”指检测仪放置在能接收来自微流体装置内通道的特定信号的位置。例如，以进行操作产生光学信号(如生色、荧光或化学发光信号)的微流体装置为例，检测仪与该装置的半透明部分毗邻，从而使检测仪中的光学元件能接受到微流体装置合适部分的这些光信号。另一方面，为了传感沟通，电化学检测仪通常包括置于该装置合适通道内的电化学传感器(如电极)，以便感受通道内产生或存在的电化学信号。类似地，感受温度的检测仪将与装置的通道呈热传感沟通，以感受其中的温度或相关变化。较佳的是在本发明系统中采用光检测仪，更佳的是将光检测仪制成用于检测荧光信号。因此，这些检测仪通常包括一个光源、将激发光指引向分离通道的光学瞄准器(optical train)，以及用于收集、传播和定量测定从分离通道发射出的荧光量的光学瞄准器和光传感器。通常，利用一个光学瞄准器来传播激发光和荧光发射光，依靠两类能量波长之间的差别来区分它们。通常，装入本发明光检测仪的光传感器选自本领域技术人员熟知的那些光传感器，如光电倍增管(PMT)光电二极管等。特别佳的是用Agilent 2100生物分析仪作为收集器/检测仪系统(AgilentTechnologies)。
本文描述的系统通常还包括与电控制仪操作相连的处理器或计算机206，用来根据用户指令或预先编程的操作参数指导电控制仪的操作。计算机通常还与检测仪操作相连，用于接收和分析检测仪从微流体装置接收到的数据。因此，计算机通常包括合适的程序用于指导电控制仪操作和施加电场以将可能的多种样品各自注入分离通道。通常，计算机还与检测仪操作相连，以接收来自检测仪的数据并记录检测仪收到的信号。处理器或计算机206可以是各种不同类型的处理器中的任何一种。通常，计算机/处理器是IBM PC或PC兼容计算机，其中装有Intel或Advanced Microdevice的微处理器，如奔腾TM或K6TM，或MacIntoshTM、ImacTM或兼容的计算机。
在本发明的鉴定多肽的方法中，计算机或处理器通常经过编程，以接收来自检测仪的信号数据，并鉴定对应于通过检测仪的分离的蛋白的信号峰。通常，一个或多个内部标准蛋白质可与样品材料一起跑电泳。在这些情况下，计算机通常经过编程来鉴定标准品(例如通过其在整个分离中的位置，或最先或最后)，并通过从标准品外推或内插来确定样品中未知多肽的分子量。用于本发明分离方法的特别有用的计算机软件程序在1997年12月30日提交的临时专利申请60/068,980中有所描述，该专利申请纳入本文作为参考。在Agilent 2100 Bioanalyzer上运行的那些实施方案中，计算机通常包括为运行这些系统来分析核酸而提供的类似编程软件。
E.试剂盒
本发明还提供用于进行上述方法试剂盒。总地来说，这些试剂盒包括本文所述的毛细管或微流体装置。试剂盒通常还包括分离缓冲液的各个组分，例如非交联的聚合物筛滤基质、洗涤剂、缓冲剂和亲脂性染料。这些组分在试剂盒中可以是预先配制的缓冲液组分(可以经过或未经预先测定)，或可以预先配制的所有试剂组合在一起提供，这样用户只需将分离缓冲液直接放入微流体装置中即可。除了缓冲液组分，本发明的试剂盒还任选地包括其它有用的试剂，例如分子量标准品以及装置和系统所用的工具，例如帮助将缓冲液、样品或其它试剂加入微流体装置通道内的仪器。
在试剂盒形式中，试剂、装置和详细描述其用途的说明书通常在一个包装单元(如盒子或箱子)内并一起出售。以试剂盒形式提供试剂和装置为用户提供了使用方便、廉价的系统，其中试剂以更方便的用量提供，且均针对所需应用(例如高分子量相对于低分子量蛋白质的分离)作了最优的配制。
下面将参照下列实施例进一步描述本发明，这些实施例只是描述了本发明的某些方面，并没有限制本发明的范围。
                            实施例
所有实验均在12份样品的微流体装置中进行，该装置具有一个分离通道以及图1所示的通道几何图形。控制和检测采用具有多个通道、12个电极的电控制仪/检测仪，沿单个分离通道装有单点激光荧光检测仪。
实施例1：用低于CMC的分离缓冲液分离多肽
用计算机(具有Intel奔腾微处理器的PC)记录从分离通道接收到的荧光数据。将数据显示成荧光对时间的线形图，以及Caliper Technologies Corp的专利权软件产生的模拟凝胶形式。
将0.5M浓度的Tricine溶解在去离子水中，用1M Tris调节pH至7.5，配制得0.5Mtris-Tricine缓冲液溶液。然后，使所得缓冲液过滤通过0.22微米注射器滤膜。以12.5mM Tris-Tricine缓冲液配制含3％聚二甲基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物、0.9％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)和10μM Syto 60染料(Molecular Probes，Eugene OR)的筛滤和分离缓冲液。然后使分离缓冲液过滤通过Costar Spin-XTM 0.22μM乙酸纤维素离心滤膜。
在将样品放入装置贮器中之前，以变性缓冲液对样品进行预处理。变性缓冲液是0.75％SDS(w/v)和1％2-巯基乙醇(v/v)(BME)的250mM Tris-Tricine缓冲液。使样品在0.5毫升微量离心管中与变性缓冲液1∶1混合(例如，20微升样品和20微升缓冲液)，100℃加热10分钟。然后离心加热样品，并搅拌。将样品加入微流体装置的孔内之前，用去离子水作1∶10稀释(例如1微升样品/缓冲液和9微升水)。因此，制得的样品的洗涤剂浓度为0.0375％SDS。
为了准备好微流体装置，用移液管将7.5微升分离缓冲液加入清洁的干的装置的孔166中，并用注射器将分离缓冲液压入该装置的所有通道内。然后用移液管在孔164、168和170中各加入7.5微升分离缓冲液。用移液管将0.5微升稀释的样品分别加入孔140-162的各个孔中。在图4所示的实施例中，采用分子量已知的标准品。标准品包括卵白蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5kD)和α-乳白蛋白(14.4kD)。
参看图1，孔142和146只含缓冲液，用作空白。将含有四种蛋白质标准品各100微克/毫升的标准蛋白质溶液加入孔150和154的各孔内，同时将含同样四种蛋白质各500微克/毫升的溶液加入孔158和162中。将仅含1000微克/毫升碳酸酐酶标准品的溶液加入孔140和144中。将含有100微克/毫升碳酸酐酶和胰蛋白酶抑制剂的溶液加入孔148和152中，同时将含有相同蛋白质(但为500微克/毫升)的溶液加入孔156和160中。
将每份样品分开向下注入主分离通道104，检测分离的组分作为从注射起的滞留时间的函数。每次运行的色谱图以暗色条带的形式显示，以模拟标准的考马斯染色SDS-PAGE凝胶。模拟凝胶的每条泳道代表分离的样品的色谱图，暗色条带表示荧光增加超过本底增加。具体地说，制得卵白蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5kD)和α-乳白蛋白(14.4kD)的混合物。使四种蛋白的混合物以两种不同浓度(100微克/毫升(泳道A2，孔154)和500微克/毫升(泳道A3，孔162))跑电泳。另外如下制得这些标准品的每一种的分开的混合物并跑电泳：
泳道B1(孔144)：        碳酸酐酶(1毫克/毫升)
泳道B2(孔152)：        胰蛋白酶抑制剂和碳酸酐酶(均为100微
                       克/毫升)
泳道B3(孔160)：        与B2相同(均为500微克/毫升)
泳道C2(孔142)：        与泳道A2相同
泳道C3(孔150)：        与泳道A3相同
泳道D1-D3(孔140-156)： 与B1-B3相同
图5显示了以上述相同方式跑电泳的一系列标准品的分子量对数对迁移时间的曲线。从图5可以看出，所述分离方法产生了准确的线性数据，这样就能通过将那些未知蛋白质的迁移时间根据所示曲线与标准品系列关联起来来鉴定未知分子量的蛋白质。从图4和图5可以看出，本发明为鉴定蛋白质和其它多肽提供了具有高度重复性的准确而迅速的方法。
另外还对包括Cy-5染料标记的同一组标准品进行电泳，以显示洗涤剂染料前沿的共同洗脱。该电泳的色谱图示于图6。从图6可以看出，洗涤剂-染料峰(用星号表示)与分子量为65kD的蛋白质基本上同时洗脱。而当样品预处理缓冲液中洗涤剂浓度处于本领域先前所述的水平(例如2％)时，显示出的峰要大得多，且该峰对在该分子量范围内的蛋白质的鉴定和定量有很大干扰。
实施例2：用分离后/检测前稀释来分离和检测多肽
用上述分离缓冲液充满图7所示的微流体装置。分离通道704在注射点下游1.2厘米、检测点732上游0.1厘米处，与稀释剂通道702a和722a相交。分离缓冲液含有4.2％非交联的聚二甲基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的30mM Tris Tricine缓冲液和0.13％SDS。将含有30mM Tris-Tricine、没有聚合物或SDS的稀释缓冲液放入贮器720和722中。缓冲剂通过电动力学法(如电泳)流入分离通道。
在样品贮器(如贮器706)中加入多肽标准溶液(10-205kD蛋白质标准品，购自Bio-Rad，Inc.)，用前面纳入本文作参考的美国专利5,976,336中描述的相同方法加样并注入分离通道内。
图8A-8D描述了采用分离后处理和未用分离后处理的标准品分离操作在检测点732处在2100型生物分析仪(Agilent Technologies，Inc.)检测到的荧光对时间的曲线。具体地说，图8A和B显示了在没有分离后稀释功能的微流体装置中进行的空白试验(样品中没有多肽)和蛋白质样品试验。该装置在功能上与图1所示装置的通道布局相似。如图所示，空白和多肽试验数据有高本底以及其它基线问题(包括有大的洗涤剂染料前沿，然后是基线凹陷(divot)，然后是染料峰)。在样品分离操作中发现这些相同的基线偏差，从而给分离数据的定性和定量带来很大困难。图8C和8D描述了采用分离后稀释步骤进行的同样的空白试验和多肽样品分析，其中在大部分分离通道的下游、检测点的上游将Tris Tricine缓冲液引入分离通道。如图所示，分离后稀释步骤相对于检测的样品组分使总体本底荧光比未稀释的样品大大降低，同时也减少了与胶束染料结合有关的如图8A和8B所示的基线上下起伏。
除非另有具体描述，本文提供的所有浓度值均指某给定组分在该组分加入混合物或溶液时的浓度，与该组分加入混合物或溶液中后发生任何转变、分解、反应或转变成一种或多种不同物质无关。
所有出版物和专利申请均纳入本文作为参考，正如每一单独出版物或专利申请具体单独地表明纳入本文作为参考一样。尽管本发明为了清楚和理解的目的已经通过说明和实施例作了一些详尽的描述，但在所附权利要求范围内显然还能作一些变化和改动。

Claims (25)

1.一种对多肽样品进行分析操作的方法，该方法包括：
提供一种微流体装置，该装置具有体部，体部中至少有第一通道，该第一通道包括第一和第二通道段，第一通道段包括分离缓冲液，其中所述分离缓冲液包含有第一洗涤剂浓度的洗涤剂，其中所述第一洗涤剂浓度等于或高于洗涤剂临界胶束浓度；
使多肽样品流动通过第一通道段进行分离操作；
使多肽样品从第一通道段流入第二通道段；和
在第二通道段中引入稀释剂，该稀释剂在第二通道段内产生了第二洗涤剂浓度，该第二洗涤剂浓度低于洗涤剂临界胶束浓度；和
在第二通道段进行检测操作。
2.根据权利要求1所述的方法，其中分离操作包括电泳多肽分离。
3.根据权利要求2所述的方法，其中第一洗涤剂浓度大于0.1％。
4.根据权利要求2所述的方法，其中检测操作包括检测与分离操作中分离的多肽相结合的亲脂性染料。
5.根据权利要求4所述的方法，其中第二洗涤剂浓度低于0.1％。
6.根据权利要求4所述的方法，其中第二洗涤剂浓度为0.05％。
7.根据权利要求2所述的方法，其中分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂和亲脂性染料。
8.根据权利要求7所述的方法，其中聚合物基质包含非交联的聚合物溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中非交联的聚合物溶液包括聚丙烯酰胺线状聚合物溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中聚丙烯酰胺线状聚合物在分离缓冲液中的浓度在0.1-20％w/v之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中洗涤剂包括烷基磺酸盐洗涤剂。
12.根据权利要求1所述的方法，其中洗涤剂选自十八烷基硫酸钠、癸基硫酸钠和十二烷基硫酸钠。
13.根据权利要求1所述的方法，其中洗涤剂是十二烷基硫酸钠。
14.根据权利要求1所述的方法，其中洗涤剂在第一通道段中分离缓冲液内的浓度大于0.03％。
15.根据权利要求1所述的方法，其中稀释剂是没有洗涤剂的缓冲剂。
16.根据权利要求7所述的方法，其中缓冲剂是Tris-Tricine。
17.根据权利要求7所述的方法，其中缓冲剂在第一通道段中分离缓冲液内的浓度在10mM-100mM之间。
18.根据权利要求7所述的方法，其中亲脂性染料是荧光亲脂性染料。
19.根据权利要求7所述的方法，其中亲脂性染料在第一通道段中分离缓冲液内的浓度为0.1μM-20μM。
20.一种微流体装置，它包括：
体部结构；
在体部内部的第一通道段，第一通道段内有分离缓冲液，其中所述分离缓冲液包含第一洗涤剂浓度的洗涤剂，其中所述第一洗涤剂浓度等于或高于洗涤剂临界胶束浓度；
与第一通道段流体相连的第二通道段；
与第二通道段流体相连的至少第一稀释剂源，所述稀释剂源含有稀释剂；和
与第一稀释剂源操作相连的、用于将稀释剂输送入第二通道段以便在第二通道段中提供低于临界胶束浓度的洗涤剂浓度的流量控制仪。
21.根据权利要求20所述的微流体装置，其中分离缓冲液含有聚合物基质和缓冲剂。
22.根据权利要求21所述的微流体装置，其中洗涤剂是烷基硫酸盐洗涤剂。
23.根据权利要求21所述的微流体装置，其中洗涤剂选自癸基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和十八烷基硫酸钠。
24.根据权利要求20所述的微流体装置，其中稀释剂是含有缓冲剂、不含洗涤剂的稀释缓冲液。
25.根据权利要求21所述的微流体装置，它还至少包括与第二通道段流体相连的第二稀释剂源。
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