JP2833115B2 - タンパク質分析法 - Google Patents
タンパク質分析法Info
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- JP2833115B2 JP2833115B2 JP2059394A JP5939490A JP2833115B2 JP 2833115 B2 JP2833115 B2 JP 2833115B2 JP 2059394 A JP2059394 A JP 2059394A JP 5939490 A JP5939490 A JP 5939490A JP 2833115 B2 JP2833115 B2 JP 2833115B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明はタンパク質分析法に関する。さらに詳しく
は、タンパク質、核酸等の生体高分子の高分離分析及び
精製法に係わり、ことに構造や性質が接近したタンパク
質の分離に好適な分析法に関する。
は、タンパク質、核酸等の生体高分子の高分離分析及び
精製法に係わり、ことに構造や性質が接近したタンパク
質の分離に好適な分析法に関する。
（ロ）従来の技術 電気泳動の高分離化技術として近年急速に研究がなさ
れているキャピラリ電気泳動法は、キャピラリから効果
的にジュール熱を除去することによって高電圧で泳動が
できるため、１）原理的に高分離、迅速分析が可能、
２）オンカラム検出器によって装置の自動化が可能、等
の利点があり、ペプチド、タンパク質、核酸等の分離分
析及び精製を初めとして、光学分割、同位体の分離その
他極めて酷似した成分間の分離に適した方法として汎用
されている。
れているキャピラリ電気泳動法は、キャピラリから効果
的にジュール熱を除去することによって高電圧で泳動が
できるため、１）原理的に高分離、迅速分析が可能、
２）オンカラム検出器によって装置の自動化が可能、等
の利点があり、ペプチド、タンパク質、核酸等の分離分
析及び精製を初めとして、光学分割、同位体の分離その
他極めて酷似した成分間の分離に適した方法として汎用
されている。
しかしながら、キャピラリ電気泳動法をタンパク質の
分離に応用するとき、問題になる現象として、タンパク
質のフューズドシリカキャピラリへの吸着がある。その
対策として従来、１）キャピラリ表面の化学的処理、
２）試料タンパク質の等電点よりも高いpH（強アルカリ
性）を有する緩衝溶液の使用、３）極めて低いpHを有す
る緩衝溶液の使用、４）K+イオン等を加えた塩濃度の高
い緩衝溶液の使用、等の方法がとられている。
分離に応用するとき、問題になる現象として、タンパク
質のフューズドシリカキャピラリへの吸着がある。その
対策として従来、１）キャピラリ表面の化学的処理、
２）試料タンパク質の等電点よりも高いpH（強アルカリ
性）を有する緩衝溶液の使用、３）極めて低いpHを有す
る緩衝溶液の使用、４）K+イオン等を加えた塩濃度の高
い緩衝溶液の使用、等の方法がとられている。
（ハ）発明が解決しようとする課題 しかしながら、化学修飾したフェーズドシリカキャピ
ラリの表面は、使用回数と共にその効果を失い、結果的
に再現性が問題となる。強アルカリ下での使用は、フェ
ーズドシリカキャピラリの安定性が問題となる。
ラリの表面は、使用回数と共にその効果を失い、結果的
に再現性が問題となる。強アルカリ下での使用は、フェ
ーズドシリカキャピラリの安定性が問題となる。
また、緩衝溶液を低いpHにしたとき、タンパク質は殆
ど正に帯電し、電気浸透流と同一方向（検出器側）に迅
速に移動するが、タンパク質間の電化の差が小さいた
め、移動度の差（タイムウィンドウ）も小さく、完全な
分離は困難である。さらに、低いpHや塩濃度の高い緩衝
溶液では、比較的高い理論段数が得られるが、電気伝導
度が大きくなるため、温度上昇に伴うバンドの広がり
等、高電圧の負荷に制限があった。
ど正に帯電し、電気浸透流と同一方向（検出器側）に迅
速に移動するが、タンパク質間の電化の差が小さいた
め、移動度の差（タイムウィンドウ）も小さく、完全な
分離は困難である。さらに、低いpHや塩濃度の高い緩衝
溶液では、比較的高い理論段数が得られるが、電気伝導
度が大きくなるため、温度上昇に伴うバンドの広がり
等、高電圧の負荷に制限があった。
一方、ミセルへの分配を利用する動電クロマトグラフ
ィによりタンパク質を分離する方法においては、ミセル
濃度の上昇と共に、タンパク質の移動度が遅くなり、結
果的に分離は良くなるが、電気電導率も上昇するため、
高電流に伴う温度勾配の問題が生じる。
ィによりタンパク質を分離する方法においては、ミセル
濃度の上昇と共に、タンパク質の移動度が遅くなり、結
果的に分離は良くなるが、電気電導率も上昇するため、
高電流に伴う温度勾配の問題が生じる。
この発明はかかる状況に鑑み為されたものであり、タ
ンパク質を、キャピラリ電気泳動の手法やミセルへの分
配を利用する動電クロマトグラフィにより、短時間でし
かも高い分離効率で分離しうる分析法を提供しようとす
るものである。
ンパク質を、キャピラリ電気泳動の手法やミセルへの分
配を利用する動電クロマトグラフィにより、短時間でし
かも高い分離効率で分離しうる分析法を提供しようとす
るものである。
（ニ）課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、緩衝溶液が一様に充填さ
れたキャピラリの両端に定電圧を印加することにより、
該キャピラリ内でタンパク質を泳動させて分離するキャ
ピラリ電気泳動法からなり、上記緩衝溶液が、タンパク
質と配位しうる２価の金属イオンを含有する酸性の緩衝
溶液であることを特徴とするタンパク質分析法、及び、
界面活性剤を臨界ミセル濃度以下に含有する緩衝溶液が
充填されたキャピラリの両端に定電圧を印加することに
より、該キャピラリ内でタンパク質をミセルの泳動によ
り分離する界面動電クロマトグラフィからなり、上記緩
衝溶液が、タンパク質と配位しうる２価の金属イオンを
含有する中性の緩衝溶液であることを特徴とするタンパ
ク質分析法が提供される。
れたキャピラリの両端に定電圧を印加することにより、
該キャピラリ内でタンパク質を泳動させて分離するキャ
ピラリ電気泳動法からなり、上記緩衝溶液が、タンパク
質と配位しうる２価の金属イオンを含有する酸性の緩衝
溶液であることを特徴とするタンパク質分析法、及び、
界面活性剤を臨界ミセル濃度以下に含有する緩衝溶液が
充填されたキャピラリの両端に定電圧を印加することに
より、該キャピラリ内でタンパク質をミセルの泳動によ
り分離する界面動電クロマトグラフィからなり、上記緩
衝溶液が、タンパク質と配位しうる２価の金属イオンを
含有する中性の緩衝溶液であることを特徴とするタンパ
ク質分析法が提供される。
この発明の方法において、キャピラリ電気泳動法及び
界面動電クロマトグラフィの緩衝溶液には、タンパク質
と配位しうる２価の金属イオンが添加される。該金属イ
オンとしては例えば銅イオン（Cu2+）、マグネシウムイ
オン（Mg2+）、亜鉛イオン（Zn2+）等が挙げられる。
界面動電クロマトグラフィの緩衝溶液には、タンパク質
と配位しうる２価の金属イオンが添加される。該金属イ
オンとしては例えば銅イオン（Cu2+）、マグネシウムイ
オン（Mg2+）、亜鉛イオン（Zn2+）等が挙げられる。
上記金属イオンは、予め緩衝溶液調製の際に添加され
るが、このとき分析対象であるタンパク質を含有する水
性試料中にも添加することができる。なお、この場合は
タンパク質が変性しない程度に用いられる。
るが、このとき分析対象であるタンパク質を含有する水
性試料中にも添加することができる。なお、この場合は
タンパク質が変性しない程度に用いられる。
上記金属イオンの添加量としては、過剰であればキャ
ピラリを構成するフューズドシリカのシラノール器が金
属イオンによりカバーされてしまい、これにより電位浸
透流の速度が低下する上、試料がその金属イオンに吸着
するため、試料の移動が遅くなってブロードなクロマト
グラムしか得られなくなる。また少なすぎる場合は所期
の効果が得られない。従って10-5〜10-4モル程度が好ま
しい。
ピラリを構成するフューズドシリカのシラノール器が金
属イオンによりカバーされてしまい、これにより電位浸
透流の速度が低下する上、試料がその金属イオンに吸着
するため、試料の移動が遅くなってブロードなクロマト
グラムしか得られなくなる。また少なすぎる場合は所期
の効果が得られない。従って10-5〜10-4モル程度が好ま
しい。
（ホ）作用 この発明によれば、緩衝溶液に２価の金属イオンが共
存すると、フューズドシリカ表面の電気二重層が影響を
受け、ゼータ電位が減少するため電気浸透流の速度が低
下する。これと共にタンパク質は末端アミノ基とそれに
隣接するペプチドにより金属イオンに配位できるため、
全体としての電荷にズレが生じることとなり、分離選択
性が変化する。
存すると、フューズドシリカ表面の電気二重層が影響を
受け、ゼータ電位が減少するため電気浸透流の速度が低
下する。これと共にタンパク質は末端アミノ基とそれに
隣接するペプチドにより金属イオンに配位できるため、
全体としての電荷にズレが生じることとなり、分離選択
性が変化する。
また、ミセルへの分配を利用する動電クロマトグラフ
ィにおいて、界面活性剤を臨界ミセル濃度以上に含有す
る緩衝溶液に２価の金属イオンを少量添加することによ
り、ミセル表面に付着した金属イオンとタンパク質間の
錯形成、フューズドシリカ表面に吸着した金属イオンに
タンパク質が吸着する遅延効果等金属イオンのミセル表
面とフューズドシリカ表面への競合的吸着が生ずること
となる。
ィにおいて、界面活性剤を臨界ミセル濃度以上に含有す
る緩衝溶液に２価の金属イオンを少量添加することによ
り、ミセル表面に付着した金属イオンとタンパク質間の
錯形成、フューズドシリカ表面に吸着した金属イオンに
タンパク質が吸着する遅延効果等金属イオンのミセル表
面とフューズドシリカ表面への競合的吸着が生ずること
となる。
以下実施例によりこの発明を詳細に説明するが、これ
によりこの発明は限定されるものではない。
によりこの発明は限定されるものではない。
（ヘ）実施例 実施例１ 第１図はこの発明の方法を実施するキャピラリ電気泳
動装置の一例の構成説明図である。同図において、キャ
ピラリ電気泳動装置（１）は、フューズドシリカキャピ
ラリ泳動管（２）と、該キャピラリ泳動管の一部を保持
する検出器（３）と、上記キャピラリ泳動管の両端間に
所定の直流電圧を印加する高電圧電源（４）と、泳動用
緩衝溶液が満たされた１対のリザーバ（５）（６）と、
これらのリザーバ内にそれぞれ挿入され、上記高電圧電
源の電極を構成する１対の白金電極（７）（８）と、上
記検出器と高電源電圧とを制御するコントローラ及びデ
ータ処理システム（９）とから主として構成されてい
る。なお、リザーバ（５）に隣接して複数の試料が収納
されたサンプルホルダ（10）が配置されている。
動装置の一例の構成説明図である。同図において、キャ
ピラリ電気泳動装置（１）は、フューズドシリカキャピ
ラリ泳動管（２）と、該キャピラリ泳動管の一部を保持
する検出器（３）と、上記キャピラリ泳動管の両端間に
所定の直流電圧を印加する高電圧電源（４）と、泳動用
緩衝溶液が満たされた１対のリザーバ（５）（６）と、
これらのリザーバ内にそれぞれ挿入され、上記高電圧電
源の電極を構成する１対の白金電極（７）（８）と、上
記検出器と高電源電圧とを制御するコントローラ及びデ
ータ処理システム（９）とから主として構成されてい
る。なお、リザーバ（５）に隣接して複数の試料が収納
されたサンプルホルダ（10）が配置されている。
この装置（１）を用いての測定は、試料の注入に際し
てはリザーバ（５）側のフューズドシリカキャピラリ泳
動管（２）の一端を試料容器の１つに入れ、他方のキャ
ピラリ泳動管端部（すなわちリザーバ（６）内に浸漬さ
れている端部）より高い位置（図中ｈ＜10cm）に持ち上
げ、規定時間静止させるサイフォン式によった。
てはリザーバ（５）側のフューズドシリカキャピラリ泳
動管（２）の一端を試料容器の１つに入れ、他方のキャ
ピラリ泳動管端部（すなわちリザーバ（６）内に浸漬さ
れている端部）より高い位置（図中ｈ＜10cm）に持ち上
げ、規定時間静止させるサイフォン式によった。
上記装置（１）に、下記５成分のタンパク質混合試料
を10秒間注入し、第２図に示すエレクトロフェログラム
を得た。
を10秒間注入し、第２図に示すエレクトロフェログラム
を得た。
リゾチーム（鶏卵白）、 シトクロームＣ（ウマ心臓）、 リボヌクレアーゼＡ（仔牛すい臓）、 α−キモトリプシノーゲン（仔牛すい臓）、 ミオグロビン（ウマ骨格筋）、 の各0.1mg/ml混合物 なお装置の分析条件は下記のごとくであった。
緩衝溶液 :50mM（ナトリウム）リン酸バッファ（pH 2.5）、 1mMのCu2+添加 キャピラリ ：全長60、 注入端から検出器までの有効長45、 付加電圧 :20kV、 電流値 :23μＡ また、比較例として、Cu2+を添加しない以外は、上記
と同一のタンパク質試料を上記と同様の分析条件のもと
で分析したところ、第３図に示すエレクトロフェログラ
ムを得た。
と同一のタンパク質試料を上記と同様の分析条件のもと
で分析したところ、第３図に示すエレクトロフェログラ
ムを得た。
上記第２図と第３図との比較から、銅（II）イオンが
添加された緩衝溶液を用いることにより、分離能が向上
していることが分かる。
添加された緩衝溶液を用いることにより、分離能が向上
していることが分かる。
実施例２ 第１図の構成の装置において、後述する分析条件に
て、下記の４成分のタンパク質混合試料を５秒間注入し
て界面動電クロマトグラフィに付し、第４図に示すエレ
クトロフェログラムを得た。
て、下記の４成分のタンパク質混合試料を５秒間注入し
て界面動電クロマトグラフィに付し、第４図に示すエレ
クトロフェログラムを得た。
リゾチーム（鶏卵白）、 シトクロームＣ（ウマ心臓）、 リボヌクレアーゼＡ（仔牛すい臓）、 α−キモトリプシノーゲン（仔牛すい臓）、 の各0.1mg/ml混合物 〔分析条件〕 緩衝溶液 :50mM SDS・10mM NaH2PO4・5mM Na2B4O ７（pH7.1）、 0.2mMのCu2+添加 キャピラリ ：全長45、 注入端から検出器までの有効長30、 付加電圧 :13kV、 電流値 :22μＡ なお、比較例として、Cu2+を添加しない以外は、上記
と同一のタンパク質試料を上記と同様の分析条件のもと
で分析したところ、第５図に示すエレクトロフェログラ
ムを得た。
と同一のタンパク質試料を上記と同様の分析条件のもと
で分析したところ、第５図に示すエレクトロフェログラ
ムを得た。
上記結果から、銅（II）イオンを適当量添加すること
により、分離能は向上し、No.4のピークでＮ＝120,000
という高理論段数が容易に得られた。なお、このとき銅
（II）イオン濃度を上げても大幅な電流値の上昇はみら
れなかった。
により、分離能は向上し、No.4のピークでＮ＝120,000
という高理論段数が容易に得られた。なお、このとき銅
（II）イオン濃度を上げても大幅な電流値の上昇はみら
れなかった。
（ト）発明の効果 この発明によれば、タンパク質を、キャピラリ電気泳
動法及び界面動電クロマトグラフィの手法により、短時
間でかつ高分解能で分離することができる。
動法及び界面動電クロマトグラフィの手法により、短時
間でかつ高分解能で分離することができる。
第１図はこの発明の方法を実施するキャピラリ電気泳動
装置の一例の概略図、第２図は第１図の装置を用いたキ
ャピラリ電気泳動法により得られたエレクトロフェログ
ラム図、第３図は比較例の第２図相当図、第４図は第１
図の装置を用いた界面動電クロマトグラフィにより得ら
れたエレクトロフェログラム図、第５図は比較例の第４
図相当図である。 ２……フューズドシリカキャピラリ泳動管、 ３……検出器、４……高電圧電源、 5,6……リザーバ、7,8……白金電極、 ９……コントローラ及びデータ処理システム、 10……サンプルホルダ。
装置の一例の概略図、第２図は第１図の装置を用いたキ
ャピラリ電気泳動法により得られたエレクトロフェログ
ラム図、第３図は比較例の第２図相当図、第４図は第１
図の装置を用いた界面動電クロマトグラフィにより得ら
れたエレクトロフェログラム図、第５図は比較例の第４
図相当図である。 ２……フューズドシリカキャピラリ泳動管、 ３……検出器、４……高電圧電源、 5,6……リザーバ、7,8……白金電極、 ９……コントローラ及びデータ処理システム、 10……サンプルホルダ。
Claims (2)
- 【請求項１】緩衝溶液が一様に充填されたキャピラリの
両端に定電圧を印加することにより、該キャピラリ内で
タンパク質を泳動させて分離するキャピラリ電気泳動法
からなり、 上記緩衝溶液が、タンパク質と配位しうる２価の金属イ
オンを含有する酸性の緩衝溶液であることを特徴とする
タンパク質分析法。 - 【請求項２】界面活性剤を臨界ミセル濃度以下に含有す
る緩衝溶液が充填されたキャピラリの両端に定電圧を印
加することにより、該キャピラリ内でタンパク質をミセ
ルの泳動により分離する界面動電クロマトグラフィから
なり、 上記緩衝溶液が、タンパク質と配位しうる２価の金属イ
オンを含有する中性の緩衝溶液であることを特徴とする
タンパク質分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2059394A JP2833115B2 (ja) | 1990-03-09 | 1990-03-09 | タンパク質分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2059394A JP2833115B2 (ja) | 1990-03-09 | 1990-03-09 | タンパク質分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03259740A JPH03259740A (ja) | 1991-11-19 |
| JP2833115B2 true JP2833115B2 (ja) | 1998-12-09 |
Family
ID=13112028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2059394A Expired - Fee Related JP2833115B2 (ja) | 1990-03-09 | 1990-03-09 | タンパク質分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2833115B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2278320B1 (en) * | 1999-02-02 | 2018-07-18 | Caliper Life Sciences, Inc. | Methods and devices for characterizing proteins |
| CN103694329B (zh) * | 2013-12-31 | 2017-06-13 | 华中师范大学 | 电荷‑质量双聚焦二维凝胶电泳分离方法及其试剂盒 |
-
1990
- 1990-03-09 JP JP2059394A patent/JP2833115B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03259740A (ja) | 1991-11-19 |
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