CN1910450A - 表征蛋白质的方法、装置和系统 - Google Patents

Abstract

一种表征多肽的方法，该方法包括提供装有分离缓冲液的第一毛细管通道，其中分离缓冲液包含非交联聚合物溶液、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。提供分离缓冲液，以使在检测时，缓冲液中的去污剂浓度不高于临界胶束浓度。将多肽引入毛细管通道的一端。跨毛细管通道长施加电场，将不同大小的多肽以不同速率运输通过聚合物溶液。然后在多肽通过沿毛细管通道长上的一个点时检测多肽。

Description

表征蛋白质的方法、装置和系统

                        发明背景

设法理解生命、维持生命的过程以及影响这些过程的事件和要素的任何努力必须表征生物化合物。一般来说，理解生命过程和实现其控制首先集中在生命的基本构件上，即将活生物体与无生命的原生软泥区分开的大分子化合物和复合物。在理解和控制生命过程中尤其感兴趣的是核酸和它们编码的蛋白质。

在蛋白质的情况下，在过去几十年中许多表征方法大部分仍没有改变。例如，当前的蛋白质表征方法一般依赖于或至少部分依赖于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳或SDS-PAGE，以通过相对分子量表征蛋白质。这些方法采用一板或片层交联的聚丙烯酰胺。待分离和表征的蛋白质与去污剂缓冲液(SDS)混合，放在该板的一边，一般在孔中。跨越该板施加电场，使含有蛋白质的高度带电的去污剂胶束通过凝胶。较大蛋白质比较小蛋白质通过该板凝胶移动得慢，从而从较大的胶束中分离出来。分离后，使该凝胶接触在凝胶中结合于不同蛋白质的染料，一般是“考马斯蓝”或银络合剂。在考马斯蓝染色凝胶的情况下，该板凝胶必须脱色以去除过多染色剂。这些方法在该板凝胶中产生不同蛋白质由大小分为梯状。银染法也同样耗时，通常定量地产生，尽管非定量地染色凝胶。这些方法的改进已产生展开较快的较小凝胶、购买的“即用型”凝胶和替代染色方法。然而，作为蛋白质表征方法，基本SDS-PAGE方法仍然大部分未改变。

进行了应用蛋白质表征的其它领域中取得进展的许多尝试。例如，在表征蛋白质中尝试了经证明成功用于分析核酸的毛细管电泳法(CE)。虽然证明这些方法能够分离蛋白质，可行的标记化学的差异以及蛋白质和核酸之间的基本结构和化学差异对CE法在蛋白质表征中的广泛使用产生相当大的障碍。具体说，检测通过毛细管分离的蛋白质一般需要用相对复杂的化学方法将标记基团共价连接于所有蛋白质。而且，在蛋白质分离中存在SDS(它保证基于大小的分离)使得在毛细管系统中标记和分离更困难。

需要提供表征蛋白质和多肽的方法、装置、系统和试剂盒，它们的通量、灵敏度增加，空间、时间和试剂要求降低。本发明满足了这些和各种其它需要。

                               发明概述

在一个方面，本发明提供了对液态第一种样品材料进行分析操作的方法。该方法一般包括提供微流体装置，该装置的主体中至少具有第一通道。第一通道包括第一和第二通道段，其中第一通道段包含与进行第一次操作相容的第一液体环境。第一样品材料流过第一通道段以进行第一次操作。然后从第一通道段流入第二通道段。第一稀释剂流入第二通道段，稀释剂在第二通道段中产生第二液体环境，第二环境比第一环境与第二次操作更相容。

在相关方面，本发明提供了对样品材料进行分析操作的装置。该装置总地包括主体内部装有第一通道段的主体结构，第一通道段含有第一环境。该装置也包括装在主体内并与第一通道段流体相连的第二通道段。也至少提供第一稀释剂来源，流体偶联于第二通道段。该装置一般也包括流控制器，它操作性偶联于第一稀释剂来源以将第一稀释剂递送到第二通道段中，在第二通道段中提供第二环境。在另一方面，本发明提供了表征多肽的方法，该方法包括提供其中具有分离缓冲液的第一毛细管通道。分离缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。将多肽引入毛细管通道的一端。跨一段毛细管通道施加电场，将不同大小的多肽以不同速率运输通过聚合物基质。然后在多肽通过沿毛细管通道长上的一点时检测多肽。

本发明的另一方面是分离多肽的装置。该装置由至少具有其中含有分离缓冲液的第一毛细管通道的主体结构组成。分离缓冲液由聚合物基质、缓冲剂、去污剂和能够结合多肽的亲脂性染料组成。装在主体结构中的口与第一毛细管通道流体相连，以将多肽引入第一毛细管通道。

本发明的又一方面是用于表征多肽的试剂盒。该试剂盒由包含上述装置的元件的微流体装置组成。分离缓冲液由聚合物基质、缓冲剂和亲脂性染料组成。各包装含有主体结构、分离缓冲液和亲脂性染料。

本发明的另一方面是表征多肽的系统。该系统包括至少具有含分离缓冲液的第一毛细管通道的主体结构。分离缓冲液由聚合物基质、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料组成。电源操作性偶联于第一毛细管通道的两端，以跨一段毛细管通道施加电场。安置检测器，使其能与第一点上的毛细管通道传感通讯，以在多肽通过第一点时检测该多肽。

                         附图简要说明

图1说明与本发明联用的微流体装置。

图2说明用于根据本发明表征多肽的总系统。

图3说明荧光强度与去污剂浓度的曲线图，用于确定去污剂在给定缓冲液中的临界胶束浓度。

图4说明用本发明方法在微流体装置中进行的蛋白质分离的层析图。该层析图显示的是模拟凝胶(emulated gel)，显示了12个单独的分离，各自作为模拟凝胶的单独。

图5标准蛋白质分子量的对数与迁移时间的曲线图，分离如图4所示。

图6是分子量标准的层析图，显示了去污剂-染料前锋。

图7是根据本文所述方法进行分离后处理的微流体装置的示意图。

图8(A-D)显示了分离数据曲线图，说明分离后稀释的作用。

图9根据本发明表征多肽的系统的示意图。

图10是根据本文所述方法进行分离后处理的连接于外部毛细管的微流体装置的示意图。

图11A和11B是根据本发明进行蛋白质分析的微流体装置的交叉点中流动模式的示意图。

图12A、12B和12C分别是蛋白质梯的连续分析中产生的数据、用第一种方法校正的相同数据、用第二种方法校正的相同数据的示意图。

                              发明详述

I.方法、装置和试剂

A.概要

本发明提供了用于表征多肽、蛋白质及其片段(本文中总称为“多肽”)的方法、装置、系统和试剂盒。本发明的方法、装置、系统和试剂盒尤其用于通过包含在毛细管通道中的聚合物分离基质多肽的电泳迁移(通常也称为“毛细管电泳”)的分子量表征多肽。

如前所述，设法用毛细管电泳法分离蛋白质和多肽。因为毛细管电泳采用封闭系统如毛细管，所以一般在分离之前进行蛋白质的标记。这通常取标记基团共价连接于待分离混合物中的所有蛋白质的形式。一旦分离，就可检测各蛋白质上的标记。共价标记技术常常包括复杂的化学过程，至少也需要在分离蛋白质之前的附加步骤。此外，标记通常是相对大的结构，这可能负面影响蛋白质分子量的测定。虽然有人尝试用非共价结合的染料，但这些尝试的结果通常低于可接受限度。

然而，根据本发明的至少一个方面，提供了用毛细管电泳法表征和/或分离蛋白质的方法，它是快速、可重现的，在进行分离之前不包括复杂的样品制备步骤。具体说，本发明方法提供了包括装入其中的分离缓冲液的第一毛细管通道，所述分离缓冲液包括聚合物基质、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。根据本发明的优选方面，去污剂和缓冲剂存在于分离缓冲液中，浓度等于或低于临界胶束浓度(“CMC”)。通过将去污剂和缓冲液浓度维持在等于或低于CMC，可最大程度降低负面作用，如染料结合去污剂胶束。如果不受限于操作的具体理论，相信染料在前述系统的毛细管系统中结合于去污剂胶束产生大量背景信号，并在分离期间产生信号不规则，如信号基线中的凸起和凹陷。另一方面，本发明方法仔细控制该系统的各个组件，以避免或至少最大程度减少这些负面作用。在尤其优选的方面，至少在操作的分离组分待检测的点上以等于或低于CMC的水平提供缓冲液和去污剂，从而避免产生较高背景信号的染料结合于胶束。这可以是以低于CMC，如缓冲液和去污剂浓度的水平维持和/或运行的总系统的结果，或者可以是原位处理样品、缓冲液、去污剂液体如稀释剂、试剂加入或其它溶液修饰的结果，这将该系统检测部分中的分离缓冲液减少到低于CMC的水平。

在实践中，一般会预处理待分析和或表征的蛋白质或多肽样品，以使蛋白质变性并用去污剂给蛋白质提供足够的包被，以及给样品中的包被蛋白质提供足够标记。

然后，将待表征的蛋白质或多肽(或待分离的多肽混合物)引入毛细管通道中，一般在通道段的一端。通过跨毛细管通道长施加电场，不同大小的多肽将以不同速率迁移通过聚合物溶液。包被在去污剂中的多肽具有大量电荷与其相连，它将在一个方向上迁移通过毛细管通道。然而，不同分子量的多肽将以不同速率迁移通过聚合物溶液，并被分离出来。在通过通道中的分离缓冲液时，多肽会吸收存在于分离缓冲液中的亲脂性染料，以及携带在样品预处理、稀释等期间任选地包括在样品中的任何结合染料。

在分离过程中，一旦互相分离，可在引入点的毛细管通道下游的点上借助于染料检测此点上具有一定水平的结合性亲脂性染料与其结合的多肽。

B.样品预处理

如上所述，在表征之前，一般用合适的含有去污剂的缓冲液预处理含有蛋白质或多肽的样品。在尤其优选的方面，在含有作为分离缓冲液的相同缓冲剂和用于分离缓冲液的相同去污剂的缓冲液中预处理多肽样品混合物，以保证蛋白质在分离之前变性。蛋白质的变性保证在分离期间是线性分子，以使蛋白质的分离图与其分子量更紧密地相关，而不管天然蛋白质是否是球形、线性、丝状，或具有一些其它构象。一般在大于样品的蛋白质浓度(w/v)，优选大于样品中蛋白质浓度的约1.4倍的浓度的去污剂存在下进行预处理，。

为了避免干扰去污剂结合染料的作用，常常需要在小于或约等于运行缓冲液中去污剂浓度，运行缓冲液的去污剂浓度的约0.05倍-3倍的去污剂浓度下进行样品预处理。

在优选的方面，SDS在预处理缓冲液中的浓度小于用于运行缓冲液的浓度。因此，一般在约0.05％-2％，优选约0.05％-1％，更优选小于约0.5％的去污剂浓度的存在下进行样品预处理。如果样品材料然后稀释在加样样品中，如以约1∶2至1∶20稀释，这导致加样样品中去污剂水平约为0.0025％至1％去污剂，优选约为0.0025％至0.5％，更优选小于约0.5％。

这些水平与在超过分离缓冲液的5-20倍的去污剂浓度中预处理样品的常规SDS-PAGE分离形成对比。具体说，一般的SDS-PAGE法的样品预处理通常在去污剂如SDS在50mM缓冲液中浓度为2％或更高(参见例如美国专利号5,616,502)的加样缓冲液中进行，而运行缓冲液仅含0.1％去污剂。然而，当与运行缓冲液相比加样缓冲液中这些相对高的去污剂水平用于本文所述的毛细管系统时，产生大得多的干扰去污剂前峰，它倾向于具有与分子量在所需范围的多肽共洗脱。例如，图6显示一组分子量标准的层析图(参见下面的实施例部分)。在所示实施例中，与去污剂前锋相连的峰约在43秒洗脱，这对应于具有分子量在60-70kD范围(蛋白质分析中的重要分子量范围)的蛋白质或多肽的洗脱时间。

通过降低样品预处理步骤中的去污剂浓度，也降低了任何干扰峰。证明这是有效的，尽管以前本领域技术人员相信样品预处理需要高水平去污剂，如2％或更高。而且，根据本文所列参数控制样品预处理和分离缓冲液的离子强度和去污剂浓度允许人们在某种程度上控制去污剂前峰的洗脱图，如使其在待表征多肽之前或之后洗脱。

也在优选的方面，用于预处理的去污剂与用于分离缓冲液的去污剂相同，如SDS。通常，预处理条件可随总分离条件，如待分离蛋白的特性，样品中的介质如缓冲液和盐浓度等而改变，如以下分离缓冲液所述。具体说，SDS和盐浓度可在本文所列参数内改变，以便优化给定的分离。

C.分离缓冲液

根据本发明，分离缓冲液用于进行本文所述方法，缓冲液包含聚合物基质、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。各种聚合物基质可用于本发明，包括交联和/或可胶凝聚合物。然而，在优选的方面，非交联聚合物溶液用作聚合物基质。以前已描述，适合用于本文所述方法的非交联聚合物溶液可用于毛细管电泳分离核酸，参见例如美国专利号5,264,101、5,552,028、5,567,292和5,948,227，各自纳入本文作为参考。这些非交联或“线性”聚合物提供了比交联或胶凝聚合物易于使用的优点。具体说，这种聚合物溶液因为其液体特性，更容易被引入毛细管通道并易于使用，而胶凝聚合物一般需要在聚合物在毛细管内时发生交联反应。

通常，最常用的非交联聚合物溶液包含聚丙烯酰胺聚合物，它优选为可以是中性、带正电或带负电的聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液。在尤其优选的方面，采用带负电的聚二甲基丙烯酰胺聚合物，如聚二甲基丙烯酰胺-共-丙烯酸(参见例如美国专利5,948,227)。令人惊讶的是，采用聚二甲基丙烯酰胺聚合物溶液不导致在毛细管系统中分离时任何蛋白质/多肽成片条带。不受限于具体操作理论，相信聚合物溶液在本文所述系统中具有双重功能。第一种功能是提供基质，相对于较小物质，它能阻碍较大物质通过它的迁移率。这些聚合物溶液的第二种功能是降低或消除物质在毛细管通道内的电渗流。相信聚合物溶液通过吸附于毛细管表面，从而阻断表征电渗流的鞘流实现此功能。

非交联聚合物一般存在于分离缓冲液中，浓度约为0.01％-30％(w/v)。当然可根据待进行的分离类型，如待表征多肽的特性和/或大小，进行分离的毛细管通道的大小等使用不同的聚合物浓度。在优选的方面，在分离大多数多肽时，存在于分离缓冲液的聚合物浓度约为0.01％-20％，更优选约为0.01％-10％。

聚合物溶液中聚合物的平均分子量可根据需要该聚合物溶液的应用稍有变化。例如，需要较高分辨率的应用可采用较高分子量的聚合物溶液，而较不严谨的应用可采用较低分子量的聚合物溶液。用于本发明的聚合物溶液一般平均分子量约为1kD-6,000kD，优选约为1kD-1000kD，更优选约为100kD-1000kD。

除了上述电荷百分数和分子量以外，也用粘度表征用于本发明的聚合物。具体说，本文所述系统的聚合物组分的溶液粘度一般为毛细管通道内使用的粘度，范围是约2-1000厘泊，优选约2-200厘泊，更优选约5-100厘泊。

除了掺入非交联聚合物溶液以外，用于实践本发明的分离缓冲液也包含缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。

如前所述，多肽的物理化学特性，尤其是荷质比一般会有很大变化，这取决于它们的氨基酸组成。同样，不同多肽通常在施加电场下具有不同的电泳迁移率。因此，电泳分离蛋白质和其它多肽一般利用运行缓冲液中的去污剂，以保证所有蛋白质/多肽在电场下在相同方向上迁移。例如，在典型的蛋白分离如SDS-PAGE中，在样品缓冲液中包括去污剂(十二烷基硫酸钠或SDS)。样品中的蛋白质/多肽被去污剂包被，使各种蛋白质/多肽带有大量负电荷。然后，带负电荷的蛋白质/多肽在电流下向阴极迁移。然而，在筛分基质的存在下，较大蛋白质比较小蛋白质移动更慢，从而使它们分离。

根据本发明的某些方面，分离缓冲液的去污剂、缓冲剂和染料组分各自选择，并以能最大程度减少它们之间的负面相互作用的浓度提供，这些相互作用可干扰蛋白质或多肽的分离和表征，如降低分离效率、信号灵敏度、异常信号的产生等。具体说，缓冲剂和去污剂一般以能优化多肽分离效率但最大程度降低背景信号和基线信号不规则的浓度提供。如前所述，观察到染料结合去污剂胶束能在毛细管分离期间产生显著水平的背景信号，以及产生各种基线不规则，如凸起和凹陷。

因此，在第一个方面，通过以去污剂在缓冲溶液中开始形成过多可结合染料的独立胶束的点以下的浓度提供缓冲剂和去污剂，完成多肽的分离和/或表征。胶束开始形成的浓度一般称为临界胶束浓度(“CMC”)。再陈述一次，CMC是可获得的最高单体去污剂浓度，因此，是可获得的最高去污剂潜力。Helenius等，Methods inEnzymol.56(63)：734-749(1979)。

去污剂溶液的CMC随非极性部分(或烃尾)的大小增加而降低，在较小的程度上，随极性基团的大小和极性降低而降低。Helenius等，同上。因此，去污剂溶液是否在其CMC以上或以下不仅由去污剂浓度决定，而且由可能对CMC有影响的该溶液其它组分的浓度，即总溶液的缓冲剂和离子强度决定。因此，在本发明的方法、系统和装置中，用去污剂浓度和缓冲剂浓度提供分离缓冲液，使分离缓冲液维持在等于或低于CMC。

许多方法可用于确定缓冲液是否低于CMC。例如，Rui等，Anal.Biochem.152：250255(1986)描述了用发荧光的N-苯基-1-萘基胺染料确定去污剂溶液的CMC。在本文所述分离缓冲液中，去污剂一般以等于或低于分离缓冲液的CMC的浓度提供。在尤其优选的方面，去污剂浓度等于或恰好低于缓冲液的CMC。可通过实验确定去污剂的最优浓度。具体说，用本文所述亲脂性染料，通过测量溶液的荧光与去污剂浓度的关系可以测量去污剂溶液中的相对胶束浓度。例如，图3说明含有10μM荧光亲脂性染料(Syto 61，Molecular Probes Inc.)的SDS溶液的荧光强度与SDS浓度的关系的曲线图。荧光强度急剧增加指出临界胶束浓度，如点A所指。因此，根据本发明，当指出去污剂浓度等于或低于CMC时，应理解去污剂浓度将落在所示曲线陡峭部分上或以下，尤其在点B所示曲线点以下，优选在点A标识的区域中或以下。

如上所述，去污剂的CMC互不相同，也随含有去污剂的缓冲液的离子强度而改变。在一般的分离操作和缓冲液中，分离缓冲液的去污剂浓度高于约0.01％(w/v)，但低于约0.5％，而缓冲剂的浓度一般约为10mM-500mM，倘若该缓冲液维持在等于或低于CMC。

掺入分离缓冲液的去污剂可选自已描述用于电泳分离的许多去污剂的任意一种。一般用阴离子去污剂。通常优选烷基硫酸盐和烷基磺酸盐去污剂，如十八烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)和癸基硫酸钠。在尤其优选的方面，去污剂包含SDS。在SDS的实施方式中，去污剂浓度通常维持在上述浓度。因此，在优选的方面，分离缓冲液中的SDS浓度一般大于0.01％，以保证足够包被样品中的蛋白质，但小于约0.5％，以防止形成过多胶束。在优选的方面，去污剂浓度约为0.02％-0.15％，优选约为0.03％-0.1％。

在采用优选去污剂浓度的缓冲液中，缓冲剂一般选自许多不同缓冲剂中的任意一种。例如，通常与SDS-PAGE应用联用的缓冲液也尤其可用于本发明，如tris、tris-甘氨酸、HEPES、CAPS、MES、曲辛(Tricine)、它们的组合等。然而，在尤其优选的方面，选择离子强度非常低的缓冲剂。使用这种缓冲液能提高去污剂浓度，而不超过CMC。这种类型的优选缓冲液包括两性离子缓冲液，如氨基酸像组氨酸和曲辛，由于两性离子特性，它们在相关pH下具有相对高的缓冲容量，但具有极低的离子强度。也优选系统中具有迁移率相对低的相对大的离子的缓冲剂，因为它们显然能够消除信号基线，如用Tris作为反荷离子。

在上述浓度的优选去污剂溶液，如SDS、十八烷基硫酸钠、癸基硫酸钠等的情况下，缓冲剂的浓度一般为约10mM-200mM，优选浓度为约10mM-100mM。在尤其优选的方面，Tris-曲辛用作缓冲剂，浓度为约20mM-100mM。

参照上述讨论，可看出大多数优选分离缓冲液包含的SDS浓度为约0.03％-0.1％，Tris-曲辛作为缓冲剂，浓度为约20mM-100mM，提供各物质使得在总系统/方法的正常操作条件下操作时缓冲液等于或低于CMC。

除了上述组件，分离缓冲液一般也包含结合染料或其它可检测标记基团，它们能与待表征/分离的蛋白质和多肽结合。这使得在蛋白质和/或多肽通过分离缓冲液时能够检测它们。本文所用“结合染料”指可检测标记化合物或部分，相对于给定混合物中的其它分子，它优选结合一类感兴趣的分子，如蛋白质或肽。在蛋白质或多肽表征的情况下，亲脂性染料尤其可用作蛋白质或多肽结合染料。

用于本发明的尤其优选的亲脂性染料的例子包括荧光染料，如部花青染料，如美国专利号5,616,502所述，将其纳入本文作为参考。尤其优选的染料包括通常购自Molecular Probes，Inc.(Eugene OR)的Sypro Red^TM、Sypro Orange^TM和Syto 61^TM染料。这种染料通常用于染色平板凝胶，可以洗去多余染料并通过洗涤消除SDS在凝胶中的任何负面作用。然而，令人惊讶的是，本发明者发现这些染料尤其可用于SDS毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)，当如本文所述配制缓冲液时，产生惊人的灵敏度，而去污剂的“成片条带”或干扰很少或没有。

而且，比染料与分离缓冲液的相容性更令人意外的是，将亲脂性染料掺入毛细管通道中的分离缓冲液中不产生会降低测定灵敏度的过量背景信号。具体说，通过提供分离缓冲液中的染料，预计从缓冲液中的染料能观察到相对高的背景信号。因此，预计需要将染料包括在样品溶液中，但不在通道中的分离缓冲液内。然而，后一种技术导致分离期间信号水平极低。通过将染料包括在毛细管通道内的分离缓冲液中，维持高信号，而维持惊人的低背景。用于本发明的亲脂性染料通常存在于分离缓冲液中，浓度约为0.1μM-1mM，更优选约为1μM-20μM。

D.分离后处理

与上述方法相反，其中在为所用染料系统优化的缓冲液和去污剂浓度下，如维持在具体去污剂的CMC以下预处理和分离样品，在某些方面，样品组分存在的缓冲液/去污剂条件在分离这些组分后和检测这些组分期间或检测这些组分之前立即改变，从而使去污剂胶束的负面作用被降低或消除。具体说，在最优分离缓冲液和去污剂条件或可以在等于、高于或低于CMC的浓度下分离样品组分如多肽。一旦分离了样品组分，就改变这些条件，使检测点的缓冲液和/或去污剂浓度为检测步骤优化，例如将这些水平降低到低于DMD的水平。具体说，常常是，一旦将去污剂水平和/或缓冲液浓度调整到CMC以下，胶束分散，染料结合于胶束的负面作用被降低或消除。

一般地，在多肽分离的情况下，通过在通过检测器之前将一种或多种稀释剂加入分离样品组分中来改变环境，以使含有样品的分离缓冲液等于或低于CMC。这任选地通过改变去污剂和缓冲剂的比例以将CMC提高到去污剂的操作浓度或以上，和/或稀释去污剂水平使其下降到CMC以下来完成。因此，可加入稀释剂以维持或降低缓冲剂浓度，而一般会降低去污剂水平，或它可维持去污剂浓度而降低缓冲剂浓度。在任一情况下，所需目的是在检测点和时间上消除去污剂胶束。以相似方式，可加入有效破坏去污剂胶束的材料，如共去污剂(co-detergent)。

当采用分离后处理时，分离缓冲液组成可跨越大范围的缓冲液和去污剂浓度。例如，分离缓冲液一般包括缓冲剂，如上所述，浓度约为10-200mM，去污剂浓度约为0.01-1.0％，一般高于CMC，如高于约0.05％，优选高于约0.1％。另一方面，优选在没有过量去污剂胶束的情况下检测亲脂性染料，过量的去污剂胶束会结合染料并产生过量背景信号。因此，一般会稀释分离缓冲液以将去污剂浓度降低到去污剂的CMC以下的水平，如小于约0.1％。因此，稀释步骤优选在检测前以约1∶2-1∶30稀释分离缓冲液。虽然这也稀释了待检测的样品组分，但稀释使背景大大降低使得能够容易地检测非常低水平的样品材料。

根据本发明的这个方面，微流体装置尤其适合于进行这些方法。具体说，包括整合流体通道网络允许将稀释剂和其它试剂容易地加入材料流中。具体说，在检测区上游提供稀释剂通道，以将稀释剂与分离样品组分一起递送到检测区中。然后在没有干扰去污剂胶束的情况下检测样品组分。图7中显示了用于完成此分离后处理的微流体装置的尤其优选的通道布置的例子，以下更详细地描述。本文所用术语“上游”和“下游”指当考虑所述系统的正常操作期间感兴趣的材料(如液体、样品组分等)的流动方向时，所述元件的相对定位。术语上游一般指朝向样品或连接于具体通道的缓冲液贮器的方向，而下游指连接于具体通道的废液贮器的方向。

E.毛细管通道和装置

1.概要

本发明也提供用于进行上述蛋白表征方法的装置和系统。本发明装置一般包括支持基材，包括其中放有分离缓冲液的分离区。待分离/表征的样品放置在分离区的一端，跨分离区施加电场，引起样品中的蛋白质/多肽电泳分离。然后，用与分离区相邻并传感通讯的检测系统单独地检测分离的蛋白质/多肽。

2.常规毛细管系统

在至少第一个方面，本发明方法可应用于常规基于毛细管的分离系统。因此，在这些方面，支持基材一般包括毛细管，如熔融二氧化硅、玻璃或聚合物毛细管，它们中安置有毛细管通道。管中至少一部分毛细管通道包含毛细管的分离区。通过例如压力泵、毛细管作用等将分离缓冲液置于毛细管通道中，将待分离/表征的样品注射入毛细管通道的一端中。然后将毛细管的一端与阴极贮器(具有与贮器接触的阴极)流体接触，另一端与阳极贮器(具有与贮器接触的阳极)流体接触，通过毛细管施加电场，使样品材料通过毛细管和所含的分离缓冲液电泳。在蛋白质和多肽通过分离缓冲液时，它们与亲脂性染料结合，这些染料随后在毛细管通道的阴极端被检测系统所检测。

在如上所述的分离后处理步骤中，一般在分离后通过使其它流径或毛细管与主要分离毛细管连通将其它缓冲溶液引入样品组分的流径，以使离开分离毛细管的分离组分与其它缓冲液或稀释剂混合。检测室或毛细管也在此连接处连接，以使所有材料流入检测区待检测。

3.微流体装置

在尤其优选的方面，本发明方法在提供安置在单个整合的固体基材中的微量毛细管通道网络的微流体装置中进行。具体说，该支持基材一般包括其中安置了一个或多个微量通道的网络的整合主体结构，至少一个通道是分离通道。分离缓冲液至少置于分离通道中。在优选的方面，微流体通道网络至少包括与至少第一样品注射通道交叉的第一分离通道。这两个通道形成的交叉称为“注射交叉”。在操作中，将样品材料注射通过注射通道并穿过分离通道。然后将交叉内的材料部分注射入分离通道，从而通过分离缓冲液分离。将检测器安置在分离通道附近，以检测分离的蛋白质。

在尤其优选的方面，用于本发明的微流体装置包括多个与样品注射通道流体相连的样品孔，样品注射通道依次与分离通道流体相连。这允许在单个整合微流体装置中分析多种不同样品。1998年10月2日提交的共有美国专利申请号09/165,704中显示并描述了用于本发明的尤其优选的微流体装置的例子，将其全文纳入本文作为参考用于所有目的。这种微流体装置的一个例子在图1中说明。如图所示，装置100包括平面主体结构102，102内部安置有多个互相连接的通道，如通道104-138。许多贮器140-170也安置在主体结构202中，并与各种通道104-138流体相连。待分析样品和缓冲液放在这些贮器中，以引入该装置的通道中。

在操作中，首先将用于分离/表征的分离缓冲液置入一个贮器，如贮器166中，允许经毛细作用进入该装置的所有通道，从而用分离缓冲液充满这些通道。将待分离/表征的样品单独置入贮器140-162中。然后将分离缓冲液置入贮器164、168和170中，并且分离缓冲液已经存在于贮器166。通过施加合适的电流，第一种样品材料从其贮器如贮器140通过通道120和116运输或电泳到并通过主要注射交叉172到达通道104。这一般通过在贮器140和168之间施加电流完成。一般将低水平的收缩电流施加在交叉点，以防止样品材料在交叉点扩散，如通过从贮器166和170向贮器168提供低水平电流(参见例如WO 96/04547)。一段短时间之后，通过在贮器170和166之间施加电流交换电流，以使交叉点中的材料电泳到主要分析通道104。一般在注射后施加微小电流，以将通道116和134中的材料从交叉点中拉回来，避免漏入分离通道。虽然第一种样品电泳到主要通道104，但待分析的下一个样品通过从其贮器如贮器142通过预加载交叉点174向预加载贮器164电泳样品材料而预加载。这使得样品材料从其预加载位置移动到注射交叉点172仅花费非常短的过渡时间。一旦第一个样品的分析完成，第二个样品材料电泳通过注射交叉点172，注射入主要分析通道，如前所述。重复此过程，使各样品都加载到装置中。

一般沿主要分析通道104提供检测区176，以提供可从通道中检测到信号的点。本文所述装置一般由透明材料制造。因此，光学检测分析的检测窗基本上可位于沿分析通道104长的任何点。当分离样品通过检测窗时，检测与多肽片段结合的亲脂性染料。然后，各多肽片段通过分离通道的所需时间允许表征具体多肽，如作为其分子量的度量。具体说，比较未知多肽的保留时间与已知分子量标准的保留时间，从而可以通过例如从标准品内插或外插确定未知多肽的大概分子量。

如前所述，本文所述分离后处理方法在用微流体通道系统中尤其有利。具体说，稀释剂来源与主要分离通道的偶联能简单地提供在合适位置如落在分离发生之后但在检测区或检测窗之前的点上连接于该通道的通道。用于完成此功能的微流体通道网络的例子见图7。如图所示，微流体装置700包括主体702，702包括安置在其内部的通道网络。图7所示装置一般以上述参照图1的相同方式制造。通道网络包括主要通道704，704分别通过样品通道706a-722a和728a与多个不同样品材料贮器706-722和728流体相连。也显示了预加载/废液贮器通道/贮器724/724a和726/726a。主要通道704连接于缓冲液贮器736和废液贮器732，并包括检测区738。如图所示，提供了与主要通道704相连、在主要通道704的对侧、在检测区上游(在材料操作流动的方向上)和主要通道704的主要部分下游的点上的两个稀释剂通道730a和734a，在那里出现该通道的功能如分离。稀释剂通道730a和734a也分别与稀释剂来源如贮器730和734相连，以致能够从这些来源将稀释剂递送到主要通道704中。

在多肽分离操作中，当希望表征样品如含有多肽混合物的样品时，用分离缓冲液填充装置700的通道。在分离后处理的情况下，此缓冲液不需要粘附于上述结构，因为大大消除了对胶束形成过多的担心。在这些情况下，去污剂浓度一般不如预处理方法重要。具体说，分离缓冲液可含有较高浓度的去污剂，例如约0.1％-2.0％。去污剂浓度一般会超过0.1％。一般通过将分离缓冲液沉积在一个孔，如废液贮器732中进行通道网络填充。然后，分离缓冲液经毛细作用贯穿通道网络，直到它到达各个其它贮器706-730和734-736。任选地，向废液贮器732施加轻微压力，以加速填充通道网络。将额外量的缓冲液如分离缓冲液置入缓冲液贮器736和加样/废液贮器724和726。将稀释剂材料置入稀释剂贮器730和734。

将样品材料置入样品贮器706-722和728中的一个或多个。任选地，将许多不同样品材料置入不同贮器。然后将该装置置入控制器/检测器设备，如来自AgilentTechnologies的2100生物分析仪，它通过(例如)控制的动电学方法引导样品材料通过该装置的通道移动，如美国专利号5,976,336所述，全文纳入本文作为参考用于所有目的。置入(例如)贮器706的样品沿样品通道706a移动，直到它穿过通道704，通过通道726a流向加样废液贮器726。然后，将加样通道706a和主要通道704的样品交叉点上的样品材料部分注射入分离通道704，通过其移动。在施加的电场下，通过分离缓冲液移动的样品部分随着沿通道704移动分离成其组成部分。在移动时，样品组分和(在一些情况下)去污剂胶束吸收存在于分离缓冲液中的亲脂性染料。将含有较低浓度去污剂或不含去污剂的稀释剂缓冲剂以连续方式通过通道730a和734a引入通道704。此稀释剂将分离缓冲液稀释到低于去污剂CMC的点，导致清除了过多去污剂胶束。然后在检测窗738检测携带亲脂性染料的稀释的样品组分。在一些情况下，通过侧通道实际引入流体完成流体稀释。然而，在优选的方面，侧通道730a和734a一般含有在整个通道网络中存在的相同分离基质。因此，通过电泳将离子物质从缓冲溶液电泳引入分离通道进行稀释，以有效稀释分离通道中的物质。在另一方面，提供的侧通道730a和734a不含任何基质，例如，它们可支持基于压力或电渗的流，将大量流体引入主要通道704，以稀释分离的样品组分。如上所述，选择将稀释剂加入通道的速率，以在具体条件下将检测点通道中的去污剂浓度降低到低于约去污剂CMC的水平。这一般包括约1∶2-1∶30稀释的去污剂。因此，在分离缓冲液包括，如在30mM Tris曲辛缓冲液中2％SDS的情况下，通常需要将去污剂水平稀释到低于约0.1％，优选稀释到约0.05％SDS。因此，稀释度约为2-3倍至约4倍。当然，如前所述，具体去污剂的CMC可随缓冲液的特性和浓度而改变。

虽然主要根据将多肽分离缓冲液稀释到低于该缓冲液中去污剂CMC的点来描述，但应理解，本文所述的分离后处理方法可以更广泛地应用。具体说，这种方法可用于分析方法步骤链中的后续操作需要不同于之前步骤或操作的环境的各种分析操作，可通过加入试剂、缓冲液或稀释剂充分地改变环境，用于所述后续操作。上述方法说明了为分离多肽优化的环境可能不与最优的检测环境最适相容的例子。因此，根据对本发明此方面的最广泛的理解，术语“稀释剂”指能改变引入它的环境的加入组分，如流体、缓冲剂等。在这个意义上，环境改变不仅包括改变环境的物理性质，如存在去污剂胶束、降低溶液粘度，还包括改变化学环境，如滴定一种缓冲液以改变溶液的pH，如产生pH敏感型染料或其它标记物质的可操作环境，改变溶液的盐浓度以改变疏水性/亲水性或改变溶液中离子的相互作用。

类似地，可在起始操作后加入标记物质，这种标记物质可能影响之前的操作。这种标记的一个例子包括例如：加入特定蛋白的标记抗体，从而使系统能起基于芯片的Western印迹系统的作用。具体说，蛋白质分离后，将标记抗体加入分离的蛋白质后，立即检测，抗体优选结合携带识别表位的蛋白质。然后通过其大小和被选择的抗体识别的能力检测蛋白质。

F.总系统

本发明装置和试剂一般与控制和监测在本文所述微流体装置中进行并利用本文所述试剂的操作和分析的总分析系统联用。具体说，除了微流体装置或毛细管系统之外，总系统一般包括操作性偶联于微流体装置或毛细管元件的电子控制器和该装置的分离区或通道传感通讯中的检测器。

本发明系统的例子见图2。如图所示，系统200包括微流体装置100，它包括安置在其内部的通道网络，其中通道网络连接多个贮器或样品/试剂孔。电子控制器202通过安置接触微流体装置100的贮器中的流体的多个电极204-234操作性偶联于微流体装置100。电子控制器202穿过该装置的分离通道长施加合适电场以驱动样品材料的电泳，随之发生本发明蛋白质和多肽的分离。在包括交叉通道网络的微流体装置(如图所示)的情况下，电子控制器也施加电流，以移动不同材料通过各种通道并将这些材料注射入其它通道。使通过装置通道的电流水平可选择以控制材料移动的电子控制器尤其优选用于本发明。这种“电流控制器”的例子详见美国专利号5,800,690所述，纳入本文作为参考。

总系统200也包括与微流体装置100中的通道网络的分离通道部分传感通讯的检测器204。本文所用术语“传感通讯”指位于能接受微流体装置内通道的具体信号的检测器。例如，在用于进行产生光信号如发色团、荧光或化学发光信号的操作的微流体装置的情况下，将检测器置于装置的半透明部分相邻处，以使检测器中的光学元件从该微流体装置的合适部分接受这些光信号。另一方面，为了传感相连，电化学检测器一般包括电化学传感器，如电极，它安置在该装置的合适通道中，以致能够感受产生或存在于该通道内的电化学信号。类似地，用于感受温度的检测器将与该装置的通道热通讯，以便感受其中的温度或相对改变。在优选的方面，将光学探测器用于本发明系统，更优选地，配置光学探测器用于检测荧光信号。因此，这些检测器一般包括在分离通道引导活化光的光具组，以及用于收集、传送和定量从分离通道发射的荧光量的光具组和光传感器。通常，将单个光具组用于传送激活光和荧光发射，根据这两种波长的能量差异来区分它们。通常，掺入到本发明光学探测器中的光学传感器选自本领域熟知的光学传感器，如光电倍增管(PMT)光电二极管等。在尤其优选的方面，将Agilent 2100生物分析仪用作控制器/检测器系统(Agilent Technologies)。

本文所述的系统一般也包括处理器或计算机206，它操作性偶联于电子控制器，用于根据用户指令或预编程序的操作参数指导电子控制器的操作。该计算机一般也操作性偶联于检测器，以接受和分析检测器从微流体装置接受到的数据。因此，该计算机一般包括指导电子控制器操作通过施加电场将多个样品各自注射入分离通道的合适程序。该计算机一般也操作性偶联于检测器，以接受来自检测器的数据并记录检测器接受的信号。处理器或计算机206可以是各种不同类型处理器的任意一种。计算机/处理器一般是装有来自(例如)Intel或Advanced Microdevices的微处理器如Pentium^TM或K6^TM的IBM PC或PC兼容计算机，或MacIntosh^TM、Imac^TM或兼容计算机。

在本发明的多肽表征方法中，一般对计算机或处理器编程使其接受检测器的信号数据并鉴定对应于通过检测器的分离蛋白质的信号峰。一种或多种内标蛋白质一般可与样品材料一起运行。在这种情况下，一般对计算机编程使其通过(例如)在总分离中的位置(第一个或最后一个)鉴定标准品，并通过从标准品外插或内插测定样品中未知多肽的分子量。1997年12月30日提交的临时专利申请号60/068,980(纳入本文作为参考)中描述了用于本发明的具体有用的计算机软件程序，与分离方法一起使用。在Agilent 2100生物分析仪上运行的实施方式中，计算机一般包括软件程序与用于运行这些系统以分析核酸提供的类似。

G.试剂盒

本发明也提供了用于进行所述方法的试剂盒。通常，这种试剂盒包括本文所述的毛细管或微流体装置。该试剂盒一般也包括分离缓冲液的各种组分，如非交联聚合物筛分基质、去污剂、缓冲剂和亲脂性染料。在试剂盒中这些组分可以单独体积的预配制缓冲液组分存在，它们可以或不可以被预先测定，或者可以合并的预配制试剂的体积并包括所有试剂的单一组合提供，从而使用户可简单地将分离缓冲液直接置入微流体装置中。除了缓冲液组分之外，本发明试剂盒也任选地包括其它有用试剂，如分子量标准，以及用于装置和系统如辅助将缓冲液、样品或其它试剂引入微流体装置通道的设备的工具。

在试剂盒形式中，一般在一个包装单位如盒或袋中提供试剂、装置和详述其用法的说明书，并一起出售。将试剂和装置作为试剂盒提供能给用户提供即用型、较便宜的系统，其中以更方便的体积提供试剂，并且根据所需应用如分离高分子量与低分子量蛋白来最优地配制试剂。

H.自动化的蛋白质分析

在前述图1和7的微流体装置中，表征的蛋白质样品需要放在微流体装置上的贮器中。本发明范围也包括能够从微流体装置外的来源获得蛋白质样品的微流体装置。这可通过将装置内的进样移液器或通道网络的毛细管延伸入外部样品来源如多孔板中的孔来完成。外部来源中的样品可通过压力或动电力被拉入或“吸入”毛细管。多孔板是标准形式如96、384或1536孔形式，与各种市售流体处理设备相容。

图9示意性地说明系统900，它包括包含吸器903、通道网络905和多个贮器906的微流体装置902。吸器903连接于装置902，以使毛细管中的通道(未显示)与通道网络905流体相连。提供包括多个用作外部样品来源的孔的多孔板908，以致可达到毛细管元件903。此多孔板908可以是孔中放有蛋白质样品的标准形式的板。在许多实施方式中，可能需要用含有标准品的第二块多孔板913。例如，多孔板913中的孔可包含含有已知大小多肽的蛋白质梯。一般地，装置902和多孔板908、913中一个或全部偶联于使一个或所有这些组分相对移动的x-y-z翻译平台909。x-y-z翻译平台909一般是用(例如)机器人定位系统(未显示)自动控制的。这种机器人x-y-z翻译系统可购得。

图9中系统的其它组件，如控制器917、计算机918和检测器919类似于图2所示的系统组件。控制器917控制微流体装置902中的流体移动。在图9的实施方式中，控制器通过压力管腔923向微流体装置902上的贮器施加负压。施加负压从多孔板908中的样品来源之一通过毛细管903吸出流体并进入通道网络905。在各种实施方式中，控制器可指导施加其它正压或负压，或电场，或压力和电场的组合，以实现流体通过通道网络905移动。本发明系统一般也包括与控制器917和检测器919有接口的处理器或计算机918。在图9的实施方式中，该计算机也指导x-y-z翻译平台909。最后，也提供与通道网络905中的一条或多条通道传感通讯的检测器919。用计算机或处理器918收集、储存和/或分析来自检测器919的数据。

图10显示可用于图9的实施方式的微流体装置902的例子。除了从外部来源引入蛋白质样品所必需的额外处理步骤外，在图10的微流体装置中进行蛋白质分析与在图7的微流体装置中进行的分析几乎完全相同。从外部来源通过毛细管吸入的蛋白质样品在交叉点940进入微流体装置902的通道网络。在图10的实施方式中，通过施加于贮器915施加减压(即低于大气压)将外部来源的液体吸入吸器。贮器910仍对大气开放，以使施加于贮器915的减压也诱使流体从贮器910流入通道912。贮器910中的流体在吸器/通道交叉点940进入微流体装置时与样品混合。贮器910中的流体可包含稀释剂如水，因此样品浓度可调整。贮器910中的流体也可包含组分如多肽标准(即标记)，或试剂如盐或缓冲剂。来自贮器910的样品和流体的混合物然后通过交叉点942和通道914和916流向废液贮器915。通过在贮器925和920之间施加电场，可再定向流过通道914的至少一部分混合物，使其流过注射交叉点944。设定电场的大小和方向，以产生指导混合物通过交叉点944进入通道921向贮器920流动的动电流。

分析中的下一步是将流过交叉点944的来自贮器910的样品和流体混合物注射到分离通道904中，在那里样品中的多肽以大小分离。本发明的各种实施方式可采用不同的注射方法。例如，如图1和7的实施方式所述，可在注射交叉点944上施加收缩电流，以使含有蛋白质样品的混合物在进行样品注射前不扩散到分离通道904中。收缩流和注射收缩流的方法公开于之前引用的WO 96/04547。为说明收缩流怎样用于图10的微流体装置，图11A显示了图10中微流体装置902的交叉点944的扩展图。从通道914通过交叉点944流入通道921的含有样品的混合物(阴影部分)受从分离通道904的两侧进入交叉点904的收缩流的限制(箭头代表)。这两个收缩流可包含分离缓冲液。为将混合物注射入分离通道904，跨分离通道904施加电场，以使注射交叉点944中的混合物流入分离通道904，向废液贮器965流动。在注射期间，可对贮器920和925施加电压，将通道914和921中的材料拉出注射交叉点944，以防止这些通道中的流体泄漏到分离通道904中。在混合物通过分离通道904中的分离缓冲液时，混合物中样品多肽用电泳方法分离。

仅当样品中蛋白质浓度相对高时可使用采用收缩注射方案的实施方式。有替代注射方案，它可通过增加进行电泳分离的样品中蛋白质的量提高分析的灵敏度。可通过将大量含有样品的混合物注射入分离通道904来提高样品中蛋白质的量。图11B说明这种注射方案如何用于图10的微流体装置902。当含有蛋白质样品的混合物从通道914通过交叉点944流入通道921时，调整跨分离通道904长的电场，以使在进行注射前通过注射交叉点944的混合物部分在分离通道904中累积。

累积可由混合物扩散和/或流入分离通道904完成。在许多实施方式中，当没有跨分离通道904长施加电压时，流过交叉点944的混合物部分将在分离通道904中累积。换句话说，在一些实施方式中，如果在含有样品的混合物从通道914穿过交叉点944流入通道921时贮器960和965中的电极允许漂移，在注射前含有样品的混合物将在分离通道904中累积。然而，在许多实施方式中，可能需要调节施加于贮器960和965中的电极的电压，以使样品在注射前流入分离通道904。在图11B的实施方式中，例如，向贮器960和965施加电压，使含有样品的混合物流入分离通道904。箭头指出流入分离通道904的方向，而阴影示意性地说明混合物如何分布在分离通道904中。如本领域技术人员所认识到的那样，可通过改变流入分离通道的数量和持续时间来控制在分离通道中累积的含有样品的混合物的量。一旦在分离通道904中累积了所需量的含有样品的混合物，就跨分离通道904施加电场，以使分离通道904中的混合物流向废液贮器965。正如采用收缩注射的实施方式那样，可在注射期间或之后从注射交叉点944拉出通道914和921中的材料。

如所有上述实施方式所述，电泳分离注射入分离通道904的含有样品的混合物中的多肽。通过跨浸入缓冲液贮器960和废液贮器965的电极施加电压建立跨分离通道904的电场进行分离。缓冲液贮器960含有分离缓冲液；如上述实施方式所述，分离缓冲液一般包含聚合物、缓冲剂、去污剂和亲脂性染料。电场使得来自样品的多肽随着它们电泳通过分离通道904中的聚合物根据大小分离。配置图10中的装置902以进行上述分离后处理方法。换句话说，如图7的实施方式，配置图10的实施方式以在分离缓冲液到达检测区970之前将含有样品组分的分离缓冲液稀释至低于CMC。通过使稀释剂从稀释剂贮器930和934通过稀释剂通道930a和934a流入分离通道904来进行稀释。稀释剂一般包含分离缓冲液的聚合物和缓冲液组分。在检测区970用之前所述的方法检测由各种电泳分离的多肽产生的荧光峰。

从外部来源获得样品的能力使微流体装置，如图10中的装置能够作为自动化过程的一部分分析大量蛋白质样品。可用的市售系统允许装有吸器的微流体装置从多孔板自动获得样品。此系统(AMS 90 SE电泳系统)由Mountain View California的Caliper Life Sciences，Inc.制造并销售。然而，当微流体装置用于加工大量蛋白质样品时，处理几个样品后芯片的性能可下降或偏移。例如，如果在这两个分析之间在同一装置上分析了十二个以上的其它样品，那么在相同蛋白样品的两次分析中洗脱时间和/或荧光峰的面积(如图8D中的峰)可能不同。这种洗脱时间中的变化抑制该分析鉴定多肽的能力，而峰面积中的变化抑制分析提供定量测定蛋白质浓度的能力。当加工大量样品时产生的另一问题是样品的预处理条件的一致性。换句话说，在微流体装置上进行的蛋白质分析需要有足够包容性，以致于微流体装置能够用各种不同的盐、缓冲液和去污剂浓度加工蛋白质样品。

与图7的实施方式联用的相同试剂可用于加工大量图9和10实施方式中的蛋白质样品。具体说，分离缓冲液可含有10mM-200mM浓度的缓冲剂，0.01％-1％浓度的去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，和浓度为0.1μM-1mM的染料。为了使去污剂浓度低于CMC，对于SDS而言约为0.1％，以约1∶2-1∶30稀释分离缓冲液。然而，在试剂组成的这些范围中，有亚范围能提供更适合于加工大量样品的更稳定和更有包容性的蛋白质分析。例如，如果分离缓冲液中的去污剂浓度为0.05％-0.4％，优选为0.1％-0.3％，最优选为0.15％-0.25％，可提高本发明蛋白质分析的稳定性。改进方法的稀释比为1∶2-1∶10，优选1∶3-1∶8，更优选1∶4-1∶7。

蛋白质分析的包容性，即该分析用不同的盐和去污剂浓度定量测定样品的能力，可通过增加注射入分离通道的含有样品的混合物中的盐浓度得以提高。在上述本发明实施方式中，由于在预处理期间使用缓冲剂如Tris-曲辛，样品一般具有非零的盐浓度。在那些实施方式中，注射入分离通道(例如图7中的704)的含有样品的混合物中的缓冲液浓度一般在上面引用的分离缓冲液的缓冲液浓度范围内。对于许多缓冲液而言，有效离子浓度可低于缓冲液浓度。例如，包含由120mM曲辛和40mM Tris配制的Tris-曲辛缓冲液的缓冲溶液的有效离子浓度会超过5mM。将含有样品的混合物的离子浓度提高到这个水平以上能提高蛋白质分析的稳定性。然而，提高含有样品的混合物中的离子浓度也倾向于降低分析的灵敏度。换句话说，提高离子浓度倾向于增加检测低浓度样品组分的难度。因此，对离子浓度应该增加到多高有限度。例如，含有样品的混合物的离子浓度可增加到10mM-1M，优选50mM-500mM，更优选100mM-500mM。可通过在预处理期间将盐如NaCl、TrisCl或磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入样品，或通过在注射入分离通道之前将含有一种或多种盐的溶液与样品混合将离子浓度带入这些范围。在图10的实施方式中，可通过在预处理期间将盐加入样品，或通过将盐加入与在交叉点940进入微流体装置902的样品混合的贮器910中的溶液来提高含有样品的混合物中的盐浓度。在一些实施方式中，可优选采用多组分盐如PBS。例如，在用上述为加工大量样品优化的亚范围试剂浓度进行的蛋白质分析中，可通过将PBS加入样品使浓度范围是0.1×-10×、优选0.05×-5×、更优选0.05×-2×来进一步提高该分析的包容性。这种蛋白质分析应该能够容纳盐浓度为0M-1M和去污剂浓度为1％-2％的蛋白质样品，灵敏度与标准SDS-PAGE分析的灵敏度相当或更好。

虽然修改分离缓冲液和含有样品的混合物的配方可提高本发明蛋白质分析的稳定性和包容性，但合适地使用校正标准可进一步改进该分析。在本发明实施方式中使用校正标准的一个简单方法是在分析由未知大小的多肽组成的蛋白质样品前分析包含含有多个已知分子量的多肽的蛋白质梯的蛋白质样品。通过比较未知大小多肽的洗脱时间与梯中分子量标准的洗脱时间估计未知大小的多肽的分子量。通过获得分子量标准蛋白质梯的分子量和洗脱时间之间经验式的数学相关性进行这种比较一般是有利的，然后用该相关性根据洗脱时间估算分子量。

然而，仅用一个标准蛋白质梯不能补偿过程中可能在测量大量样品过程中发生的漂变。换句话说，定期再校正该过程结果以补偿过程漂变是有利的。定期再校正可包括，在一系列蛋白质样品的分析中散布地重复分析一种包含已知分子量多肽的蛋白质梯。例如，在图9的系统中，定期再校正可通过将相同的标准蛋白质梯放置在多孔板913的8孔中完成，并在多孔板908中8排(每排12个样品)各自测量之前和/或之后测量那些标准梯。当在一排中12个样品之前或之后测量相同标准梯时，梯中多肽的洗脱时间改变是过程漂变的征兆。可用数学表达校正此过程漂变。在一个实施方式中，可通过获得在样品测量之前和之后的两个标准梯的洗脱时间/分子量相关性对蛋白质样品的分析进行校正。可通过比较这两个标准梯的洗脱时间曲线获得过程漂变的数学表达。例如，各标准梯的洗脱时间的加权平均值/分子量相关性可用于确定用于具体蛋白质样品的洗脱时间/分子量相关性。例如，在图9的实施方式中，如果在各排(含12个样品)之前和之后测量标准梯，那么第二个梯的分析大概是第一个梯分析后进行的第十三个分析。因此，施加于多孔板排中第一个样品的相关性可以是第一个梯和第二个梯的相关性的加权平均值，其中第一个梯的相关性由因数12/13加权，而第二个梯的相关性由因数1/13加权。在该排第二个样品的分析中，第一个梯和第二个梯的加权因数可以分别是11/13和2/13。虽然这说明加权方案本质上是线性的，并仅基于两个标准梯测量结果，但任何线性或非线性函数可用于测定来自两种或多种标准蛋白质梯的分析的洗脱时间/分子量数据如何用于获得在这些梯之间分析的蛋白质样品的洗脱时间/分子量相关性。

可通过将一个或多个标记置于各蛋白质样品中进一步补偿过程漂变。这些标记是已知分子量的多肽，提供了已知分子量的参比峰。实际上，标记的分子量需要在样品中多肽分子量的范围以外，以便可鉴定标记，并且使标记产生的峰不与任何样品峰重叠。常常难以发现分子量高于样品中所有可能感兴趣的多肽的标记。

因此，常常需要仅用一个分子量低于所有感兴趣多肽的标记。在一些实施方式中，未结合染料产生的荧光峰可用作一个较小标记。例如，Alexa Fluor染料(购自Eugene OR的Molecular Probes，Inc.)产生的峰在对应于低于大部分分析感兴趣分子范围的分子量的时间洗脱。如果将Alexa Fluor标记加入一系列待分析蛋白质样品的各样品中，那么Alexa Fluor峰可提供样品组分的洗脱时间可比较的标准。在一些实施方式中，在注射入分离通道的含有样品的混合物中，Alexa Fluor染料的浓度为0.1μM-10μM，优选0.1μM-5μM，更优选0.1μM-10μM。

图12A-12C说明如何用标准蛋白质梯定期再校正与较小标记联合使用校正过程漂变。图12A代表来自14个蛋白质样品的分析的原始数据。条带的各列代表分析的多肽峰，其中峰洗脱时间从底部增加到顶部。分析的顺序是从左到右。换句话说，来自第一个分析的数据在最左侧一列中，而第十四个和最后一个分析的数据在最右侧一列中。第一个和第十四个分析在相同的蛋白质梯上进行，这由位于框中的数据说明。在标准梯之间分析的十二个样品包含梯中的各种多肽亚组。在每组分析的数据中，最下方(即第一个洗脱)峰对应于放入各样品中的Alexa标记。图12A显示，在这十四个测量过程中，峰的洗脱时间发生漂移。图12B显示，用较小标记洗脱时间校正图12A中数据的效果。对于图12B的第2个至第14个样品，各峰的洗脱时间乘以Alexa峰在该样品中的洗脱时间与Alexa峰在第一个样品中的洗脱时间的比率。

通过将各峰洗脱时间乘以此比率产生的校正洗脱时间引起第二个至第十四个样品各自的Alexa峰具有与第一个样品中Alexa峰相同的洗脱时间。因此，图12B中各样品的底部峰具有相同的校正洗脱时间。其它多肽的峰仍反映过程漂移的组分，似乎是洗脱时间的函数。为校正此漂移，通过比较图12B中两个梯测量结果(第一个和第十四个分析)的对应峰的洗脱时间，产生过程漂移与洗脱时间的关系的线性函数。此线性函数应用于图12B的结果产生图12C的双校正数据。因此，在各样品中使用一个标记，再结合用标准梯定期再校正，可用于减轻过程漂移的影响。

标准和标记也可用于提高定量估算蛋白质浓度的精确性。在本发明分析中，对应于某分子量多肽的荧光峰的面积常常可与该多肽的浓度相关联。当相同浓度的Alexa Fluor染料引入在微流体装置上进行的一系列蛋白质分析时，Alexa Fluor峰面积改变说明在蛋白质分析中发生过程漂移。为补偿该漂移，可标准化各分析的峰面积，以使各分析中的Alexa Fluor峰基本相同。此标准化步骤能够提高一系列蛋白质分析产生的定量结果的一致性。在其它实施方式中，含有已知分子量和已知浓度的多肽的蛋白质梯产生的峰面积可用于监测过程漂移。通过检测不同分子量多肽的峰面积，可补偿作为分子量或洗脱时间的函数的峰面积的任何改变。类似于校正过程漂移对洗脱时间的影响的数学方法也可用于校正过程漂移对峰面积的影响。

参照以下实施例进一步说明本发明，这些实施例证明了本发明的某些方面，但不限制本发明范围。

                           实施例

在具有单分离通道和图1所示通道结构的12个样品的微流体装置中进行所有实验。用具有位于单分离通道的单点激光荧光检测器的多通道、12个电极的电子控制器/检测器进行控制和检测。

实施例1：用SubCMC分离缓冲液分离多肽

由计算机(装有Intel Pentium微处理器的PC)记录从分离通道接受的荧光数据。数据显示为荧光与时间的线性图以及用Caliper Technologies Corp.专有软件产生的模拟凝胶形式。

通过将曲辛溶解于去离子水，使浓度为0.5M，然后用1M Tris调整pH至7.5制备0.5M Tris-曲辛缓冲液溶液。然后通过0.22μm注射器滤器过滤得到的缓冲液。制备筛分或分离缓冲液，其中在含有0.9％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的12.5mMTris-曲辛缓冲液中溶解有3％聚二甲基丙烯酰胺-共-丙烯酸，和10μM Syto 60染料(Molecular Probes，Eugene OR)。然后，通过Costar Spin-X^TM 0.22μm纤维素醋酸酯离心滤器过滤分离缓冲液。

在置入装置的贮器中之前，在变性缓冲液中预处理样品。变性缓冲液是0.75％SDS(w/v)和1％2-巯基乙醇(v/v)(BME)的250mM Tris-曲辛缓冲液。在0.5ml微量离心管中以1∶1混合样品与变性缓冲液(如20μl样品和20μl缓冲液)，加热到100℃10分钟。然后离心并涡旋加热的样品。在将样品上样于微流体装置的孔中之前，用去离子水1∶10稀释(如1μl样品/缓冲液和9μl水)。因此，制备的样品的去污剂浓度为0.0375％SDS。

为制备微流体装置，将7.5μl分离缓冲液吸入干净、干燥装置的孔166中，用注射器加压，迫使分离缓冲液进入该装置的所有通道中。然后将7.5μl分离缓冲液吸入各孔164、168和170中。然后将0.5μl稀释样品单独吸入各孔140-162中。在图4所示实施例中，使用已知分子量的标准品。标准品包括卵清蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5kD)和α-乳清蛋白(14.4kD)。

参照图1，孔142和146仅含有缓冲液，用作空白。将四种蛋白标准各含100μg/ml的标准蛋白质溶液加入各孔150和154中，而将含500μg/ml的同样四种蛋白的溶液加入孔158和162中。将仅含有1000μg/ml碳酸酐酶的溶液加入孔140和144中。将含有100μg/ml碳酸酐酶和胰蛋白酶抑制剂的溶液加入孔148和152中，而将含有相同蛋白质，但浓度为500μg/ml的溶液加入孔156和160中。

将各样品单独注射入主要分离通道104，检测分离的组分与注射后保留时间的关系。以黑条带的形式显示各样品的层析图，以模拟标准考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。模拟凝胶的各道代表一个分离样品的层析图，黑条带说明荧光增加超过背景。具体说，制备卵清蛋白(45kD)、牛碳酸酐酶(29kD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5kD)和α-乳清蛋白(14.4kD)的混合物。两种浓度不同的四种蛋白的混合物以100μg/ml(A2道，孔154)和500μg/ml(A3道，孔162)展开。也制备和展开这些标准品各自的分离混合物，如下所述：

B1道(孔144)：碳酸酐酶(1mg/ml)

B2道(孔152)：胰蛋白酶抑制剂和碳酸酐酶(都是100μg/ml)

B3道(孔160)：与B2道相同(都是500μg/ml)

C2道(孔142)：与A2道相同

C3道(孔150)：与A3道相同

D1-D3道(孔140-156)：与B1-B3道相同

图5显示了一组标准品以上述相同方式展开的分子量对数与迁移时间的曲线图。如图所示，所述分离方法产生精确的(例如)线性数据，这允许通过根据所示曲线图，将这些未知蛋白质的迁移时间与标准品组相关联来表征分子量未知的蛋白质。如图4和5所示，为表征蛋白质和其它多肽提供了高度可重现、精确和快速的方法。

展开也包括Cy-5染料标记的相同标准品组，以显示去污剂染料前锋的共洗脱。该展开的层析图见图6。如图所示，去污剂-染料峰(星号表示)与分子量在65kD范围的蛋白质基本上同时洗脱。在样品预处理缓冲液中的去污剂浓度在本领域以前所述的水平上，如2％的情况下，所示峰大很多，该峰基本上干扰了此分子量范围中蛋白质的鉴定和定量。

实施例2：用分离后/检测前稀释分离和检测多肽

如图7所示的微流体装置中充满分离缓冲液，如上所述。分离通道704在注射点下游1.2cm和检测点732上游0.1cm的点上与稀释剂通道720a和722a相交。分离缓冲液含有4.2％非交联聚二甲基丙烯酰胺/共-丙烯酸的30mM Tris曲辛缓冲液溶液和0.13％SDS。将含有30mM Tris-曲辛但没有聚合物或SDS的稀释缓冲液加入贮器720和722。用动电学方法，如电泳方法使缓冲剂流入分离通道。

将多肽标准溶液(来自Bio-Rad，Inc.的10-205kD蛋白质标准)加入样品贮器，如贮器706，用美国专利5,976,336(之前纳入本文)所述的相同方法加载并注射入分离通道。

图8A-8D说明没有分离后处理和有分离后稀释的标准分离的荧光与时间的曲线图，由2100生物分析仪(Agilent Technologies，Inc.)在检测点732上检测。具体说，图8A和B显示了在没有分离后稀释功能的微流体装置中空白展开(样品中无多肽)和蛋白质样品展开。该装置的功能类似于图1所示的装置通道布置。如图所示，空白和多肽展开的数据包括显著背景和其它基线问题，包括大的去污剂染料前锋、然后是基线谷，接着是染料脊。在样品分离展开中发现了这些相同的基线偏差，它们在定性和定量分离数据中引起许多困难。图8C和8D说明采用在大部分分离下游、但在检测点上游将Tris-曲辛缓冲液引入分离通道的分离后稀释步骤的相同空白展开和多肽样品分析。如图所示，分离后稀释步骤使得比非稀释样品大大降低了相对于检测样品组分的总背景荧光，同时也减小了与胶束染料结合相关的基线脊和谷，如图8A和8B所示。

除非另有说明，本文提供的所有浓度值指给定组分加入混合物或溶液时该组分的浓度，与该组分加入混合物或溶液时发生的任何转化、解离、反应以改变组分或将该组分转化成一种或多种不同物质无关。

将所有发表物和专利申请以相同程度纳入本文作为参考，就好像各单独出版物或专利申请被特别和单独纳入作为参考那样。虽然为了阐明和理解的目的通过说明和实施例的方式详细描述了本发明，但显然，可在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。

Claims (37)

1.一种分离两种或多种多肽的方法，所述方法包括：

提供一微流体装置，该微流体装置的主体中至少具有第一通道，所述第一通道包含第一和第二通道段，所述第一通道段包含含有去污剂的分离缓冲液，去污剂的浓度与两种或多种多肽的分离相容；

使第一种样品材料流过第一通道段以分离两种或多种多肽；

使第一种样品材料从第一通道段流入第二通道段；和

将第一种稀释剂引入第二通道段，所述稀释剂将分离缓冲液中的去污剂浓度稀释到与在沿第二通道段长的检测区检测两种或多种多肽相容的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离操作包括电泳多肽分离，第一通道段中的去污剂浓度等于或高于去污剂的临界胶束浓度(CMC)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一通道段中的去污剂浓度为约0.1％-1％。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测包括检测与第一个操作中分离的多肽相连的亲脂性染料，第二通道段中的去污剂浓度低于去污剂的CMC。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的去污剂浓度为约0.15％-0.25％。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的去污剂浓度为约0.05％-0.4％。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的去污剂浓度为约0.1％-0.3％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的稀释剂以约1∶2-1∶30稀释分离缓冲液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离缓冲液含有聚合物基质、缓冲剂、第一种去污剂和亲脂性染料。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述分离基质包含非交联聚合物溶液。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述非交联聚合物溶液包含线性二甲基丙烯酰胺聚合物溶液。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述线性聚丙烯酰胺聚合物存在于分离缓冲液中，浓度约为0.1％-20％(w/v)。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一种去污剂包含烷基磺酸盐去污剂。

14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一种去污剂选自十八烷基硫酸钠、癸基硫酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。

15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一种去污剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)。

16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一种去污剂存在于第一通道段中的分离缓冲液中，浓度约为0.01％-1％。

17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂包含Tris-曲辛。

18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂存在于第一通道段中的分离缓冲液中，浓度约为10mM-200mM。

19.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述亲脂性染料是荧光亲脂性染料。

20.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述亲脂性染料存在于第一通道段中的分离缓冲液中，浓度约为0.1μM-1mM。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的稀释剂以1∶2-1∶10稀释分离缓冲液。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的稀释剂以1∶3-1∶8稀释分离缓冲液。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二通道段中的稀释剂以1∶4-1∶7稀释分离缓冲液。

24.一种分离多肽的装置，该装置包括：

至少安置有第一分离通道的主体结构；和

装在第一分离通道中的分离缓冲液，所述分离缓冲液包含：

非交联聚合物溶液；

浓度约为10mM-200mM的缓冲剂；

浓度约为0.01％-1％(w/v)的第一种去污剂；和

能够结合多肽的亲脂性染料，所述染料的浓度约为0.μM-1mM。

25.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述分离缓冲液中的去污剂浓度约为0.05％-0.4％。

26.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述去污剂浓度约为0.1％-0.3％。

27.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述去污剂浓度约为0.15％-0.25％。

28.如权利要求24所述的装置，还包括与所述分离通道流体偶联的第二种去污剂来源，其中第二种去污剂的浓度约为分离缓冲液中第一种去污剂的0.05倍-3倍。

29.如权利要求24所述的装置，还包括与所述分离通道流体偶联的第二种去污剂来源，其中第二种去污剂的浓度小于分离缓冲液中第一种去污剂的浓度。

30.如权利要求29所述的装置，其特征在于，所述第二种去污剂的浓度约为0.0025％-0.01％(w/v)。

31.如权利要求29所述的装置，其特征在于，所述第二种去污剂的浓度约为0.0025％-0.5％(w/v)。

32.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述主体结构包括其中安置有流体偶联于所述分离通道的第一毛细管通道的毛细管元件。

33.如权利要求24所述的装置，还包括流体偶联于所述分离通道的离子溶液来源。

34.如权利要求33所述的装置，其特征在于，所述离子溶液来源包含选自NaCl、TrisCl和PBS的盐。

35.如权利要求34所述的装置，其特征在于，所述离子溶液的离子浓度约为100mM-500mM。

36.如权利要求34所述的装置，其特征在于，将所述离子溶液装入流体偶联于所述分离通道的主体结构的贮器中。

37.如权利要求24所述的装置，还包括流体偶联于所述分离通道的至少一种标准蛋白质梯来源。

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