CN1293092C - 从乳酸乳球菌发酵液中分离乳酸链球菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从发酵液中分离提取乳酸链球菌素的方法，包括释放乳酸链球菌素、分离和喷雾干燥，在温度10-55℃和压力0.5-2.5MPa条件下，采用无机膜或管式膜过滤从发酵液中去除菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质；用卷式膜超滤从发酵液中去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到发酵液浓缩物。该方法生产工艺简单、成本低、收率高，活性保持高，分离效果好。

Description

从乳酸乳球菌发酵液中分离乳酸链球菌素的方法
技术领域
本发明涉及微生物产物的分离方法，具体讲涉及一种利用膜对乳酸乳球菌发酵液进行浓缩，分离乳酸链球菌素的方法。
技术背景
乳酸链球菌素是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)产生的一种小分子肽，分子量约为3510Da。这种菌对许多革兰氏阳性菌，尤其对引起食品腐败的芽孢杆菌、梭菌、葡萄球菌、利斯特氏菌等有强烈抑制作用，而乳酸链球菌素可被人所消化，故乳酸链球菌素作为食品防腐剂具有天然无毒的特点，广泛用于乳制品、罐装食品、肉制品和饮料的防腐保鲜剂。
杨博等人对乳链菌肽的最佳发酵条件进行了研究，其使用的菌株为乳链菌肽生产菌株(Lactococus lactis subsp.lactis)Y-72，检测菌为黄色微球菌(Micrococcus flavus)NCIB 8166由中科院微生物研究所提供；发酵培养基为：大豆蛋白胨1.0％，牛肉膏0.25％，酵母膏0.25％，Na2HPO4·12HO21.5％，MgSO4·7H2O0.012％，自然PH值；乳链菌肽效价检测培养基为：胰蛋白胨0.8％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，NaHPO4·12H2O0.2％，琼脂1.5％，PH6.8；所用试剂为：乳链菌肽标准品：Aplin & Barrett LTD生产，胰蛋白胨：Oxoid LTD生产；多胨：日本产，其他培养基为北京市海淀区微生物培养基制品厂生产；其使用方法为：菌体生长测定：用721型分光光度计在600nm处测定；乳链菌肽效价的测定：采用琼脂扩散法，测发酵液在检测平板上产生抑菌圈的大小，用乳链菌肽标准品作对照，根据有关公式计算被测液的效价。作者从碳源种类、碳源浓度、氮源、磷源、磷源发酵量、培养温度、培养方式、接种量及Y-72发酵动力学方面对发酵条件进行了研究(乳链菌肽的最佳发酵条件：大连轻工业学院学报第18卷第1期，1999、365-69)。
近年来，人们探索用吸附剂吸附提取乳酸链球菌素的方法，Coventry等人用硅酸钙抗粘剂，从乳酸乳球菌的发酵液中吸附乳酸链球菌素，但由于该法得到的是吸附复合物，解吸困难。
Janes等人用硅酸作吸附剂从乳酸乳球菌的发酵液中吸附乳酸链球菌素时，得到的是吸附复合液，解吸仍困难。
00129928.X号中国专利申请披露了一种从乳酸乳球菌的发酵液中吸附乳链菌肽的方法，其中记载的方法包括：用酸将乳酸乳球菌发酵产生的含有乳链菌肽的发酵液调PH至1.8-3.5，于70-100℃下加热1-60分钟，杀死细菌并使乳链菌肽完全释放于发酵液中；随后，在20-50℃下加入为发酵液体积0.1-5％的吸附剂进行吸附，保温搅拌0.5-3小时，制成吸附剂-乳链菌肽复合物；制成的吸附剂-乳链菌肽复合物的沉淀用蒸馏水洗涤两次，然后用10％-20％发酵液体积的解吸附剂进行解吸附，使用的解吸附剂为聚乙二醇与有机酸盐或无机酸盐的水溶液，在20-40℃下搅拌5-60分钟进行解吸附。该方法需吸附、解吸附，加入吸附剂和解吸附剂，生产工艺复杂，成本高，所需产物活性易破坏，耗能高，活性保持低，效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产工艺简单、成本低、收率高，活性保持高，分离效果好的乳酸链球菌素的分离提取方法。
为达到发明目的，本发明提供了一种从发酵液中分离乳酸链球菌素的方法，包括释放乳酸链球菌素、分离和喷雾干燥，所说分离为采用膜过滤的方法分别将分子量大于和小于乳酸链球菌素的分子量的物质从发酵液中分离出去。
其中在温度10-55℃和压力0.5-2.5MPa条件下，采用无机膜或管式膜过滤从发酵液中去除菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质，其中无机膜或管式膜的孔径为10-60万，优选为15-50万；温度优选为15-45℃，最优选为25-40℃。
在温度10-55℃和压力0.5-2.5MPa条件下，用卷式膜从发酵液中去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，其中卷式膜孔径为0.2～4万，优选为1.5-3万；温度优选为15-45℃，最优选为25-40℃。
超滤后的发酵液浓缩物，浓度为100,000-500,000IU/ml，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为10-50％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为120-180℃，出口温度为70-100℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
注：乳酸链球菌素即是乳链菌肽nisin。
具体实施方式
另有说明除外，本发明所使用的无机或管式膜系以金属氧化物、陶瓷等为原料制作，寿命较长，膜主件主要由国外供应，国内组装。制造商有Cerrer(法国)、TOK(日本)、Norton(美国)、Mitsui(日本)、Nipongaishi(日本)，Sfec(法国)、Corning(美国)、DDS(丹麦)等公司。
卷式膜为有机材料制作，主要有聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等各种材料，膜材主件一般由国外公司进口，在国内进行组装和配套，性能比较优越。制造商主要有Pall(美国)、Amicon(美国)、HAYWARD(美国)等公司。
实施例1
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液，用浓盐酸调pH至1.8，于70℃下加热60分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为15℃，操作压力为0.5MPa通过无机膜过滤而得到去除菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为60万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为10℃，操作压力为0.5MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为100,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为4万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为30％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为120℃，出口温度为70℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为Cerrer(法国)制造，卷式膜组件为HAYWARD(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为89％。
实施例2
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓硫酸调pH至3.5，于100℃加热1分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为20℃，操作压力为1.5MPa通过无机膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为15万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为25℃，操作压力为2.5MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为200,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为1.5万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为40％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为150℃，出口温度为80℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为TOK(日本)制造，卷式膜组件为Amicon(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为87％。
实施例3
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓盐酸调PH至2.0，于80℃加热30分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为25℃，操作压力为1.0MPa通过无机膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为20万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为55℃，操作压力为1.5MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为300,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式超滤膜的孔径为1万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为50％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为180℃，出口温度为100℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为Norton(美国)制造，卷式膜组件为HAYWARD(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为85％。
实施例4
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓盐酸调PH至2.5，于85℃加热20分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为30℃，操作压力为1.2MPa通过管式膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为10万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为20℃，操作压力为1.0MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为500,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为2万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为10％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为160℃，出口温度为90℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为Mitsui(日本)制造，卷式膜组件为Pall(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为87％。
实施例5
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓硫酸调pH至3.0，于90℃加热45分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为55℃，操作压力为0.5MPa通过管式膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为30万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为18℃，操作压力为2.0MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为400,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为3万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为50％。在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为165℃，出口温度为85℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为Nipongaishi(日本)制造，卷式膜组件为Amicon(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为85％。
实施例6
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓盐酸调pH至3.5，于100℃加热1分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为10℃，操作压力为1.5MPa通过无机膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为45万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为30℃，操作压力为1.2MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为250,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为2.5万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，在加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为20％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为150℃，出口温度为80℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为DDS(丹麦)制造，卷式膜组件为HAYWARD(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为86％。
实施例7
本实施例中，从乳酸乳球菌发酵液中提取乳酸链球菌素的具体步骤如下：
1)释放乳酸链球菌素：
首先取200000ml乳酸乳球菌发酵产生的含有乳酸链球菌素的发酵液用浓硫酸调pH至3.5，于100℃加热1分钟，使乳酸链球菌素完全释放于发酵液中；
2)膜过滤：
发酵液在温度为10℃，操作压力为1.6MPa通过无机膜过滤而得到去除了菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质的发酵液，其中膜的孔径为50万；
3)卷式膜超滤：
步骤2)所得到的发酵液在温度为40℃，操作压力为2.5MPa通过卷式膜超滤，去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为350,000IU/ml发酵液浓缩物，其中卷式膜的孔径为1.5万；
4)喷雾干燥：
上述超滤后的发酵液浓缩物，在加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为45％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为150℃，出口温度为80℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
其中无机膜组件为Corning(美国)制造，卷式膜组件为Amicon(美国)制造。
经过测试，整个流程乳酸链球菌素的收率为85％。
本发明提供的从发酵液中分离提取乳酸链球菌素的方法，由于采用无机膜过滤和卷式膜超滤，生产工艺简单、成本大大降低，且对目标产物无破坏，活性保持高。
其中收率计算方法：
总收率％＝成品效价×成品重量/发酵液效价×发酵液体积×％。

Claims (9)

1、一种从发酵液中分离乳酸链球菌素的方法，所述方法包括释放乳酸链球菌素、分离和喷雾干燥，其特征在于：所说分离为采用膜过滤的方法分别将分子量大于和小于乳酸链球菌素的分子量的物质从发酵液中分离出去。
2、权利要求1的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于在温度10-55℃和压力0.5-2.5MPa条件下，采用无机膜或管式膜过滤从发酵液中去除菌体和固体等分子量比乳酸链球菌素分子量大的物质；用卷式膜超滤从发酵液中去除分子量比乳酸链球菌素分子量小的物质，得到浓度为100,000-500,000IU/ml发酵液浓缩物。
3、根据权利要求2所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于无机膜或管式膜的孔径为10-60万。
4、根据权利要求3所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于无机膜或管式膜的孔径为15-50万。
5、根据权利要求2所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于温度为15-45℃。
6、根据权利要求5所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于温度为25-40℃。
7、根据权利要求2所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于卷式膜的孔径为0.2-4万。
8、根据权利要求7所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于卷式膜的孔径为1.5-3万。
9、根据权利要求2所述的分离乳酸链球菌素的方法，其特征在于超滤后的发酵液浓缩物，加入填料固体食盐，使喷雾干燥后食盐含量为10-50％，在喷雾干燥器上进行喷雾干燥，热风进口温度为120-180℃，出口温度为70-100℃，即得粉末状食品级的乳酸链球菌素产品。
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Denomination of invention: Method for separating lacti-streptocin from fermentation liquid of lacti-galactococcus

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