CN106591170B - 一株均苯四甲酸降解假单胞菌pma-3及其应用 - Google Patents

一株均苯四甲酸降解假单胞菌pma-3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种消除均苯四甲酸残留的降解菌及其固定化小球,属于生物高科技技术领域。于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号CGMCC NO.10545,经鉴定为假单胞菌。在实验室摇瓶条件下该菌株对500mg/L均苯四甲酸的降解率达94.5%,解决了含均苯四甲酸废水对微生物产生抑制而影响其处理效果的问题。

Description

一株均苯四甲酸降解假单胞菌PMA-3及其应用
技术领域
本发明涉及环境为生物技术领域,具体地,是涉及一株均苯四甲酸降解假单胞菌PMA-3及其应用。
背景技术
苯羧酸类化合物是重要的工业合成原料,在聚酯行业、化工行业具有十分广泛的应用。苯羧酸及其衍生物因其结构的特殊性,与其他原材料相比表现出显著的优越性,可用于制备各种具有耐热、绝缘、耐腐蚀等性能的特殊产品,因而被广泛应用于树脂、农药、涂料、医药、电子等行业。部分苯羧酸在水环境中的溶解度较大,因此在环境中很容易发生迁移,此外苯羧酸易被生物吸附,这些特性使得苯羧酸成为一类会对环境和人体造成较大危害的有机物。
均苯四甲酸是工业上十分重要的化工原料,其脱水产生的均苯四甲酸二酐,简称均酐,由于其自身的特殊结构,更是在高分子材料的合成上起到举足轻重的作用。均苯四甲酸二酐极易水解成均苯四甲酸,在均苯四甲酸二酐及均苯四甲酸生产过程中也会产生大量均苯四甲酸,尤其是在均苯四甲酸二酐的提纯过程中,会产生高浓度的以均苯四甲酸为首的芳香酸废水。
微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点,已在很多方面得到应用,所以筛选出均苯四甲酸降解菌对于处理均苯四甲酸的废水具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求,利用微生物的方法来降解废水中的污染物,适用于现代废水处理工艺,使废水达标排放,同时降低生产和使用成本。
本发明提供一种均苯四甲酸降解菌株PMA-3,其菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌,于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号CGMCC NO.10545,经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。主要生物学特性为G-,对数生长期菌体为杆状,以极生鞭毛运动,不形成芽孢,菌落为圆形、不透明、白色或者淡黄色,化能有机营养,严格好氧,呼吸代谢,从不发酵。
本发明提供的菌株PMA-3在均苯四甲酸降解中的应用。
本发明还提供了所述菌株PMA-3制备的固定化小球。
本发明还提供了一种菌株PMA-3制备成固定化小球的方法,包括下列步骤:
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30℃,160rpm条件下振荡培养至对数期;
2)将上述培养好的菌液于离心管中,离心管放入高速离心机的角度转子中,此时,设置高速离心机的升速曲线为9档,降速曲线为9档,10000rpm的条件下离心3min,倒掉上清液;加入相同体积的无菌水,摇匀后放入高速离心机的角度转子中,此时,设置高速离心机的升速曲线为7档,降速曲线为7档,10000rpm离心3min,如此循环离心后,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液;
3)取1ml菌体液与20ml的含有1g/L活性炭的4%海藻酸钠溶液于常温混匀,然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液,于4℃交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球,无菌水洗两遍保存于4℃备用。
步骤1)中所述的LB培养基为:NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L,均苯四甲酸500mg,pH7.0。
本发明还提供了所述固定化小球在均苯四甲酸降解中的应用。
所述固定化小球在均苯四甲酸降解中的应用,具体为:先将固定化小球在废水中曝气15h进行活化,活化过程中水温28±2℃,曝气量在1.5L/min,然后在温度为28±2℃、pH值为6.8-7.2的适宜条件下,每升水中加入500mg的均苯四甲酸,使得均苯四甲酸进水浓度控制在500mg/L的情况下,每升均苯四甲酸废水用100mL的固定化小球来处理;24h后,补加50mg/L均苯四甲酸和200mL的固定化小球,同时,水力停留时间为72h,在这种情况下均苯四甲酸的去除率可达到98%,有较好的去除效果。
本发明所述的均苯四甲酸降解菌株PMA-3能以均苯四甲酸为唯一碳源进行生长。在实验室摇瓶条件下对500mg/L均苯四甲酸的降解率达94.5%。本发明还提供了一种菌株PMA-3所制备的固定化小球,实验室生物降解实验结果表明,固定化小球对500mg/L均苯四甲酸的降解率达到98%。该发明生产的降解菌PMA-3的固定化小球具有生产成本低,使用方便,去除效果好的优点,可以降解废水中的均苯四甲酸,适合在含有均苯四甲酸的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境,保护人类的身体健康,降低废水处理成本具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明所述菌株PMA-3菌体结晶紫染色照片(1000x);
图2固定化小球对均苯四甲酸降解去除率随时间变化的示意图;
图3不同温度条件对固定化小球对均苯四甲酸降解的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1均苯四甲酸降解菌株PMA-3的分离和鉴定
取均苯四甲酸富集菌液1.0ml,加入9.0ml无菌水中,充分混匀配成10-1的富集液,再吸取1.0ml配好的10-1的富集液加入9.0ml无菌水中,充分混匀配成10-2的富集液,以此类推,对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含200mg/L均苯四甲酸的无机盐固体培养基上,其配方为:每升含0.6g K2HPO4、1.4g KH2PO4、0.2g MgSO4×7H2O、0.001gFeSO4×7H2O、1.0g NaCl、1.0g(NH4)2SO4,15g琼脂,pH 7.0,30℃培养72h。72h后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落,于5ml的LB液体培养基中培养24小时后,于10000rpm的条件下离心3min,倒去上清液,加入5ml的无菌水摇匀,仍于10000rpm的条件下离心3min,按此方法用无菌水洗两遍后,加入5ml无菌水悬浮该菌。吸取1ml该菌液加入100ml均苯四甲酸浓度为200mg/l的无机盐液体培养基中,其配方为:每升含0.6g K2HPO4、1.4g KH2PO4、0.2g MgSO4×7H2O、0.001g FeSO4×7H2O、1.0g NaCl、1.0g(NH4)2SO4,pH 7.0,于160r/min,30℃条件下振荡培养72h后,用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存,进行后续实验。其菌体革兰氏染色照片(1000x)如图1所示,鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas);命名为:PMA-3。主要生物学特性为G-,菌落为圆形、不透明、白色或者淡黄色;以极生鞭毛运动,不形成芽孢,化能有机营养,严格好氧,呼吸代谢,从不发酵。
能以均苯四甲酸为唯一碳源进行生长。如图2所示,在实验室摇瓶条件下固定化小球对500mg/L均苯四甲酸的降解率可达到94.5%以上。
实施例2菌株PMA-3制备成固定化小球的方法
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基(NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L,均苯四甲酸500mg,pH7.0)中于30℃,160r/min条件下振荡培养至对数期;
2)将上述培养好的菌液于离心管中,离心管放入高速离心机的角度转子中,此时,设置高速离心机的升速曲线为9档,降速曲线为9档,10000rpm的条件下离心3min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水,摇匀后放入高速离心机的角度转子中,此时,设置高速离心机的升速曲线为7档,降速曲线为7档,10000rpm离心3min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液;
3)取1ml菌体液与20ml含有1g/L活性炭的4%海藻酸钠溶液于常温混匀,然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液,于4℃交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球,无菌水洗两遍保存于4℃备用。
实施例3固定化小球在均苯四甲酸降解中的应用方法
先将固定化小球在废水中曝气15h进行活化,活化过程中水温28±2℃,曝气量在1.5L/min,然后在温度为28±2℃、pH值为6.8-7.2的适宜条件下,在均苯四甲酸进水浓度低于500mg/L的情况下,每升均苯四甲酸废水用100mL实施例2所制备的固定化小球来处理;24h后,补加50mg/L均苯四甲酸和200mL的固定化小球,同时,水力停留时间为72h,如图2所示,在这种情况下均苯四甲酸的去除率可达到98%,有较好的去除效果。
而图3显示了对于不同温度条件下均苯四甲酸的去除情况,研究表明,温度过高或过低对于菌株PMA-3处理均苯四甲酸的效果均有抑制,最适宜温度范围在25℃-35℃,降解率可维持80%以上。

Claims (7)

1.一株降解均苯四甲酸的假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株PMA-3,其保藏编号为CGMCC NO.10545。
2.权利要求1所述假单胞菌菌株PMA-3在均苯四甲酸降解中的应用。
3.含有权利要求1所述假单胞菌菌株PMA-3的固定化小球。
4.权利要求3所述的固定化小球的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30℃,160rpm条件下振荡培养至对数期;
2)将上述培养好的菌液放置于离心管中,离心管放入高速离心机的角度转子中,设置高速离心机的升速曲线为9档,降速曲线为9档,10000rpm的条件下离心3min,倒掉上清液;加入相同体积的无菌水,摇匀后放入高速离心机的角度转子中,设置高速离心机的升速曲线为7档,降速曲线为7档,10000rpm离心3min,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液;
3)取1ml菌体液与20ml的含有1g/L活性炭的4%海藻酸钠溶液于常温混匀,然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液,于4℃交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球,无菌水洗两遍保存于4℃备用。
5.根据权利要求4所述的固定化小球的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述的LB培养基为:NaCl10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L,均苯四甲酸500mg/L,pH7.0。
6.权利要求3所述的固定化小球在均苯四甲酸降解中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,具体为:先将固定化小球在废水中曝气15h进行活化,活化过程中水温28±2℃,曝气量在1.5L/min,然后在温度为28±2℃、pH值为6.8-7.2的适宜条件下,每升水中加入500mg的均苯四甲酸,使得均苯四甲酸进水浓度控制在500mg/L的情况下,每升均苯四甲酸废水用100mL的固定化小球来处理;24h后,补加50mg/L均苯四甲酸和200mL的固定化小球,同时,水力停留时间为72h。
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