CN105087429A

CN105087429A - 一株邻二甲苯降解菌及其应用

Info

Publication number: CN105087429A
Application number: CN201510421488.XA
Authority: CN
Inventors: 颜家保; 陈佩; 武文丽
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: CN105087429B

Abstract

本发明公开了一株邻二甲苯降解菌及其应用。本发明所提供的邻二甲苯降解菌OX5属于假单胞菌(<i>Pseudomonas？</i>sp<i>.</i>)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年6月29日，保藏编号为CCTCC？NO:M2015415。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈圆形，微凸，菌落四周为乳白色，中间为黄色，表面湿润光滑。该菌能利用邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖，纯培养时，48h对1500mg/L的邻二甲苯的降解率高达98%，对邻二甲苯的耐受浓度达到2500mg/L。该菌不仅能降解焦化废水中的邻二甲苯和其他苯系物，而且还能降低焦化生化出水中的COD，用于焦化废水的生物强化处理，应用前景广阔。

Description

一株邻二甲苯降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物强化技术领域，具体涉及一株邻二甲苯降解菌及其应用。

背景技术

邻二甲苯是一种重要的有机化工原料，主要用于生产苯酐、染料、杀虫剂、涂料溶剂以及药物等，其中90%左右用于生产苯酐，2%用于生产溶剂，而仅1%用来生产染料中间体。邻二甲苯具有较强的毒性，低浓度时能刺激皮肤、粘膜，可以经皮肤渗透入体内；高浓度时，可以麻醉中枢神经系统，使人神志不清。长期接触可影响肝、肾功能，会引起神经衰弱综合症。利用物理和化学方法处理邻二甲苯可以达到较好的效果，但其成本高，易造成二次污染。生物处理法具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广的优点。因此，采用生物强化的方法，从环境中筛选高效邻二甲苯降解菌，提高原有生物处理系统对目标污染物的去除效果是消除苯系污染物的重要方法和发展趋势。目前，国内外学者陆续筛选出一些能够降解苯系物的微生物，包括红球菌（Rhodococcussp.）、不动杆菌（Acinetobactersp.）和动胶菌（Zoogloearesiniphila）等。CN103451127B申请了一株具有邻二甲苯降解能力的动胶菌及其应用的专利，该专利从制药废水中分离纯化得到的动胶菌对邻二甲苯具有较好降解能力，并且能在无机盐培养基中较好降解苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯等苯系污染物，但未发现该菌在实际废水环境中对其中的邻二甲苯和其他苯系物具有降解能力。本发明的假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5对邻二甲苯的降解速度快，并且其耐受浓度高达2500mg/L。本发明的OX5不仅能降解焦化废水中的邻二甲苯和其他苯系物，而且还能降低焦化生化出水中的COD。

发明内容

本发明旨在解决普通微生物对邻二甲苯降解效率低的问题，目的是提供一株邻二甲苯降解菌，高效降解邻二甲苯、苯和甲苯等苯系物，实现其对焦化废水的生物强化处理。

本发明所述的邻二甲苯降解菌OX5源于武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水处理厂内长期受污染的土壤。该菌是以邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖，在无机盐培养基中对土壤中的菌群进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。

其中，无机盐培养基成分为：Na₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄1.5g，(NH₄)₂SO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，FeSO₄·7H₂O0.02g，CaCl₂0.01g，微量元素储备液2mL，蒸馏水定容至1000mL，pH约为7。所述微量元素储备液的组分为：MnSO₄·H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.12g，H₃BO₃0.07g，Na₂MoO₄·H₂O0.04g，CuSO₄·5H₂O0.02g，CoCl₂0.04g，蒸馏水定容至1000mL。

该菌为革兰氏阴性菌，经16SrDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonassp.），编号为OX5，于2015年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏编号为CCTCCNO:M2015415。该菌菌落呈圆形，微凸，菌落四周为乳白色，中间为黄色，表面湿润光滑。生理生化特性鉴定显示该菌的硝酸盐实验、明胶液化实验和淀粉水解实验为阳性，吲哚实验、产硫化氢实验、甲基红实验和V-P实验为阴性，能利用邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖。

该菌较优的培养条件为：温度为35℃，初始pH为7～8，摇床转速为150r/min。

本发明还涉及所述假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5用于降解焦化废水中的邻二甲苯和其他苯系物，降低焦化生化出水中的COD。

与现有技术相比，本发明所述的假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5对邻二甲苯的降解速度快，耐受浓度高，不仅能高效降解培养基中的邻二甲苯，而且还能有效降解焦化废水中的邻二甲苯和其他苯系物，对焦化生化出水中的COD也有较好的去除效果。

附图说明

图1为本发明的菌株OX5的生长与邻二甲苯降解效果关系图；

图2为培养温度对本发明的菌株OX5降解邻二甲苯的影响图；

图3为初始pH值对本发明的菌株OX5降解邻二甲苯的影响图；

图4为摇床转速对本发明的菌株OX5降解邻二甲苯的影响图；

图5为邻二甲苯初始浓度对本发明的菌株OX5降解邻二甲苯的影响图；

图6为本发明的菌株OX5对焦化生化出水中COD的去除效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。

实施例1：假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5的分离、鉴定及其对邻二甲苯的降解性能

1、菌株的分离、纯化

（1）菌种来源

菌源取自武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水处理厂内长期受污染的土壤，呈黑色，在不同地点共采集土壤样品3份。

（2）菌株的分离纯化

将采集的土壤样品加入蒸馏水振荡24h，静置离心后取5ml上清液接种于LB培养基（蛋白胨1wt％，氯化钠1wt％，酵母抽提物0.5wt％）中，置于30℃、150r/min的恒温摇床富集培养24h。吸取2mL富集的菌液，离心，弃上清，将菌体接至含有100mg/L邻二甲苯的无机盐培养基中，于30℃、150r/min下培养，待培养基由澄清变浑浊后，再吸取2mL菌液转接入新鲜的底物浓度更高的无机盐培养基中相同条件下培养，以此来驯化邻二甲苯降解菌，无机盐培养基中的邻二甲苯的浓度分别为100，200，400，600，800，1000，2000mg/L。将底物浓度为2000mg/L时的驯化液按10^-3~10^-7体积比稀释，取各梯度稀释液分别均匀涂布于LB平板上，30℃培养24h。挑取长势良好的菌落反复划线纯化，得到单一菌落。对各个单菌进行邻二甲苯降解实验，确定各菌株的降解能力，将对邻二甲苯降解效果最好的一株菌编号为OX5，以斜面和甘油保藏菌株。

2、菌株的鉴定

（1）邻二甲苯降解菌株OX5的菌落形态特征及生理生化特性

邻二甲苯降解菌株OX5菌落呈圆形，微凸，菌落四周为乳白色，中间为黄色，表面湿润光滑。生理生化特性鉴定显示该菌的硝酸盐实验、明胶液化实验和淀粉水解实验为阳性，吲哚实验、产硫化氢实验、甲基红实验和V-P实验为阴性。

(2)邻二甲苯降解菌株OX5的16SrDNA鉴定

对邻二甲苯降解菌株OX5的16SrDNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99％的均为假单胞菌（Pseudomonassp.），其16SrDNA序列如序列表所示。结合菌株的生理生化特性，将其归属于假单胞菌属（Pseudomonassp.）。

3、菌株OX5的生长及其对邻二甲苯的降解效果

（1）菌悬液的制备

用接种环从试管斜面挑取一环OX5接种于LB培养基，35℃、150r/min培养24h，取2mL转接于新鲜LB培养基，35℃培养12h（细菌处于对数生长期），取菌液于4000r/min条件下离心5min收集菌体，再用已灭菌的含邻二甲苯的无机盐培养基（pH7.0）洗涤2次，然后采用含邻二甲苯的无机盐培养基重悬菌体，调节细胞密度至OD₆₀₀≈1，4℃保存备用。

（2）菌株OX5的生长与降解曲线

将菌株OX5接种于含1000mg/L邻二甲苯的无机盐培养基中，于35℃、150r/min和初始pH=7.0的条件下培养，测定细菌的菌密度（OD₆₀₀）和邻二甲苯的残留浓度，结果如图1所示：菌株OX5对邻二甲苯的降解与其生长趋势相一致，表明该菌能利用邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖，并对邻二甲苯有良好的降解效果。0~12h内，菌株OX5生长速度缓慢，主要是因为邻二甲苯具有一定的毒性，细菌需要一定时间适应环境；12h后细菌进入对数生长期，OD₆₀₀值呈线性增长；30h时，由于大部分邻二甲苯已经被降解，细菌生长所需的碳源减少，因此开始进入稳定期。

实施例2：环境条件对假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5降解能力的影响

1、培养温度的影响

在邻二甲苯浓度为1000mg/L，pH为7.0、摇床转速为150r/min和接种量为2vol%时，温度对邻二甲苯降解的影响如图2所示：在25~40℃范围内，菌株OX5对邻二甲苯均具有较好的降解效果，表明该菌对温度有较宽的适应范围。在25~35℃之间时，随着温度的升高，底物的降解率随之增大；但当温度达到40℃时，菌株OX5对底物的降解率反而低于35℃时的降解率。表明假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5的最适温度为35℃。

2、初始pH值的影响

在邻二甲苯浓度为1000mg/L，温度为35℃、摇床转速为150r/min和接种量为2vol%时，初始pH值对邻二甲苯降解的影响如图3所示：pH=5时，48h后，菌株OX5对邻二甲苯的降解率仅为25.2%，说明该株菌在酸性条件下很难生长；当pH=7~8时，30h后其降解率均可达到90%以上，然而随着pH的继续增大其降解率又有所下降，表明菌株OX5对环境pH值比较敏感，其适宜的pH范围为7~8。

3、摇床转速的影响

在邻二甲苯浓度为1000mg/L，pH为7.0、温度为35℃和接种量为2vol%时，摇床转速对邻二甲苯降解的影响如图4所示：摇床转速为100r/min时，菌株OX5对邻二甲苯的降解率很低，当转速在150~250r/min时，48h后邻二甲苯的降解率达到了90%以上，表明在摇床转速为150～250r/min时已能满足假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5对溶氧的需求，结合实际生产中的可行性和成本考虑，确定菌株OX5的最佳摇床转速为150r/min。

4、邻二甲苯初始浓度的影响

在pH为7.0、培养温度35℃、摇床转速150r/min和接种量为2vol%时，邻二甲苯初始浓度对邻二甲苯降解的影响如图5所示：菌株OX5在36h内对1500mg/L的邻二甲苯的降解率可达到90%，随着邻二甲苯浓度的增大，其降解率逐渐减小，且细菌到达稳定期的时间延迟，说明说明菌株OX5对邻二甲苯具有良好的降解性能，但过高的邻二甲苯会抑制OX5的生长。

实施例3：假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5对焦化废水中苯系物的降解

将菌株OX5的菌悬液以2vol%的接种量投加至稀释的焦化废水（COD=604mg/L）中，并分别外加一定浓度的苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯，于35℃、150r/min摇床培养，48h后测定培养液中残留的各苯系物的浓度，计算得出相应苯系物的降解率如表1所示：菌株OX5在48h内可将废水中的三种二甲苯完全降解，并且对苯和甲苯的降解率也都达到了95%以上，说明菌株OX5可较好地适应焦化废水中的环境，并能将废水中的苯系物很好降解。

表1本发明的菌株OX5对焦化废水中苯系物的降解效果

底物名称	底物浓度（mg/L）	降解率（%）
			苯	185	95
甲苯	193	98
			邻二甲苯	212	100
间二甲苯	197	100
			对二甲苯	206	100

实施例4：假单胞菌（Pseudomonassp.）OX5对某焦化厂生化出水COD的去除

以2vol%的接种量将菌株OX5接种至100mL已灭菌的某焦化厂生化出水中，置于35℃、150r/min摇床培养，间隔一定时间取样检测废水中的COD，结果如图6所示：菌株OX5经72h将废水的COD从153.2mg/L降低至95.2mg/L，表明OX5能利用生化出水中的苯系物和难降解有机物为碳源来进行生长繁殖，为利用邻二甲苯降解菌强化处理焦化废水中的COD提供了依据。

上述具体实施方式为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的。

1GGTGAGGAGCTACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGA

51TTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGG

101GATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAA

151GTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAG

201CTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTG

251AGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG

301GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCA

351TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGG

401AGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAAT

451AAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAA

501GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAG

551TTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACT

601GAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAAT

651GCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGA

701TACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC

751TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGA

801TCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCC

851GCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG

901CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACAT

951GCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAG

1001GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC

1051CGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCAC

1101TCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA

1151GTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGT

1201ACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCG

1251TAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAG

1301TAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC

1351ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAA

1401CCGCAAGGGGGACGGT

Claims

1.一株邻二甲苯降解菌，经鉴定为假单胞菌（Pseudomonassp.），编号为OX5，保藏编号为CCTCCNO:M2015415。

2.如权利要求1所述邻二甲苯降解菌OX5的应用，其特征在于所述的OX5用于降解焦化废水中的邻二甲苯和其他苯系物。

3.如权利要求2所述邻二甲苯降解菌的应用，其特征在于将所述的OX5用于降低焦化生化出水中的COD。