CN1278153A - 检测组织形态的方法 - Google Patents

Abstract

一种检测材料的一种或多种物理特性的设备,用由组织散射的光,来确定如组织层中的细胞核大小。该设备包括光纤装置(10,20,30)输送并收集从有关组织区域来的光,来确定如组织是否是正常的或是癌症前期的。

Description

检测组织形态的方法

政府支持

本发明部分或全部由国家健康研究所的P41RR0259和CA53717的经费支持。政府拥有本发明的某些权利。相关申请

此篇为1997年10月10日提交的美国序列号No.08/948,734申请的部分继续申请，该申请的全文通过在此引述而收入本篇。

本发明的背景

在早期阶段诊断癌症的方法对癌症的预防和治疗是很重要的。许多类型的癌症是从覆盖人体内外表面的上皮组织生长而来的。许多这些癌症，如胃肠道内癌症，要经过异常结构发展阶段。异常结构可以确定为还不是恶性的肿瘤组织，但认为是恶性肿瘤的前体。如果在这个阶段得到诊断，很多肿瘤可能治疗。在胃肠肿瘤情况中，目前的诊断方法是依靠内窥镜检查法。然而，异常结构的组织在用内窥镜检查中常常不明显。这样，在胃肠道和其他部位中进行异常结构检查常常依赖于从这种“不可视”恶性肿瘤前体获取分散样品。然而，分散活组织检查很大可能会错过异常结构变化。在一些情况中活组织检查不可能实施。

为了在真正时间内，为活体内不同组织中的癌化组织提供精确诊断，已经努力在寻找一种替代标准活组织检查法的方法。为此，无创伤性光学技术不需将组织移出并能在活体内实施。这种方法提供显微镜水平的信息，并能对用标准活组织检查法可能漏掉的非常小的部位提供研究。虽然大部分人类器官能用光学技术方法诊断，但这些技术更适用于人类体腔中的组织，因为它们可容易地被光学探头接近，光学探头可插入到传统内窥镜管的一个槽内。

本发明的概述

本发明涉及使用光确定材料结构层的物理特性，具体地，使用散射光确定有关组织结构形态的某些性质上的信息。反向散射法和透视法都可使用，取决于所检测材料的厚度及结构的大小和分布。可检测材料的性质实例包括表面粗糙度，寄生状况，细胞计数测量，或任何材料中对应结构变化材料折射指数的变化。这种类型的散射光谱能与不能定量测量微粒形态的吸收光谱区分开来。

尽管作了广泛地研究，还没有可信的诊断活体异常结构的光学技术公开。一个现实存在的困难是异常结构变化局限于上皮层的最上层，其厚度为20μm，对光照射几乎是透明的单细胞层。

如在胃肠道中的组织(其他中空器官也有相同的性质)，是由称为上皮细胞的一层细胞覆盖(从20μm到300μm，取决于胃肠道的部位)，由相对无细胞的富含血管的疏松结缔组织，即固有组织(lamina propria)支持，其厚度可达500μm并含网状胶原质和弹性纤维，和多种白血细胞类型。在固有组织下是肌肉层，即肌粘膜(达400μm厚)和另一层称为亚粘膜的中等密度结缔组织(400-600μm厚)含许多小血管和丰富的胶原质和弹性纤维。这些层的总厚度约为1mm。因为光照射到生物组织内的特征穿透深度通常不超过1mm，所以对于较好的具体实施，这就足以限制了对这些组织层的检测。

食道腺癌发生在食道的组织转化的柱状上皮细胞中，称为“Barretts食道”，它是长期胃肠倒流的并发症。在这种情况中，末梢鳞状上皮细胞被类似于在肠中发现的包括单层细胞的柱状上皮细胞替换。Barretts食道常常与后来能发展成癌症的异常结构有关。对患有Barretts食道的患者进行内窥监测试验还没有降低食道癌的死亡率。最可能的解释是产生在食道中的异常结构不能用标准内窥造影观察到，分散活组织检查取样还是必要的。这种方法只能获取约0.3％有危险组织的样品。这样，有极大潜在取样错误。

使用光学技术诊断Barretts食道的异常结构受到的限制是，组织内的初始变化发生在单细胞厚度(约20-30μm)的上皮层内，而大部分形成的荧光或反射光谱是更深的组织层的。异常结构上皮细胞一个最显著的特征是存在增大的，染色过度的，拥挤的细胞核。实际上，这些细胞核的大小和空间分布的变化是病理学者用来诊断组织样品异常结构的主要标记。在其他组织层中没有观察到显著的变化。不幸的是，上皮细胞不含强的吸收体或荧光基团，并且由于上皮细胞的厚度相当小而被忽略。这些使得在Barretts食道中诊断上皮细胞变成困难问题。

漫反射光谱能为分析生物组织上皮细胞和检测癌症前期损害提供定量的生化和形态信息。通过结肠内窥镜检查，从患者的腺瘤结肠息肉(癌症前体)和正常结肠粘膜收集漫反射光谱。用在含聚苯乙烯珠和血红蛋白的物理组织模型上检测的分析光漫射系统分析数据。获取四个参数：血红蛋白浓度，血红蛋白氧饱和度，有效散射体密度和有效散射体大小。正常的和腺瘤组织部位表现出不同的血红蛋白浓度和有效散射体大小。这样，漫反射可用来获取活体内组织生化和形态信息。

本发明一个较好的具体实施涉及在粘膜组织反向散射光中检测有定期波长的细微结构组成的系统。这种结构一般被漫射背景掩蔽，其必须移出以使结构可观测。这种组成的起源是由于被上皮细胞核表面Mie-散射的光。通过分析定期结构的频率和幅度，可获得这些细胞核的密度和大小分布。这些量是生物组织中肿瘤癌症前期变化的重要指示，这样，这种技术可以为在进行内窥镜检查的患者中观察这种变化提供有用的工具。

照射在组织表面薄层上的光不是完全随机的。在这个薄层区域内可保留弹性散射过程的清晰度。衬于身体中空器官内的粘膜组织，一般包括上皮细胞薄表面层，由下面相对无细胞的结缔组织支持。在健康的组织中上皮层常常由单一的、排列整齐的、端面直径约10-20μm、高度约25μm的细胞层构成。在癌变和癌症前期(异常结构)的上皮层中，细胞扩增，细胞层常常较厚并变得较紧密地堆积，细胞核增大，染色时表现较暗(过度染色)。这可能表示核酸密度增加，从而增加了折射指数。

本发明的一个较好具体实施使用宽带光源照射组织中的有关区域，照射光范围在350到700nm之间。可使用光纤探头输送和/或收集从组织来的光。这个系统可在患者进行内窥镜检查期间使用，在患者内光学监测体腔，从而消除作活组织检查移出组织的需要，或者，能用来协助定位适于作活组织检查的组织。

收集反向散射光较好地是在小角度范围2度到12度之间，更好的范围是在3度到8度之间。当使用光纤系统收集散射光时，光纤数值孔径在0.05到0.22之间，较好可使用的在0.77到0.1之间的光纤。在这个范围的收集角度减少背景光水平且不损失返回光中的定期组成。

附图简要说明

图1是依据本发明的光纤探头示意图。

图2是依据本发明的内窥镜末端放大视图。

图3A，3B和3C演示了正常结肠细胞的细胞单层(R＝0.46)，T84细胞(R＝0.38)，(C)硫酸钡漫射板(R＝1.0)的反射光谱。

图4表示从图3A和3B的数据推得的核大小分布，分别是正常结肠细胞，和T84细胞。在每个情况中，实线是从数据中得到的分布，虚线是用光学显微镜测得的分布。

图5A，5B和5C分别是从Barretts食道获得的，对正常部位(实线)，异常结构部位(虚线)和模型(粗实线)的漫反射反射光谱；对应的细微结构；和产生的核大小分布。

图6图示说明比较用标准病理学方法和依据本发明的光学方法分析的样品。

图7是依据本发明用于体外组织分析的系统。

图8是演示依据本发明实施组织光学分析方法的流程图。

图9是含氧的(细线0)和脱氧的(粗线)血红蛋白的摩尔消光系数谱(单位血红素)。显示在415，542和577nm(含氧血红蛋白-HbO₂)及在430和555nm(脱氧血红蛋白-Hb)的特征峰值。

图10是递减散射横断面光谱σ’(λ)，使用Mie理论计算。表示出四种不同直径的结果，d_s(0.2，0.6，1.0和2.0μm)。光谱的斜度与直径反比。假定散射微粒的折射指数为1.4，环境介质为1.36。

图11表示在相应四种不同Hb浓度：(a)0.0mg/dl，(b)50mg/dl(C)125mg/dl(d)250mg/dl下，在物理组织模型(粗线)上测得的漫反射光谱。也显示了使用在制备物理组织模型中应用的相同光学参数的分析模型预测图(细线)，分析模型与组织模型之间吻合的很好。

图12表示典型正常组织的和腺瘤息肉的光谱(粗线)，及对于使用模型数据的最佳模式(细线)。Mie理论用来近似计算模型使用的递减散射系数(见图13)。

图13表示从图12中显示的数据中得到的散射光谱(细线)，使用Mie理论的最佳模式(粗线)。Mie理论模式将有效散射体大小d_s赋值给递减散射光谱。与正常粘膜(d_s＝1.5μm)相比，息肉的特点是有效散射体尺寸较大(d_s＝0.35μm)。

图14A-D表示从下列数据分析获得的参数：(A)总Hb浓度，C_Hb(B)Hb氧饱和度，α(C)有效散射体密度，P_s(D)有效散射体大小，d_so观察到的正常粘膜(方块)和腺瘤息肉(星形)之间最大的区别是总Hb浓度。

图15是总Hb浓度C_Hb对有效散射体大小d_s的二元标绘图。正常粘膜的数据趋于形成完好确定的数据簇，而腺瘤息肉的数据标记变化范围较宽。

本发明的前述内容及其他目的，特性和优势，在下面对本发明的较好具体实施的更具体的描述中会更清楚，如在所附示图中显示的，其中同样的参考特性在不同考察过程中表示相同的部分。示图没有必要按比例，其重点是在演示本发明的原理上。本发明的详细叙述

本发明的一个较好具体实施涉及使用光纤系统输送和收集从有关区域来的光，检测表面层的一种或多种物理特性。这样的系统如图1所示。这个系统可以包括光源50如宽带光源，光纤装置10输送和/或收集从组织来的光，监测器系统80监测从组织来的散射光，有存储器122的计算机120分析及储存监测到的光谱，和显示器124显示测试结果。透镜60可用来将从光源50来的光连接到探头10的激励光纤30中。滤片110和透镜系统90，100可用来将收集光有效地连接到光谱摄制仪70。与时钟50和脉冲器150连接的控制器140控制光源50。

探头10的末端15在图2中显示，其中中间激励光纤30被六条外围收集光纤20包围。装置的末端可包含在光罩25中，如在美国专利No.5,199,431中所描述的，其全文参考收入本篇。可以使用的其他内窥镜检查装置如光针，如在上述参考专利中所描述的，或如在美国专利No.5,280,788中所描述的，其全文也参考收入本篇。

为了提供所需的测量材料的收集角度，收集光纤20较好地具有数值孔径范围为0.05到0.22。这样有助于减少从散射光谱中移出且不损失定期组成的背景光。

收集光纤还可以由末端安装影像传感器35如电荷耦合装置或CMOS造影器替换或补充，传感器是像元(pixellated)结构的，对包含在记录的散射光谱中的不同颜色敏感。有关使用末端安装传感器的其他详细材料可在1996年11月12日提交的美国序列No.08/754,509中找到，其全文参考收入本篇。

用这个系统收集的反向散射光可分析确定上皮组织的某些物理特性。收集光和使用这种光确定的物理特性之间的关系在下面描述。

上皮细胞核可被表示为类球状Mie散射体，其折射指数比周围细胞质的高。正常细胞核的特征直径是l＝4-7μm。相反，异常结构细胞核大小有20μm，占据几乎全部细胞体积。这样，在可视范围内，波长λ＜＜1，由细胞核散射的光组成会表现出波长定期性，其清晰度取决于细胞核大小的分布。可使用Van de Hulst近似法描述细胞核的光散射横断面： ${\mathrm{\σ}}_s(\mathrm{\λ},1)=\frac{1}{2}{\mathrm{\π}1}^2\⟨1-\frac{\sin (2\mathrm{\δ}/\mathrm{\λ})}{\mathrm{\δ}/\mathrm{\λ}}+{\⟨\frac{\sin (\mathrm{\δ}/\mathrm{\λ})}{\mathrm{\δ}/\mathrm{\λ}}\⟩}^2\⟩----\left(1\right)$ 其中δ＝πln_C(n-1)，n_C是细胞质的折射指数，n是细胞核相对于细胞质的折射指数。

当一束光照射到组织的上皮细胞层上时，这束光部分从上皮细胞细胞核反向散射，而剩余部分穿过到较深组织层中，它经过多重散射变成随机的。所有这些没有被组织吸收的漫射光最终返回到表面，再一次穿过上皮细胞层，它再一次被细胞核散射。这样，产生的光包括大量漫射背景光加上从上皮层内细胞核正向散射的和反向散射的光的组成。对于含有大小分布为N(1)的细胞核[单位面积(mm²)和核直径(μm)单位间隔的细胞核数]的薄层上皮组织，光学探头以可接受的固定角度Ω_C收集的反射系数R(λ)的传递方程的近似解由下列表达式表示： $\frac{R\left(\mathrm{\λ}\right)}{R\left(\mathrm{\λ}\right)}=e^{-r\left(\mathrm{\λ}\right)}+1-\frac{e-r\left(\mathrm{\λ}\right)}{I_d{(\mathrm{\λ},s)}_{{\mathrm{\Ω}}_c}}\⟨I_i(\mathrm{\λ},-s^{\′})p(\mathrm{\λ},s,-s^{\′}){\⟩}_{{\mathrm{\Ω}}_i}+{\⟨I_d{(\mathrm{\λ},s^{\′})}_2\mathrm{\π}\⟩}_{{\mathrm{\Ω}}_c}---\left(2\right)$ 其中I_i(λ，s)是以固定角度Ω_i输送的射入光的强度，I_d(λ，s)是从下层组织产生的光的强度，对于任何I(s)项和固定角度Ω

，s是从组织表面以任意方向指向外的单位矢量。

的量是漫射背景的反射率。光学距离和散射相函数

都取决于N(1)；对于球体，p(λ，l，s，s¹)由Mie理论确定。方程式(2)中的第一项描述了漫射背景的衰减，括号中的项分别描述了上皮细胞核对射入光的反向散射和对漫射背景光的正向散射。

对于小Ω值，方程式(2)中的正向散射项可到展开成为τ(λ)，这样，

其中

。数值上发现f₁＜＜f₀并且f₀和f₁近似与有关范围(λ_min＝360到λ_max＝685nm)的波长无关。同样地，对于反向散射项

。可注意到在正向散射组成中一次项与τ(λ)同相振荡，如光学定律所规定的，而对于反向散射组成它是异相的。这样，方程(2)简化成 $\frac{R\left(\mathrm{\λ}\right)}{\stackrel{\‾}{R}\left(\mathrm{\λ}\right)}=e^{-\mathrm{\τ}\left(\mathrm{\λ}\right)}+(1-e^{-\mathrm{\τ}\left(\mathrm{\λ}\right)}\⟨f_1+b_0+\left(f_{1-b}\right)\frac{\mathrm{\τ}\left(\mathrm{\λ}\right)}{{\mathrm{\τ}}_0\left(\mathrm{\λ}\right)}\⟩----\left(3\right)$ 方程显示上皮细胞核将定期细微结构组成引入到与波长有关的反射率中，与相应的散射横断面的反射率相似。其定期性与核直径成近似比例，其幅度随上皮细胞层中细胞核的数量和大小的变化而变化。这些量可通过分析反射率R(λ)确定。

作为方程式(2)所表示的结果的实例，测量并分析从正常T84肿瘤人类结肠细胞单层(分别为10和12部位)散射的弹性光。这些细胞约15μm长，在缓冲液中粘贴在玻璃片上，并放置在硫酸钡(高反射的)漫射板上。硫酸钡板用来近似计算下层组织的漫反射率。正常细胞核的直径通常范围在5到7μm，而肿瘤细胞在7到16μm。

光学纤维探头用来将白光从氙弧光闪光灯输送到样品，并收集返回反射信号，如图1所示。探头顶端，直径1mm，由被六条收集光纤包围的中心输送光纤构成，所有这些由1mm厚的石英光罩覆盖。光纤是200μm的核心熔融石英，NA＝0.22(Ω_i＝Ω_c＝πNA²)。为了消除镜面反射，探头对正常组织倾斜17度。在邻近端，收集光纤排列成直线并在光谱摄制仪的输入口上成像。二极管阵列监测器记录从360到685nm的反射光谱。

图3A和3B分别表示正常组织和T84肿瘤细胞样品校正反射率R(λ)/ R(λ)。光谱特征的不同是显然的。为了作比较，硫酸钡板自身的反射光谱在图3C中演示。这个光谱缺少结构并没有表现显著特征。

为了从反射率数据中获得有关核大小分布的信息，方程式(3)需要转换。核大小分布N(l)，可从光距离τ-τ₀≌(1-R(λ))/q的定期组成的傅立叶(Fourier)变换中获得。参数q＝1-b₀-f₀+(b₁-f₁)与正向和反向散射有关，并与探头几何形状，射入光的角度分布和反射光有关。在这个具体实例中q≈0.15。通过引入有效波数k＝2πn_c(n-1)/λ-k₀，和k₀＝2πn_c(n-1)/λ_max，k＝27πn_c(n-1)<λ_min ^-1-λ_max ^-1>我们可以获得

    k₀＝27πn_c(n-1)/λ_max，k＝2πn_c(n-1)<λ_min ^-1-λ_max ^-1>(4)

方程式(4)用来分析数据。为了排除乱真振荡，通过用高斯滤过函数褶合进一步处理N(l)。图4中的实线表示从图3A和3B推得的正常组织和T84细胞单层样品的核大小分布。使用核-对-细胞质相对折射指数n＝1.06，细胞质折射指数n_c＝1.36。虚线表示通过光显微镜形态测得的对应大小分布。大小分布可以用高斯分布近似计算。参数在表1中列出。对于正常组织和T84细胞样品，测得的大小分布与推得的吻合的很好。

                             表1

                正常细胞              肿瘤T84细胞

	平均直径(μm)	标准偏差(μm)	平均直径(μm)	标准偏差(μm)
					显微镜检测	≈6	≈0.5	10.2	2.0
光谱检测	6.2	0.45	10.1	2.2

在胃肠内窥镜检查期间，人类受试体食道和结肠粘膜的漫反射中的定期细微结构可以测得。在Barretts食道情况中，其中上皮层包括胞单层柱状细胞，与使用在细胞培养试验中的相似，如在细胞培养研究中一样收集数据。光纤探头插入到内窥镜活组织检查槽中，并实施与组织表面接触。本文所描述的方法也可用来检测其他GI组织的结构特性，如在腹腔，子宫，膀胱内的组织和皮肤。

细微结构组成，其是细胞核的散射信号，一般少于整个信号的5％，并且一般被从下层组织来的漫反射背景光掩蔽，由于吸收和散射，其自身表现出光谱特性，如图5A中所示。它的光谱特性被典型的血红蛋白和胶原质散射吸收带占据。为了观察到细微结构，这个背景必须排除。吸收带长度，μ_a ^-1，范围从0.5到250mm随波长的变化而变化，有效散射长度(μ_s’)^-1范围从0.1到1mm。这样，在减去或排除背景信号时，散射和吸收不得不都考虑。

为了表示背景光照射在组织上的光假定是指数递减的，在任何给定的深度，z，一定量的与消减散射系数μ_a成比例的光被散射回表面并进一步指数递减。因为光的递减取决于散射和吸收，所以递减系数假定是吸收系数μ_a和有效散射系数的μ_a ^(e)＝βμ_s’的和。参数β通过比较Monte Carlo仿真和更精确的光输送模型来确定，得到β＝0.07。因为光仅穿透到组织中1mm，所以大多数漫反射返回的光被限制在粘膜层。

因此组织表示为两层介质，忽略从低层漫反射回的光。那么可获得有关撞击在上皮细胞层的从下层组织漫射的光的近似表达式： $I_d(\mathrm{\&lambda;},s)=F\left(s\right){\&lang;I_i(\mathrm{\&lambda;},s)\&rang;}_{{\mathrm{\&Omega;}}_i}\frac{1-\exp [-{\mathrm{\&mu;}}_x^{\left(e\right)}+{\mathrm{c\&mu;}}_{0}L]}{1+c({\mathrm{\&mu;}}_a/{\mathrm{\&mu;}}_s^{\left(e\right)})}----\left(5\right)$ F(s)是Lambertian(亮度)函数表示从粘膜层产生的光与角度的关系，L是表示粘膜层厚度的参数，c，是血红蛋白的浓度，我们发现与胶原质相比它是主要的吸收体，它是光散射的主要原因。因为含氧和脱氧血红蛋白都存在，所以总的血红蛋白吸收作用表示为 其中氧饱和度参数为α(0≤α≤1)。

图5A表示从两个Barretts食道组织部位得到的反射光谱，两个都独立地用标准病理学分析诊断显示(1)正常的(2)癌症前期(即低等级异常结构)。如可以看到的，在这些未处理的光谱中区别很小。为了分析它们，通过改变参数c，α和L，方程式(5)首先适合数据的主要特性。如在图5A中所看到的，结果模型相当精确。通过计算R(λ)/R(λ)排除这种漫射背景结构后，定期细微结构在图5B中表示出来。可以注意到从异常结构部位得到的细微结构比从正常部位得到表现出较高频率内容。然后使用方程式(4)推得各自的核大小分布，得到图5C。正常组织和异常结构组织部位的区别很明显。从异常结构部位获得的细胞核分布比从正常部位获得的要宽的多，并且峰值直径从约7μm移到约10μm。此外，大细胞核(＞10μm)的相对量和细胞核的总量都显著地增加了。

根据计算机的分析，推算核大小数据的上述方法的不确定性估计为5％到30％，取决于噪音水平和模型的精确性。对正常的细胞核和异常结构细胞核使用相同的折射指数计算分布。这一点不是完全正确的，因为在染色的组织断面中异常结构细胞核表现出过度染色，这可能说明折射指数增加了。这样，从异常结构部位测得的分布中的大细胞核的相对量可能有点过高估计了。

能检测活体中核大小分布，在临床医学应用中具有很大价值。扩大的细胞核是癌症，异常结构和细胞再生的最初表现。此外，对不同大小细胞核的检测能提供有关存在具体细胞的信息，这样能起到，如作为生物组织发炎反应的一种指示。这说明粘膜层中不同的形态/病理状况产生了核分布的不同模式。

已发现的对区分Barretts非异常结构和异常结构上皮组织有用的物理特性是细胞核的总量和大细胞核(1＞10μm)的百分比。因此，比较对样品的病理分析和光学分析可以得到图6中的示图(细胞核总量对直径大于10μm的细胞核的百分比)。从50个部位获得的，对于这个分析的累积灵敏性和特异性，分别是83％和100％。这项研究的正预测值(positive predictive value)是100％。由n’s表示的点是正常的或是发炎的，由d’s表示的点是异常结构的。范围20-30％的百分比发现是对这种类型的精确诊断，25％使用在这个具体实例中。

用来收集从激励组织样品反向散射光谱数据的，使用光谱摄制及电荷耦合装置(CCD)，CMOS或其他集成固体造影阵列的光谱摄制系统300的较好具体实施在图7中演示。

系统300可使用宽带光源或可调激光314来照射样品46。光源314产生光束316，光束用镜子318定向，通过聚焦镜片320将光束撞击在安装在散射底物325上及透明窗321之后的样品46上。光束以射入角聚焦在样品上。收集角330可以通过光孔径或瞄准仪确定，在2度和12度之间，较好地在3度和8度之间。

部分由样品46发出的散射光322被收集镜片324相对于射入光小的角度收集。在另一个较好的具体实施中射入光和收集光角度能沿用单一共同的轴。收集镜片324为光谱摄制仪310瞄准及F/调配收集光。在进入光谱摄制仪310入口狭缝之前，收集光穿过一组消减收集光中不需要的散射组成的滤片326。

图8演示了对从有关材料如组织获取的散射光谱收集及分析的一般处理过程400。这种方法可以使用显微镜系统或使用如图7所示的彩色造影系统在体外实施，或在患者体内实施。从光源来的照射光402可使用辐射光范围300nm-200nm，包括红外线范围。收集404和监测406辐射光之后，可以排除漫射背景光408并计算所需特性。这些结果可用来对有关区域进行诊断。

本发明的一个较好具体实施是根据具有固定输送和收集几何形状的光学纤维探头收集的数据，使用一种分析方法。数据分析采用光漫射，或更直接地使用模型来分析组织光谱，在漫反射光谱和包括散射和吸收体的具有已知光学特性的物理组织典型之间建立一致性。通过使用分析公式分析从这种组织模型获得的光谱，提供简单转化及精确预测散射体和吸收体浓度的校准系统。一旦这种校准系统建立，这个方法就适用于组织光谱。

下面涉及对体内组织粘膜表面使用光谱分析。在这个实例中检测的是腺瘤结肠息肉，结肠癌的前体。这些息肉是结肠异常结构的一种形式，组织上类似于视觉上不可检测的平坦异常结构，但可容易地检测出来。与标准组织学试验相关的结果，可用于疾病的早期检测，最重要的是，示例了怎样能在体内使用这种光谱摄制方法来获得形态学和生化信息。

对13个患者实施常规的结肠内窥检查，体内收集从腺瘤息肉来的漫反射光谱。数据与多-激励荧光光谱同时收集：使用脉冲持续时间10μs平均输入能量4Ji/脉冲的氙弧光闪光灯作为白光光源。造影光谱摄制仪分散收集的光，使用门二极管阵列监测器作光谱范围在360-685nm的光监测。使用与灯脉冲同步的12μs门最小化内窥镜检查照射来的背景光。监测器由笔记本电脑控制，数据在其中转换及储存。

使用光学纤维探头输送及收集光，探头通过结肠内窥镜的附件槽前置，并实施与组织接触。探头包括用于光输送的中心光纤，被六条用于光收集的同中心光纤包围着。所有光纤核心直径200μm，NA＝0.22。探头顶端安装有石英光罩长和直径约1.5mm，其用统一的圆形输送及收集点，以重叠锥形形式，半径分别约为r_d＝0.35mm和r_c＝0.55mm，提供固定的输送/收集几何形状。顶端以角度17度倾斜，以消除从光罩/空气界面来的不需要的反射光谱。

20％体积比硫酸钡粉末悬浮液的漫反射光谱用作参考，以考虑氙灯的光谱特性和总强度。探头浸入到悬浮液中，在收集每个数据组前记录参考漫反射光谱。通过用这种参考光谱划分校准组织光谱。在每个腺瘤息肉的几个不同部位及在周围正常粘膜上相应部位测得漫反射光谱。为了避免运动产生的人为影响，使用单一脉冲激励。然后将息肉移出并作组织检查，而正常粘膜部位不作活组织检查。

为了表示漫反射系数，生物组织近似作为均匀半无限混乱介质，递减散射及吸收系数分别为μ_s’(λ)和μ_a’(λ)(λ是光的波长)。部分射入光被组织吸收，而未被吸收的部分经过多重散射，最终从表面作漫反射产生。用探头收集一定量的返回光，而余留部分逃逸光未被检测。收集光的量取决于光学特性μ_s’(λ)和μ_a’(λ)，也取决于探头直径r_P。因为r_P是限定的，它作为衡量长度，使μ_s’(λ)和μ_a’(λ)分别得到确定。

为了描述由光学探头收集光的特点，需要确定组织表面上漫反射的空间和角度的知识。使用造影方法实施辐射转换方程漫射近似计算法，在从半无限混乱介质的表面上的光射入点的r距离上，漫反射半径密度，R(λ，r)表示为： $R(\mathrm{\&lambda;},r)=\frac{Z_0{\mathrm{\&mu;}}_s}{4\mathrm{\&pi;}{\mathrm{\&mu;}}_s+{\mathrm{\&mu;}}_s}\{(\mathrm{\&mu;}+\frac{l}{r_1})\frac{e^{-{\mathrm{\&mu;r}}_1}}{r_1^2}\&divide;(1+\frac{4}{3}A)(\mathrm{\&mu;}+\frac{1}{r_2})\frac{e^{-{\mathrm{\&mu;r}}_2}}{r_2^2}-----\left(6\right)$ 其中 $\mathrm{\&mu;}={\left({3\mathrm{\&mu;}}_a({\mathrm{\&mu;}}_a-{\mathrm{\&mu;}}_s^{\&prime;})\right)}^{1/2},z_0\frac{1}{{\mathrm{\&mu;}}_s^{\&prime;}+{\mathrm{\&mu;}}_a}$ $r_1={(z_0^2+r^2)}^{1/2},r_2={(z_0^2{(1+\frac{2}{3}A)}^2+r^2)}^{1/2}$ 参数A取决于介质的折射指数n(n＝1，A＝1；n＞1，A＞1)。对结肠组织的平均折射指数的合理假定是n≌1.4，则A≌3.2。

为了得到由探头收集光的总量，方程(6)必须对半径分别为r_d和r_c的输送及收集面积的整个空间延伸积分。假定在整个输送面积的射入光强度是统一的，由探头收集的漫反射系数R_p(λ)表示为： $R_0\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=\frac{1}{r_d^2}\underset{0}{\overset{r_c}{\&Integral;}}\mathrm{rdr}\underset{0}{\overset{2\mathrm{\&pi;}}{\&Integral;}}\mathrm{d\&Phi;}\underset{0}{\overset{r_d}{\&Integral;}}R(\mathrm{\&lambda;},\stackrel{\&OverBar;}{r}-\stackrel{\&OverBar;}{r})r^{\&prime;}d{r}^{\&prime;}----\left(7\right)$ 其中|r′|＝(r²+r²-2rr′cosΦ)^1/2。

方程式7的积分可数值上估计。然而，为了得到R_p(λ)简化解析表达式，我们假定尖端输送光(r_p＝0)半径r_c圆形一圈点收集光，那么我们得到： $R_p\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=2\mathrm{\&pi;}\underset{0}{\overset{r_c}{\&Integral;}}R\left(r\right)\mathrm{rdr}$ $=\frac{{\mathrm{\&mu;}}_s^{\&prime;}}{{\mathrm{\&mu;}}_s^{\&prime;}\&divide;{\mathrm{\&mu;}}_a}\{e^{-{\mathrm{\&mu;z}}_0}\&times;e^{-(1+\frac{1}{3}A{)}_{{\mathrm{\&mu;a}}_0}}-z_0\frac{e^{-{\mathrm{\&mu;r}}^{\&prime;}}}{r_1^{\&prime;}}-(1+\frac{4}{3}A)z_0\frac{e^{-\mathrm{\&mu;}{r}_2^{\&prime;}}}{r_2^{\&prime;}}\}----\left(8\right)$ 其中 $r_2^{\&prime;}={(z_0^2+r_c^2)}^{1/2},r_2^{\&prime;}={(z_0^2{(1+\frac{2}{3}A)}^2+r_c^2)}^{1/2}$

通过在已知特性的物理组织模型上校准方程式8确定r_c的最优值。使用方程式8的优点是它比方程式7更容易转化，方程式7需要数值积分。方程式8给出组织表面垂直方向的漫反射系数。因为由探头收集的光的方向与表面垂直方向最大偏差仅约10度，所以这一点是可以接受的。

方程式8可用来分析由探头收集的光谱的漫反射系数。在对组织光谱的检测中，血红蛋白是光谱可视范围内在结肠组织中唯一显著的光吸收体，并且以含氧和脱氧的形式都测得。两种形式的光吸收特性已作了研究，它们的摩尔消光系数谱∈_Hbo2(λ)和∈_Hb(λ)在图9中演示。含氧血红蛋白吸收作用在415nm最大，两个第二大值在524和577nm，而脱氧血红蛋白在430nm最大，仅有一个第二大值在555nm。总吸收系数μ_j(λ)表示为： ${\mathrm{\&mu;}}_u\left(\mathrm{\&lambda;}\right)=2.3C_{\mathrm{hb}}^{\&prime;}({\mathrm{\&alpha;\&epsiv;}}_{{\mathrm{hbo}}_2}\left(\mathrm{\&lambda;}\right)+(1-a){\mathrm{\&epsiv;}}_{\mathrm{hb}}\left(\mathrm{\&lambda;}\right))----\left(9\right)$ 其中 是Hb氧饱和度参数，C_hbo2和C_Hb分别是含氧和脱氧Hb的浓度，C’_hb＝C_hbo2+C_HbHB的总浓度。

用下列方法确定C_Hb和α。对于给定组织光谱，R_p(λ)，指定初值(通常C_Hb＝0.0，α＝0.5)。然后将方程式8数值转化得到μ_s’(λ)，其表现出HB吸收作用的残留光谱特性。然后修正参数C_Hb和α，这个过程递归重复直至μ_s’(λ)显示出没有Hb光谱特性的平滑谱形。用这种方法，μ_s’(λ)与C_Hb和α同时确定。

                             表2

模型参数	正常	腺瘤息肉
			总Hb浓度CHb(mg/dl)	13.6+-8.8	72.0+-29.2
Hb氧饱和度α	0.59+-0.08	0.63+-0.10
			有效散射体密度ρs(×108mm-3)	9.2+-7.5	3.5+-4.0
有效散射体大小ds(mm)	0.56+-0.18	0.94+-0.44

上面的方法是基于假设μ_s’(λ)是波长相对平滑的函数，其分析有效，将成为下面讨论的根据。通常，μ_s’(λ)是组织多种散射体的总贡献。不幸的是，有关那些个体散射体的详细信息没有获得。这样，μ_s’(λ)可表示为：

          μ_s(λ)＝ρ_sσ(λ)    (10)其中ρ_s是有效散射体密度，σ’(λ)  是有效递减散射横断面，即组织散射特性以平均方式模拟，即如组织包含单一明确定义的类型的散射体。通常，σ’(λ)  取决于折射指数，散射体的形状和大小，以及环境介质的折射指数。对于直径d_s的球状散射体，可采用Mie散射理论数值计算σ’(λ)  。

图10表示这样计算的σ’(λ)。可注意到σ’(λ)  倾斜度与d_s简单相关，即倾斜度与散射体大小成反比。用这种方式，对每个σ’(λ)赋值散射体大小是可能的，从而在d_s＝0.2-2.0μm范围内对每个μ_s’(λ)赋值散射体大小。如，通过检查正常结肠粘膜的μ_s’(λ)，根据体外检测的预先记录，可以看到它们对应散射体大小d_s＝0.35μm。一旦d_s确定，密度ρ_s可通过用μ_s’(λ)除以σ’(λ)得到。总之，对每一个组织漫反射光谱都得到四个参数C_Hb，α，ρ_s和d_s。

在计算图10中所示的结果中，散射体和环境介质折射指数假设与在组织中可能确定的折射指数相同。对散射体合理的近似值是折射指数约1.4，对环境介质是约1.36。通过指出由水的折射指数所定的组织折射指数低限，在可视范围约为1.33，以及记录的软组织最大折射指数所定的高限，约1.45，这些值可得到证实。这些值与通常对软生物组织观察得到的数据相符。

物理组织典型可作为证实演变方程式8中产生的各种近似算法的可行性的一种方法。样品包括各种浓度的含Hb的球状微粒的混合物。建立的模型使混合物模拟组织样品的光学特性。此外，建立了分析模型在光学特性方面的有效性范围，以及参数r的最佳值，方程式8被确定。

在去离子水中的聚苯乙烯珠悬浮液(聚合科学，公司)用来模拟组织的光散射，从冻干人类Hb(Sigma，H0267)制备的Hb溶液用来模拟吸收作用。采用Mie理论计算珠的散射特性。珠直径是1.07μm，聚苯乙烯折射指数n_p从表达式n_p＝15607+10002/λ²(26)，(λ是nm)得到，聚苯乙烯浓度是0.625％体积比。递减散射系数在400nm从约1.7mm^-1变化。这种光谱曲线与图10中所示的d_s＝1.0μm的曲线相似，不同的是由于聚苯乙烯的折射指数较大，所以倾斜度较大。

因为聚苯乙烯的光吸收作用在可视范围内可以忽略，所以吸收作用仅仅归因于含氧血红蛋白。物理组织模型约3×3×0.5cm，模拟正常结肠粘膜的平坦几何形状。其他几何形状也作了研究，如1cm高0.5cm直径的柱状几何形状，模拟息肉的几何形状，但没有发现显著的光谱区别。使用的光学参数范围是根据体外实施的结肠组织光学参数预先记录的独立测量选取的。

图11表示不同浓度的Hb下物理组织模型上测得的漫反射光谱与分析模型所预测的相比，预测结果是通过设定方程式3中r_c＝0.45mm获得的。这被认为是r_c的最佳值，在整个数据分析过程中保持固定。还发现参数Z₀＝1/(0.6μ_d+μ_s’)提高了分析模型和物理组织模型数据之间的吻合，特别对于吸收值大的情况。在图11中所示的物理组织模型光谱与在下面显示的组织光谱非常相似。这个事实间接证实了在演变模型中所作的有关组织散射体(模拟作微粒)和组织吸收作用(归因于Hb)的假设。

对于在有关的生理学范围内的Hb浓度，发现分析模型精确地预测了物理组织模型光谱。对于Hb浓度低于100mg/dl的情况，两个模型之间的偏差在整个波长范围内一直小于10％。最大的偏差出现在当吸收作用变得与散射作用可比的时候。这显示在图11的曲线(d)中，邻近Hb吸收作用的峰值，约415nm处。这时Hb的浓度是250mg/dl，在415mm处对应吸收系数约5mm^-1，而在相同的波长下散射系数为约2.8mm^-1。

图12表示从一个腺瘤息肉部位和一个正常粘膜部位获取的典型漫反射光谱。可容易地观察到显著光谱区别，特别在光谱的蓝光区域，其中在约420nm处的Hb吸收波谷是光谱的显著特征。这个波谷在息肉光谱中特别显著，其还显示出从光谱的红光区域(约700nm)开始向绿光区域(约500nm)强度持续降低，而在正常粘膜光谱的相同区域表现出强度稳定增加。含氧血红蛋白的第二吸收波谷(542和577nm)在腺瘤息肉光谱中也非常显著，显示增加的Hb浓度。依据模型分析，正常粘膜光谱的特点是Hb浓度C_Hb＝22.5mg/dl，而腺瘤息肉的相应值为约6倍高(C_Hb＝165mg/dl)。发现的Hb饱和度分别为0.65+-0.05和0.55+-0.05。

图13表示从图12中所示的数据计算出的散射光谱μ_s’(λ)，以及最佳Mie理论模型。在光谱中观察到的两种组织类型之间光谱的主要区别是倾斜度，其对应不同的预先散射大小，对于息肉d_s＝1.5μm，对于正常粘膜d_s＝0.35μm。确定的散射体密度值，正常粘膜为ρ_s＝1.5×10⁸mm^-3，腺瘤息肉为ρ_s＝1.3×10⁸mm^-3。图12还显示使用方程式8适合数据的最佳分析模型。尽管存在两种组织类型间光谱形状的显著区别，及μ_s’(λ)是通过假定球状散射体均匀分布近似计算的事实，模型还是精确地描述了数据。数据和模型之间的偏差对于大部分波长范围一般小于10％。

图14A-14D表示对所有研究的组织部位四个参数的计算值：(A)Hb总浓度C_Hb(B)Hb氧饱和度α(C)有效散射体密度ρ_s(D)有效散射体大小d_s。腺瘤息肉明显特点是增加的Hb浓度，而在Hb氧饱和度方面没有可观察到的不同。虽然两种组织类型间这些参数分布有显著重叠，在腺瘤息肉中有效散射体密度一般较低，有效散射体大小较大。表2总结了图14A-14D中所示的结果，并给出了每个参数的平均值和标准偏差。

图15表示Hb浓度C_Hb对有效散射体大小d_s的标绘图。将两组参数一起显示，是为了总结和演示在结肠中正常粘膜和腺瘤息肉的散射和吸收特性中发现的区别。可注意到的，对于有效散射体大小和Hb浓度，正常粘膜数据趋于形成簇，而腺瘤息肉数据分散，特点是广泛分散不规则分布。

根据漫反射测量，提供有关体内结肠粘膜组织定量信息的方法已作了描述。这种方法的主要组成是(a)用有固定输送/收集几何形状的光纤探头收集数据，(b)根据光漫射进行数据分析的分析模型，(c)校准分析模型的物理组织模型。

使用有固定几何形状的光学探头能使数据收集一致，并分别确定散射和吸收。造型探头几何形状可通过使用参数r_c变得更为方便，其也可限定探头对吸收的敏感性。r_c大的探头与r_c小的探头相比会使得收集的光谱对组织吸收作用更敏感。在图4中，在正常粘膜的光谱中几乎不能看到Hb第二吸收峰值：r_c大的探头会使这些特征更显著。

分析漫射理论模型适合于数值上转化，并在由聚苯乙烯珠和含氧血红蛋白的物理组织模型上校准后成功地描述了组织数据。其他研究者已经使用了本文所描述的分析模型的变通体，研究IR范围内物理组织模型和组织的漫反射。据我们了解，本研究是第一个在可视范围内，对用光纤探头测得的从人类粘膜组织获取的体内数据使用该模型。在可视范围内实施而不是在IR范围，光穿透限制在约0.5mm，即癌症前期变化出现的粘膜层。使用这种模型，我们已经显示可能获取有关所研究组织的定量信息，如Hb浓度，Hb氧饱和度，有效散射体大小和有效散射体密度。结果显示漫反射为定量分析体内粘膜组织表面提供了一种工具。

在模型中作的基本近似是，在光谱的可视范围内在结肠粘膜中Hb是唯一的显著吸收体，虽然这种假定缺少直接证实，但数据有力地表现出Hb吸收作用特征的事实，清楚地说明Hb是主要的吸收体。此外，在组织物理模型上测得的光谱中Hb是唯一的吸收体，非常类似组织光谱。

用同样的方式，组织散射被模拟为是由于已知折射指数的均匀球状散射体的散射。这种近似使得可以定量描述量两个基本参数，有效散射体大小和有效散射体密度。这些参数提供了平均散射特性评估。在物理组模型上测得的光谱再生实际组织光谱的事实，再一次(如在Hb情况中)可作为这种近似有效性的间接证实。

数据分析显示腺瘤结肠息肉特点是Hb浓度增加。已经知道肿瘤和癌变组织表现出微脉管系统增加，从而血液含量增加。使用形态测定法和脉管铸法与扫描电子显微镜技术结合，癌症前期组织如结肠腺瘤息肉也有上面微脉管量增加的特点，与观察到有关Hb浓度增加的报告相符。结肠粘膜的微脉管增加的其他报告与Crohn疾病和溃疡性大肠炎有关。虽然我们没有研究这些组织类型，本文所用的技术可以证明对体内研究这些疾病是有用的。

对于正常粘膜和腺瘤息肉，Hb氧饱和度发现平均为约60％。这个结果是合理的，因为测量基本上是在粘膜的毛细管网中实施的，在这里氧从Hb转移到组织中。Hb氧饱和度在毛细管内下降从约97％(动脉血)到约40％(静脉血)，测量值(约60-60％)适于放在这个范围中间。在两种组织类型间没有观察到区别的事实，可能能归因于腺瘤息肉新陈代谢没有被显著改变的事实，至于解释Hb氧含量的变化，这可能涉及这样组织的扰乱的新陈代谢。本文提供的技术能用在体内进行中空器官的表面肿瘤的研究，或进行需要Hb饱和度知识的其他组织类型的研究。

可观察到两种组织类型间散射特性的内在区别。对于腺瘤息肉，与正常粘膜相比，平均有效散射体尺寸较大，平均有效散射体密度较小。有多种假设确定来自不同微结构，血管外的如胶原纤维，和血管内的如线粒体和细胞核对散射的贡献。在腺瘤息肉内，一种模型提供血管内结构对光散射的贡献是增加的，这是因为细胞占据较大的体积比例。此外，为了能贡献光散射，其中胶原质很浓密地堆积的亚粘膜，一般位于远离息肉表面的位置。只要平均血管内散射体比血管外散射体大，就可以用来解释在腺瘤息肉中较小的散射体密度。等同物

虽然本发明已参考其较好的具体实施作了具体地演示和说明，但此领域中的技术人员可以理解，在没有背离如所附权利要求界定的本发明的精神和范围的情况下，可以有很多在形式上和细节上的变通。此领域中的技术人员仅需常规试验可识别或能确定，许多本文具体描述的本发明的特别具体实施的等同物。这样的等同物包括在权利要求的范围内。

Claims (34)

1.一种检测组织层内结构大小的方法，该方法包括：

      对组织层内的有关区域进行照射；

      收集从组织来的光；

      检测收集的光；以及

      确定组织层内结构的大小。

2.根据权利要求1的方法，进一步包括确定有关区域是否包括异常结构组织。

3.根据权利要求1的方法，进一步包括使用光纤探头对组织进行照射。

4.根据权利要求1的方法，进一步包括用光纤探头收集从组织来的光。

5.根据权利要求1的方法，进一步包括确定有关区域内细胞核的平均核大小。

6.根据权利要求1的方法，进一步包括检测有关区域内组织细胞核直径。

7.根据权利要求1的方法，进一步包括检测随波长变化的从组织来的光强度的定期组成。

8.根据权利要求7的方法，进一步包括从定期组成确定组织中的细胞核的大小。

9.一种光学检测组织的方法，该方法包括：

      对被检测的组织的有关区域进行照射；

      收集从组织来的光；以及

      检测随波长变化的收集光的定期组成以确定组织的物

  理特性。

10.根据权利要求9的方法，进一步包括确定有关区域是否包括异常结构组织。

11.根据权利要求9的方法，进一步包括使用光纤探头对组织进行照射。

12.根据权利要求9的方法，进一步包括用光纤探头收集从组织来的光。

13.根据权利要求9的方法，进一步包括确定有关区域内细胞核的平均核大小。

14.根据权利要求9的方法，进一步包括检测有关区域内组织细胞核直径。

15.根据权利要求9的方法，进一步包括用内窥镜收集光，内窥镜在其末端有造影传感器。

16.根据权利要求9的方法，进一步包括从定期组成确定组织中的细胞核的密度。

17.一种确定在组织中存在异常结构的方法，该方法包括：

       对组织上皮细胞层的有关区域进行照射；

       收集从组织反向散射的光；

       用监测器监测收集的光；以及

       确定组织的有关区域内异常结构的存在。

18.根据权利要求17的方法，进一步包括确定是否有关区域包括异常结构组织。

19.根据权利要求17的方法，进一步包括收集350nm到700nm的光。

20.根据权利要求17的方法，进一步包括用光纤探头收集从组织来的光。

21.根据权利要求17的方法，进一步包括确定有关区域内细胞核的平均核大小。

22.根据权利要求17的方法，进一步包括检测有关区域内组织细胞核直径。

23.根据权利要求17的方法，进一步包括检测随波长变化的从组织来的光强度的定期组成。

24.根据权利要求17的方法，进一步包括从定期组成确定组织中的细胞核的大小。

25.一种光学检测材料的方法，该方法包括：

       对被检测的组织材料中的有关区域进行照射；

       收集从材料来的光；

       监测收集光的散射光谱；以及

       检测随波长变化的收集光的定期组成以确定材料的物

    理特性。

26.根据权利要求25的方法，进一步包括使用光纤探头对材料进行照射。

27.根据权利要求25的方法，进一步包括用光纤探头收集从材料来的光，探头光纤数值孔径在0.05-0.25范围内。

28.根据权利要求25的方法，进一步包括确定有关区域内细胞核的平均核大小。

29.根据权利要求25的方法，进一步包括检测有关区域内的单位面积的颗粒数。

30.一种光学检测组织的设备，该设备包括：

       照射在要检测组织中有关区域的光源；

       收集从组织来的光的光学系统；

       感应收集光的监测器；以及

       确定随波长变化的监测光的定期组成以确定组织物理

   特性的数据处理器。

31.根据权利要求30的设备，进一步包括产生350-700nm范围的光的宽带光源。

32.根据权利要求30的设备，进一步包括连接光源和组织的光纤探头。

33.根据权利要求30的设备，进一步包括以2到12度间的收集角度收集光的光纤探头。

34.根据权利要求33的设备，其中探头可插入到内窥镜中。

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