CN1271994C - 一种复方当归冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复方当归冻干粉针剂，它是由当归、川芎、红花提取物和药用辅料制备而成。本发明还公开了其制备方法。提取物采用酸性乙醇提取、超滤、过大孔吸附树脂除杂的方法获得。含量测定和药理实验结果表明，本发明的制备方法科学、合理，有效成分含量高，具有更好的活血通经、祛瘀止痛功效。

Description

一种复方当归冻干粉针剂及其制备方法
技术领域
本发明属中药制药技术领域，具体涉及一种复方当归冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
复方当归注射液系当归、川芎、红花三味中草药精制提炼而成的灭菌水溶液。方中当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，甘补辛散，温通而活血，行瘀消肿止痛；川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，既能活血又能行气，为血中气药，且善“上行头目，下调经水，中开郁结”；红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花蕾，味辛行散，善走心肝二经，入血能活血通经，祛瘀止痛。三药合用，共奏活血通络、消肿止痛功效。其中当归中的主要有效成分是阿魏酸，川芎中的主要有效成分是川芎嗪，红花中的主要有效成分是红花黄色素。复方当归注射液[WS-10822(ZD-0822)-2002。国家中成药标准汇编(骨伤科分册)。国家中医药管理局，2002，134]采用以下的制备方法：当归、川芎利用水煎煮，65％乙醇沉淀，再水沉的方法得到提取液；红花利用水煎煮，65％乙醇和70％乙醇两次沉淀，再水沉的方法得到提取液。水提醇沉是经典的提取分离方法，但是它有着很多的缺点：许多物质用水提取的效率非常低，乙醇沉淀物的吸附包裹作用使有效成分损失很多，除杂效率低等。使得最终用此方法得到的复方当归注射液，其中所含的指标成分阿魏酸的含量非常低，因而在临床应用中，其虽然显出一定的疗效，但是未能达到预期的治疗效果。由此看来，采用新工艺、新方法对复方当归注射液进行进一步的开发是很有必要的。
申请号为CN03118482、CN03118536、CN03118538、CN03118539的专利文献研究了当归多糖和/或阿魏酸钠的药物组合物，但都是用于镇痛的或治疗肝损伤疾病的；申请号为CN02115699专利文献公开了当归静脉注射液及其制备方法，申请号为CN93101867专利文献公开了红花注射液的制造方法，但其原料药均为单味药材，没有考虑中药的多种活性成分协同作用，因而功能主治和临床效果都受到限制。
注射液对稳定性要求高，在携带、储藏、运输时容易破碎，带来许多麻烦。
在资料检索中未发现有关复方当归冻干粉针剂的任何报道。
发明内容
我们研究人员对复方当归注射液进行了进一步的开发，制成了复方当归冻干粉针剂。在当归、川芎、红花所含的主要有效成分的理化性质的基础上，进行了多次的实验，付出了大量的劳动，找到了一种制备复方当归冻干粉针剂的方法。此方法提取效率高、杂质保留少、有效成分损失小、含量高、疗效好，因而是科学、合理的。
本发明的目的是公开上述的富含活性成分、疗效好、方便使用的复方当归冻干粉针制剂。
本发明的另一个目的是提供上述复方当归冻干粉针制剂的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现。
一、制备方法
(1)原料药材重量份配比为：当归100，川芎100，红花100；
(2)取上述重量份的当归、川芎药材，粉碎，加6-10倍量的酸性乙醇溶液提取2-3次，每次1-2小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述重量份的红花药材，粉碎，加5-8倍量的40％-80％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，高速离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用2-5倍柱体积30％-80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物1.5-6.5重量份。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入冻干赋型剂23.5-28.5重量份，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至4.5-5.5，灌装，冷冻干燥，即得。
阿魏酸在酸性条件下比较稳定；川芎嗪在游离状态下加热易升华而损失，在酸性条件下会成盐变得稳定；红花黄色素在乙醇溶液中的溶解性更好。当归、川芎用酸性乙醇溶液提取，既可以使有效成分阿魏酸和川芎嗪处于其稳定形式，有很高的提取率，而且可以大大减少杂质的量，为后续的除杂带来方便；用合适的超滤膜超滤，小分子有效成分可以顺利通过滤膜，而大分子的树脂、淀粉、黏液质、鞣质等杂质被截留，从而除去了大量的杂质；利用活性成分与其它非活性成分在大孔吸附树脂上保留特性的差异，利用大孔吸附树脂对其进行进一步的纯化。
二、复方当归制剂中阿魏酸的含量测定分析
本发明复方当归冻干粉按上述制备方法制成；复方当归注射液按[国家中成药标准汇编(骨伤科分册)。国家中医药管理局，2002，134]中的制法制成；均由广东天之骄药物开发有限公司提供。当归、川芎和红花药材均选用市购的同一批药材。
测定方法：取本发明复方当归冻干粉针剂5支，精密称定，用25ml水溶解，以下按照复方当归注射液(WS-10822(ZD-0822)-2002)[国家中成药标准汇编(骨伤科分册)。国家中医药管理局，2002，134]标准中含量测定项下方法进行。测定结果见表1。
                   表1制剂中阿魏酸含量测定结果
批号            阿魏酸含量(μg/支)
  复方当归注射液*   本发明复方当归冻干粉针剂
  12345   22.628.235.827.433.7   73.275.279.773.371.6
注：复方当归注射液(WS-10822(ZD-0822)-2002)[国家中成药标准汇编(骨伤科分册)。
国家中医药管理局，2002，134]标准中含量测定项下规定每支含阿魏酸不得少于15.0μg。
以上含量测定结果，本发明复方当归冻干粉针剂中指标成分阿魏酸的含量远远高于复方当归注射液中阿魏酸的含量。说明本发明的制备方法科学、合理、更具有实用性。
三、药理实施例
以下药理实验购买的复方当归注射液由宁波天真制药有限公司生产；本发明复方当归冻干粉针剂由广东天之骄药物开发有限公司提供。
1.对小鼠缺氧耐力的影响实验
实验方法：取健康昆明种小鼠30只，体重20～24g。随机分成对照组、复方当归注射液组、本发明复方当归冻干粉针剂组(简称：本发明组)。每组10只，雌雄各半，分笼饲养。以人常规治疗剂量折算为小鼠的剂量。折算公式为：待测动物试用剂量＝已知动物给药量×待测动物的体表面积比值/已知动物的体表面积比值。对照组给生理盐水，1次/天，连续6天。于末次给药后1小时，将小鼠分别置于体积为150ml磨口瓶中，内放15g钠石灰，密闭观察其存活时间。结果见表2。
               表2对小鼠常压缺氧的影响(X±SD)
  组别   鼠数(只)   平均存活时间(min)
  对照组   10   17.84±3.46
  复方当归注射液组   10   28.72±2.93*
  本发明组   10   34.54±2.75*#
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与复方当归注射液组比较：#P＜0.01。
本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液均能提高小鼠常压缺氧耐力，平均存活时间比对照组显著延长(P＜0.01)；本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液相比，平均存活时间也有显著差异(P＜0.01)。说明：本发明复方当归冻干粉针剂的作用强于复方当归注射液。
2.对小鼠心肌缺氧的保护作用实验
实验方法：取健康昆明种小鼠30只，体重18～22g。随机分成对照组、复方当归注射液组、本发明复方当归冻干粉针剂组(简称：本发明组)。每组雌雄各半，分笼饲养。以人常规治疗剂量折算为小鼠的剂量。折算公式为：待测动物试用剂量＝已知动物给药量×待测动物的体表面积比值/已知动物的体表面积比值。对照组给生理盐水。给药方法：1次/天，连续6天。于末次给药后1小时用乌拉坦1.2g/kg腹腔注射麻醉，背部固定，分离气管，以动脉夹夹闭气管，用心电仪观察心电，并用秒表记下小鼠夹闭气管后至心电消失的时间。结果见表3。
        表3对小鼠心肌缺氧的影响(X±SD)
  组别   鼠数(只)   平均存活时间(min)
  对照组   10   6.24±0.83
  复方当归注射液组   10   11.97±0.91*
  本发明组   10   15.14±0.62*#
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与复方当归注射液组比较：#P＜0.01
本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液均能对小鼠心肌缺氧起保护作用，平均存活时间比对照组显著延长(P＜0.01)；本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液相比，平均存活时间也有显著差异(P＜0.01)。说明：本发明复方当归冻干粉针剂的作用强于复方当归注射液。
3.对大鼠体内血栓形成的影响
将大鼠随机分成3组，每组10只，分别为对照组、复方当归注射液组、本发明复方当归冻干粉针剂组(简称：本发明组)。将各组动物给药(对照组给予等体积的生理盐水)，每日1次，连续给药6天，末次给药后1小时，将大鼠用10％水合氯醛，按0.3g/kg体重麻醉后固定，分离左颈总动脉，在血栓仪上以2mA电流刺激血管7min后，记录血栓形成时间。结果见表4。
       表4对大鼠体内血栓形成的影响(X±SD)
  组别   鼠数(只)   血栓形成时间(min)
  对照组   10   634.26±81.54
  复方当归注射液组   10   782.47±67.82*
  本发明组   10   846.33±52.43*#
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与复方当归注射液组比较：#P＜0.01
本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液都能延长大鼠体内血栓的形成(P＜0.01)；本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液相比，延长时间也有显著差异(P＜0.01)。说明：本发明复方当归冻干粉针剂的作用强于复方当归注射液
4.抗血小板聚集作用
将大鼠随机分成3组，每组10只，分别为对照组、复方当归注射液组、本发明复方当归冻干粉针剂组(简称：本发明组)。各组动物分别给药，每日1次，连续给药6天，末次给药后1小时，动物麻醉后自腹主动脉取血，抗凝剂采用3.28％枸橼酸钠，与血液以1∶9比例混合。将抗凝全血在20℃条件下1500r·min-1离心5min，获得富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)。留取定量PRP后，将剩余PRP再次以3000r·min-1离心10min，获得自身对照贫血小板血浆(platelet-poorplasma，PPP)。以PPP调节PRP浓度，使各PRP浓度相同。将PRP在37℃的恒温孔中预热后，加入ADP(终浓度为3μmol·L-1)引起血小板聚集，记录最大聚集率。结果见表5。
         表5抗血小板聚集作用(X±SD)
  组别   鼠数(只)   最大聚集率(η/％)
  对照组   10   93.48±15.76
  复方当归注射液组   10   69.26±16.22*
  本发明组   10   58.04±14.37*#
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与复方当归注射液组比较：#P＜0.01
本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液都能明显抑制血小板聚集(P＜0.01)；本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液相比，抑制作用也有显著差异(P＜0.01)。说明：本发明复方当归冻干粉针剂的作用强于复方当归注射液。
5、镇痛作用
取雌性健康昆明种小鼠50只，水温恒定在55±0.5℃，用热板法测其基础痛阈，以小鼠舔后足为指标，选其疼痛反应潜伏期在10～30s之间的30只供实验，然后按体重分层均等随机分3组，即对照组、复方当归注射液组，本发明复方当归冻干粉针剂组(简称：本发明组)。每组10只，分别腹腔注射给药，对照组给予等容量生理盐水。各组分别于给药前及给药后30min各测痛阈一次，痛阈超过60s者以60s记。计算痛阈值，结果见表6。
                 表6镇痛作用(X±SD)
组别   鼠数(只)             痛阈值(s)
  给药前   给药后
  对照组   10   17.83±3.42   20.83±7.46
  复方当归注射液组   10   18.02±3.66   35.93±7.14*
  本发明组   10   17.46±3.53   41.58±6.73*#
注：与对照组比较：*P＜0.01；
与复方当归注射液组比较：#P＜0.01
本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液均能显著增加小鼠的痛阈值(P＜0.01)；本发明复方当归冻干粉针剂和复方当归注射液相比，痛阈值提高也有显著差异(P＜0.01)。说明：本发明复方当归冻干粉针剂的作用强于复方当归注射液。
以上药理实验结果说明，用本发明的新方法制备的复方冻干粉针剂的药理作用强于复方当归注射液，两者之间的作用强度有着显著性的差异。说明，本发明的制备方法科学、合理、更具有实用性。
六、制备实施例
实施例1：
(1)原料药材为：当归100g，川芎100g，红花100g；
(2)取上述当归、川芎药材，粉碎，加10倍量的pH5的用盐酸酸化的80％乙醇溶液提取3次，每次2小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述红花药材，粉碎，加8倍量的80％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，以20000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用5倍柱体积80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物6.5g。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入聚乙烯吡咯烷酮23.5g，加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH值至5.5，灌装，冷冻干燥，得本发明复方当归冻干粉针剂500支。
实施例2：
(1)原料药材为：当归100g，川芎100g，红花100g；
(2)取上述当归、川芎药材，粉碎，加6倍量的pH3的用硫酸和冰醋酸酸化的40％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述红花药材，粉碎，加5倍量的40％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，以12000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，先用5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用2倍柱体积40％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物1.5g。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入甘露醇和葡聚糖28.5g，加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH值至4.5，灌装，冷冻干燥，得本发明复方当归冻干粉针剂500支。
实施例3：
(1)原料药材为；当归100g，川芎100g，红花100g；
(2)取上述当归、川芎药材，粉碎，加8倍量的pH4的用磷酸酸化的50％乙醇溶液提取2次，每次2小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述红花药材，粉碎，加6倍量的60％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，以16000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用4倍柱体积50％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物4.1g。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入葡萄糖和果糖25.9g，加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH值至5.0，灌装，冷冻干燥，得本发明复方当归冻干粉针剂500支。
实施例4：
(1)原料药材为：当归100g，川芎100g，红花100g；
(2)取上述当归、川芎药材，粉碎，加7倍量的pH4.5的用醋酸酸化的70％乙醇溶液提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述红花药材，粉碎，加7倍量的50％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，以18000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的NKA型大孔吸附树脂柱，先用5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用3倍柱体积70％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物5.3g。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入右旋果糖和乳糖24.7g，加注射用水至1000ml，用葡甲胺调节pH值至5.2，灌装，冷冻干燥，得本发明复方当归冻干粉针剂500支。
实施例5：
(1)原料药材为：当归1000g，川芎1000g，红花1000g；
(2)取上述当归、川芎药材，粉碎，加9倍量的pH3.5的用冰醋酸酸化的60％乙醇溶液提取2次，每次2小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述红花药材，粉碎，加8倍量的70％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，以14000转/分的速度离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱，先用4倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用5倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物28.0g。
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和右旋果糖272.0g，加注射用水至10000ml，用葡甲胺调节pH值至4.8，灌装，冷冻干燥，得本发明复方当归冻干粉针剂5000支。
肌内、穴位或鞘内注射。肌内注射：一次1-2支，一日1次；穴位注射：将本发明一支用2ml注射用水溶解，一穴0.3-1.0ml，一次2-6穴，一日或隔日1次；腱鞘内注射：将本发明一支用20-40ml注射用水溶解使用，一次1-5ml。

Claims (1)

1、一种复方当归冻干粉针剂的制备方法，其特征为以下步骤：
(1)原料药材重量份配比为：当归100，川芍100，红花100；
(2)取上述重量份的当归、川芍药材，粉碎，加6-10倍量pH值为3-5的酸性乙醇溶液提取2-3次，每次1-2小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，备用；取上述重量份的红花药材，粉碎，加5-8倍量的40％-80％乙醇溶液提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至溶液∶药材为1∶1，与上述药液合并，高速离心，离心液用截留分子量为5000的超滤膜超滤，滤液过已处理好的非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，先用3-5倍柱体积的水洗脱，弃去水液，再用2-5倍柱体积40％-80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得到提取物；
(3)将上述提取物加注射用水溶解，滤过，加入冻干赋型剂，加注射用水至规定量，用葡甲胺调节pH值至4.5-5.5，冷冻干燥，即得。
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