CN1271115C

CN1271115C - 聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物及其药物结合物

Info

Publication number: CN1271115C
Application number: CNB021587663A
Authority: CN
Inventors: 嵇世山; 朱德权
Original assignee: BEIJING JIANKAI SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2002-12-26
Publication date: 2006-08-23
Anticipated expiration: 2022-12-26
Also published as: CN1511860A

Abstract

本发明涉及如下通式(I)或(II)的、一种新型的、对水解稳定的，通过醚键连接的聚乙二醇和长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物，其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整数；A为C_1-12的烷氧基、环烷氧基或芳烷基，或者为能够与药物分子中的氨基、羟基、巯基等反应的活性官能团。还涉及其制备办法，和这类衍生物与药物分子的结合物。

Description

聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物及其药物结合物

技术领域

本发明涉及一种新型的、对水解稳定的，通过醚键连接的聚乙二醇和长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物，它们的制备办法，以及这类衍生物与药物分子的结合产物，及其医药用途。

背景技术

天然药物活性成分中的蛋白质、多肽、萜类、甾体、生物碱、黄酮、蒽醌、苯丙素酚类等在生理活性上都表现出各种有效的性能，在医药中得到了广泛的应用。它们的甙类、核苷类、多肽类衍生物也有相当的应用。作为天然活性成分，它们具有生物降解快，基本无残留，毒副作用小等优点。但同时也有相应的问题存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引发机体免疫等不利之处。

为解决此问题，已广泛地使用聚乙二醇衍生物，使其与蛋白质、肽或其他治疗药物的结合，以延长药物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将PEG键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展，在许多批准药品中广泛被使用，如PEG-intron^，一种α-干扰素与聚乙二醇的键合物就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的键合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。它们在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的，无副作用的药物改性剂。

聚乙二醇可以用于和很多药物连接。在与药物结合时，常用到一种被称为聚乙二醇化(PEGylation)的工艺，即聚乙二醇两端的一个或二个端基被化学活化后具有一适当的官能团，此官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成化学键。形成的键合物可在体内适当的情况下释放出活性成分。

马来酰亚胺作为聚乙二醇(PEG)衍生物的常用基团已经广泛的应用在对蛋白质或者多肽的改性修饰上。其通常是对药物中一个巯基(-SH)连接形成键合物。目前为止，在聚乙二醇和马来酰亚胺基团之间的连接基团相对来讲比较短，一般不会超过三个碳原子。而且马来酰亚胺基在水相中相当不稳定，尤其是在碱性溶液中。如果提供了一个较长的非亲水性基团做为它们之间的连接，将会大大提高马来酰亚胺基的稳定性，有助于保持其在水相中和蛋白质多肽等的反应活性，而不至于过早的水解掉。

采用醚键连接的此类聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物将会具有更高的水解稳定性，它在聚乙二醇(PEG)骨架和马来酰亚胺基之间提供了一个稳定的连接方式，有利于保证马来酰亚胺基在以后的药物连接过程中保持足够的活性。这种聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物和药物连接形成的键合物，将在水溶液中形成一种微球结构。药物分子及疏水性的长链脂肪骨架会被聚乙二醇(PEG)包裹在其中而得到保护。能够有效的降低酶降解作用，提高在生物体内的半衰期和改变体内分布。如果它连接的对象本身也是一个疏水性的药物前体，将会获得更好的效果。本发明所提供的一系列聚乙二醇(PEG)长链脂肪类马来酰亚胺衍生物将具有较长的疏水性基团，因此能够提供更好的半衰期保护和提高治疗效果。针对不同药物的特性可以选用不同长度的疏水性基团，可以有效的提高相应药物的稳定性和生物降解特性。

发明内容

因此，本发明提供一种如下通式的聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物：

或

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物；

l是4-18的整数；

A为C_1-12的烷氧基、环烷氧基或芳烷基，或者为酯基。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物为如下式的化合物：

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物，包括支链、直链、星形和树形；

l是4-18的整数，其中，当l＝5的时候为戊基马来酰亚胺。

本发明也包括下式的聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺的多官能团取代

衍生物：

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物；

l是4-18的整数；

F为一个活性官能团，它和酸性基团共同组成了一个活性的官能团，包括酯基(比如NHS酯，即N-羟基琥珀酰胺酯，或者HOBT酯，即1-羟基苯并三唑酯)、酰氯、酰阱、马来酰亚胺、吡啶并二硫化物。能够和药物分子中的氨基、羟基，巯基等反应。

本发明还提供制备如上所述的通式(Ia)的聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物的方法，该方法采用PEG和溴代氰化物反应，然后降解氰基得到相应的氨基基团以及将氨基通过N-羟基马来酰亚胺或者N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺转化为马来酰亚胺基。

本发明还提供如下式的聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺和药物的结合物：

或

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物；

l是4-18的整数；

Drug为药物分子。

在本发明的一个优选实施方案中，该聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺和药物连接的结合物为：

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物，包括支链、直链、星形和树形；

l是4-18的整数；

Drug为药物分子。

本发明还提供包含上述聚乙二醇(PEG)-药物结合物作为活性成分的药物组合物。

本发明还提供所述结合物在制备药物组合物中的用途。

本发明的结合物可改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。

具体实施方式

在本发明的聚乙二醇(PEG)长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物中所用的聚乙二醇聚合物是一种亲水性聚合物，这种亲水性聚合物还可以包括聚乙二醇与聚丙二醇、聚乙烯醇、或者聚丙烯吗啉的共聚物，其中特别优选是聚乙二醇。此等亲水性聚合物通过对游离端羟基的修饰，将长链脂肪烷类马来酰亚胺基团结合到该聚合物的母体上，使该聚合物能够提供与药物分子的连接点，由此与蛋白质、多肽或者其他天然药物活性成分中的游离巯基(-SH)、氨基等连接在一起。

在本发明的聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺衍生物中，马来酰亚胺基团通过一个较长的脂肪链将PEG和马来酰亚胺基连接起来，该脂肪链和PEG的连接采用的是醚键形式。与普通的改性剂不同之处在于，采用的是醚键将脂肪链和PEG连接起来，这种结构的水解稳定性明显高于普通的酯键和酰胺键。因此，这种结构对提高药物结合物在体液中的水解稳定性将会具有显著的改善。由于诸如马来酰亚胺本身在水相中的不稳定性，导致了在很多实施例中对蛋白质和多肽以及其他一些活性分子的反应活性大大降低。采用长链的非亲水性脂肪链，将更有利于保证马来酰亚胺在水相的反应活性和提高药物结合物的产率。在和一些非亲水性的药物分子，如蛋白质、多肽和一些天然药物活性成分发生反应后，可以使该结合物在水溶液中将形成以若干分子聚集组成分子团的微球结构。该结构保留了亲水性聚合物良好的亲水性、柔性、抗巨噬细胞吞噬性等优良特性，同时提供了对药物分子的缓释控释，可以极大的延长药物，尤其是天然药物分子，在体内的停留周期。

本发明的一个优点是除了保留有亲水性聚合物如聚乙二醇或其衍生物通常的溶解性、非免疫原性和无毒等特征外，醚键结构将有助于保持药物分子的稳定性，减低在到达靶器官的非正常损耗。同时长链的脂肪链对于保证马来酰亚胺基的活性和反应特性也提供了特有的帮助。它们和药物分子形成的微球结构也有助于改善在体内的分布，保证了药物分子的有效血药浓度和分步释放。

现在以聚乙二醇衍生物为例，说明本发明中亲水性聚合物与马来酰亚胺基的连接。

聚乙二醇衍生物的结构中包括了聚合物支链部分和端基功能团部分，分别描述如下。

聚乙二醇(PEG)，其结构通式如I所示：

其中：

R为H或C_1-12烷基，

n为任何整数，表征其聚合度。

当R为低级烷基时，R可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。当R为环烷基时，R优选为含3-7个碳原子的环烷基，如环丙基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇类似物或聚乙二醇共聚物也可用于此发明应用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉等。

对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60000道尔顿，这相当于n为大约6～1300。更优选的是，n为28、112和450，这分别相应于分子量为1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始聚乙二醇化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。

本发明聚乙二醇长链脂肪烷类马来酰亚胺制备部分是采用聚乙二醇和溴代氰化物反应，然后降解氰基得到相应的氨基。再通过N一(甲氧基羰基)马来酰亚胺或者N-羟基马来酰亚胺将马来酰亚胺基连接上去。在实际应用中，需要对聚乙二醇的端基部分予以活化，以保证其能够和溴代氰化物发生反应而将二者结合。

常用的方法是用氢化物将PEG端基的羟基活化为醇钠或醇钾，以提高其和溴代物的反应性质。一个典型的反应如下：

亲水性聚合物上如果有游离羟基，则该游离羟基可用C_1-12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端，优选是甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基、环己氧基以及苄氧基。

另外，在该亲水性聚合物上还可连接靶向分子，如抗体等，以便定向转运本发明的结合物。

在目前使用许多药物、尤其是天然药物成分中都含有游离巯基(-SH)、氨基、羧基、羟基等官能团。本发明的结合物中可使用合适的药物分子构成其中的药物部分，其包括氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱等。其中的蛋白质包括促白细胞生成素(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)、白介素(IL)、干扰素、水蛭素、抗体等。

本发明的药物结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。

通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。

优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。

如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。

该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例如可参见Remington的“制药学”(Remington′ Pharmaceutical Sciences)，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。

实施例

下面结合实例描述本发明的结合物及其制备方法，这些实施例不用来限制本发明。本发明的范围由后附的权利要求来限定。

实施例1

甲氧基聚乙二醇己胺的制备

10克甲氧基聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升溶剂，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.1克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加1克6-溴己腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：9.5克(95％)。

9克甲氧基聚乙二醇—己腈(mPEG-O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CN，分子量为10000，由上步制得)溶解在50毫升无水四氢呋喃中，添加300毫克LiAlH₄，氮气保护下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，溶液用冰盐浴(-10℃)冷却，过滤收集沉淀，乙醚洗涤。未反应的LiAlH₄通过滴加乙酸乙酯(100毫升)分解除去。真空干燥过夜，粗产物可以通过离子交换色谱提纯。产率：7.2克(80％)。

实施例2

甲氧基聚乙二醇己基马来酰亚胺的制备

7克甲氧基聚乙二醇己胺(分子量为10000，由实施例1制备)溶解在60毫升0.2M的磷酸盐缓冲溶液中(pH＝8.0)，冰水浴搅拌1小时，添加350毫克N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺的乙腈溶液5毫升，室温下搅拌2小时。用浓盐酸调pH＝3.5，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀真空干燥，产率：5克(70％)。

实施例3

甲氧基聚乙二醇戊基马来酰亚胺的制备

10克甲氧基聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.1克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加2克5-溴戊腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：9克(90％)。

8.5克甲氧基聚乙二醇-戊腈(分子量为10000，mPEG-O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂CH₂CH₂CN，由上步制得)溶解在50毫升无水四氢呋喃中，添加300毫克LiAlH₄，氮气保护下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，溶液用冰盐浴(-10℃)冷却，过滤收集沉淀，乙醚洗涤。未反应的LiAlH₄通过滴加乙酸乙酯(100毫升)分解除去。真空干燥过夜，粗产物可以通过离子交换色谱提纯。产率：6.8克(80％)。

6克甲氧基聚乙二醇戊胺(分子量为10000，由上步制得)溶解在60毫升0.2M的磷酸盐缓冲溶液中(pH＝8.0)，冰水浴搅拌1小时，添加350毫克N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺的乙腈溶液5毫升，室温下搅拌2小时。用浓盐酸调pH＝3.5，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀真空干燥，产率：5克(83％)。

实施例4

聚乙二醇二己胺的制备

10克聚乙二醇(分子量为10000)溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升溶剂，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，加入0.3克氢化钠，搅拌30分钟。在溶液中添加2克6-溴己腈，35℃过夜搅拌。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀，真空干燥，产率：9.5克(95％)。

9克聚乙二醇-二己腈(分子量为10000，由上步制得)溶解在50毫升无水四氢呋喃中，添加600毫克LiAlH₄，氮气保护下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，溶液用冰盐浴(-10℃)冷却，过滤收集沉淀，乙醚洗涤。未反应的LiAlH₄通过滴加乙酸乙酯(100毫升)分解除去。真空干燥过夜，粗产物可以通过离子交换色谱提纯。产率：7.2克(80％)。

实施例5

聚乙二醇二己基马来酰亚胺的制备

7克聚乙二醇二己胺(分子量为10000，由实施例4制备)溶解在60毫升0.2M的磷酸盐缓冲溶液中(pH＝8.0)，冰水浴搅拌1小时，添加800毫克N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺的乙腈溶液10毫升，室温下搅拌2小时。用浓盐酸调pH＝3.5，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。真空浓缩，加入100毫升异丙醇沉淀。过滤收集沉淀，真空干燥，产率：5克(70％)。

实施例6

甲氧基聚乙二醇己基马来酰亚胺和β-干扰素的制备

20毫克甲氧基聚乙二醇己基马来酰亚胺(分子量为10000，由实施例2制备)，溶解在5毫升(pH＝8.0)的PBS缓冲盐溶液中，其中含有1毫克/毫升β-干扰素。在室温震摇7小时后在4℃过夜反应。再稀释到β-干扰素的浓度为0.5毫克/毫升，通过琼脂糖凝胶离子交换树脂纯化，分别收集单取代、双取代的成分，超滤浓缩。最终产物用SDS-PAGE显示其中没有游离的α-干扰素，GPC显示没有游离的PEG分子。

实施例7

含有甲氧基聚乙二醇己基马来酰亚胺和药物之结合物的药物组合物的制备

本实施例说明代表性非胃肠道给药的药物组合物的制备过程，所述组合物包含本发明实施例6的药物结合物。

成分

实施例6的药物结合物 2克

0.9％盐水溶液至100毫升

将实施例6的药物结合物溶解于0.9％盐水溶液，得到100毫升的静脉注射用溶液，将其通过0.2μm的膜过滤材料过滤，在无菌条件下包装。

Claims

1.如下通式的化合物：

或

其中：

PEG是聚乙二醇聚合物；

l是4-18的整数

A为C_1-12的烷氧基、环烷氧基或芳烷基，或者为酯基、酰氯、酰阱、马来酰亚胺或吡啶并二硫化物的活性官能团。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的A选自甲氧基、乙氧基、或者苄氧基。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的A为一个选自酯基、酰氯、酰阱、马来酰亚胺或吡啶并二硫化物的活性官能团。

4.如权利要求3所述的化合物，其中，所述的酯基是N-羟基琥珀酰胺酯或1-羟基苯并三唑酯。

5.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇聚合物是聚乙二醇，其分子量为150～60,000，并且，所述的聚乙二醇是直链、支链、星形或者树形结构。

6.如权利要求1所述的化合物，其中，l等于5或6。

7.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的聚乙二醇聚合物包括聚乙二醇，或者，聚乙二醇与聚丙二醇、聚乙烯醇或聚丙烯吗啉的共聚物。

8.一种制备权利要求2所述的化合物的方法，该方法包括采用PEG和溴代氰化物反应，然后降解氰基得到相应的氨基基团以及将氨基通过N-羟基马来酰亚胺或者N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺转化为马来酰亚胺基的步骤。

9.权利要求1-7之一的化合物与药物按如下通式的药物结合物：

或

其中：Drug为药物分子。

10.如权利要求9所述的药物结合物，其中，所述的药物分子选自于以下类别中的一种：蛋白质、酶、多肽、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱。

11.如权利要求10所述的药物结合物，其中，所述的蛋白质选自由促白细胞生成素，促红细胞生成素、白介素、干扰素、水蛭素和抗体组成的组。