CN100420671C - 一种马来酰亚胺衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马来酰亚胺衍生物及其制备方法与应用。本发明的马来酰亚胺衍生物结构式为通式I，其中，R为1-6个碳原子的烷基；R’为H或甲基；R”为H或甲基；X为NH或S原子；M为2-18个碳原子的亚烷基；n为3-4000之间的正整数。其制备方法包括如下步骤：1)将摩尔比为1∶2.01-2.5的脂肪族二胺与马来酸酐在催化剂作用下制备双马来酰亚胺；2)将摩尔比为1∶1.01-2.1的一端为甲基、乙基、正丙基或异丙基的PEG胺或PEG乙硫醇与双马来酰亚胺反应得到产物。本发明的马来酸亚胺衍生物用双马来酰亚胺代替马来酸酐作为反应原料，反应产物单一；与蛋白上巯基、氨基反应具有专一性而且不会生成二聚体，可以广泛应用于蛋白质修饰领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种马来酰亚胺衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
亲水性多聚物，如聚烷基二醇，或其它水溶性、非肽类多聚物等，与分子或表面的共价键合技术，被广泛应用于生物技术和医药领域。聚乙二醇(PEG)是一种常用的聚烷基二醇，它是两端均为羟基的线性多聚物，其结构可表示为：
其中，n为3-4000之间的整数。
也可以将上式表示为，HO-PEG-OH
则其中PEG表示，
通常使用的PEG为H3C-O-PEG-OH，即聚乙二醇单甲醚，以mPEG表示。其中，主链一端为单甲氧基；主链另一端为羟基，此羟基可转化为其他官能团，或连接上其他官能团，用于化学修饰。mPEG的结构可表示为下式：
其中，n为3-4000之间的整数。
聚氧乙烯和聚氧丙烯与PEG的化学性质相近，可以在很多应用领域代替PEG。其分子式通式表示如下：
其中，n为3-4000之间的整数；R表示氢原子或甲基。
PEG易溶于水，具有热稳定性和生物相容性，其水溶液为无色、无味的透明溶液，还可溶于多种化学溶剂，不水解，不降解，通常是无毒的。另外，PEG无免疫原性，不会诱导机体产生免疫反应。当PEG与含有相应活性部位的分子连接后，PEG可以减少甚至消除所连接分子的免疫反应，使有机体忽略该分子的存在，允许其存在于有机体内。PEG的另一种作用是增大“不溶性分子-PEG”结合物的溶解度，例如，paclitaxel不溶于水，而结合PEG的偶合物则可溶于水(Greenwald，et al.，J.org.chem.，60，331-336，1995)。
用于蛋白修饰的PEG分子，通常需要将PEG末端转化为活性官能团，此官能团可根据目标蛋白或多肽分子上的活性基团选择。例如，对应蛋白分子上游离的巯基，可选用马来酰亚胺、碘乙酸酯、乙烯基磺酸酯衍生化的PEG进行耦联反应。
Shearwater.co公司的专利(US：6602498)描述了马来酰亚胺多聚物衍生物以及其衍生物的制备方法，即含有氨基官能团的多聚物与马来酸酐，在醋酸钠和醋酐作用下，经过两步反应制备而成。而且两步反应之间需要有分离纯化操作，用以除去中间产物马来酸单酰胺。该方法的产物马来酰亚胺基单甲氧基聚乙二醇衍生物纯度在79％～90％之间，且随多聚物骨架分子量的增大而减少。该生产工艺中存在着复杂的离子交换色谱法和沉淀技术等分离纯化操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备简单的马来酸亚胺衍生物及其制备方法。
本发明所提供的马来酰亚胺衍生物，具有通式I的结构式，其中，R为1-6个碳原子的烷基；R’为H或甲基；R”为H或甲基；X为NH或S原子；M为2-18个碳原子的亚烷基；n为3-4000之间的正整数。
所述R包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、2-甲基丙基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基及其烷基同分异构体；优选为甲基、乙基、正丙基或异丙基；更优选为甲基。
所述R’优选为H；所述R”优选为H。所述n优选为113-1500之间的正整数。所述X优选为NH。
所述M表示碳原子数在2-18之间亚烷基，可以是支链或直链结构的亚烷基，包括亚乙基，亚丙基，亚异丙基，亚丁基，2-甲基亚丙基，亚戊基，亚己基等；优选为C2-C6的直链亚烷基，其中更为常用的为亚乙基。
该马来酸亚胺衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)制备双马来酰亚胺衍生物：将摩尔比为1∶2.01-2.5的脂肪族二胺与马来酸酐在丙酮或二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中反应，然后加入醋酐和催化剂，反应得到双马来酰亚胺衍生物；所述催化剂选自乙酸钠、乙酸钾、乙酸胺和乙酸镁中的一种或几种的组合；
2)将摩尔比为1∶1.01-2.1的一端为甲基、乙基、正丙基或异丙基的PEG胺或PEG乙硫醇与双马来酰亚胺在氯仿或二氯甲烷或丙酮中加热到40℃-80℃，反应得到产物。
在上述方法中，步骤1)所述催化剂用量为每5克马来酸酐加入催化剂0.1-0.5g，其反应是在25℃-100℃条件下进行2-10h，其中优选的是在50℃-80℃条件下进行4-6h；步骤2)所述反应优选温度为65℃-80℃，反应时间为1.5-3.5小时。
其中，步骤2)所用的反应原料一端为甲基、乙基、正丙基或异丙基的PEG胺或PEG乙硫醇可以购买得到，也可以在制备本发明衍生物时合成。
本发明的马来酸亚胺衍生物可以与巯基、氨基等功能基团共价结合，特别是与游离巯基共价结合的活性高，适合于修饰含有一个或多个半胱氨酸巯基的蛋白或多肽分子。
制备本发明的马来酸亚胺衍生物的反应式如下所示：
注.X表示·NH·或·S·
本发明所提供的马来酸亚胺衍生物特点在于，用双马来酰亚胺代替马来酸酐作为反应原料参与反应，所得反应产物单一；与蛋白上巯基、氨基反应具有专一性，而且修饰过程不会产生交联副产物，生成二聚体，可以在修饰蛋白质和多肽中得到广泛应用。
附图说明
图1为mPEG-NS-MAL的紫外吸收光谱；
图2为mPEG-NS-BSA的SDS-PAGE电泳图；
图3为mPEG-NS-rINF-γ的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
实施例1、mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚乙基；n为113)
1、制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺
在250ml三颈瓶中加入5g马来酸酐(0.051mol)，丙酮20ml(密度：0.789g/ml)，搅拌至全溶。将乙二胺1.65ml溶于12ml丙酮，滴入马来酸酐丙酮溶液中，室温搅拌反应3h。然后加入三乙胺2ml(0.0143mol)，室温搅拌反应30min。加入无水乙酸钠0.1g，缓慢滴加10ml醋酐，65℃搅拌4h。反应结束，过滤，减压浓缩。用100ml丙酮溶解，摇匀后，将溶液搅拌下到入500ml无水乙醚中，析出褐色沉淀。减压过滤，收集晶体。40℃减压干燥，得到N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺。
2、制备mPEG5k-NH2
将10g(2mmol)mPEG-5000溶于400ml CHCl3，90℃常压蒸馏，蒸去200ml CHCl3，冷却至室温。氮气保护下加入0.72ml三乙胺和0.4ml甲磺酰氯，室温搅拌过夜。然后加入2ml乙醇终止反应，搅拌15min后浓缩蒸干溶剂，用乙醚沉淀。加入250ml浓氨水和5g NH4Cl，室温搅拌反应72h，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，乙醚沉淀，即得纯品。
3、制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺
0.42gN-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺加入到100ml氯仿中，加入5g mPEG5k-NH2，加热至65℃搅拌反应2.5h。然后室温搅拌过夜，反应结束后经过滤、浓缩和乙醚沉淀。沉淀以100ml四氯甲烷溶解，过滤，浓缩，100ml异丙醇重结晶，得到mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺。
产物熔点为60℃，颜色为白色，略带浅黄色。产物紫外光谱如图1所示，证明产物正确。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
实施例2、mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚己基；n为113)
1、制备N-马来酰亚胺己基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.024mol己二胺与5g马来酸酐在DMF中反应，所用催化剂为0.25g乙酸铵，反应在25℃下进行10h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到N-马来酰亚胺己基马来酰亚胺。
2、制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.279gN-马来酰亚胺己基马来酰亚胺与5gmPEG5k-NH2在丙酮中在40℃反应3h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺。
产物熔点为60℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
实施例3、mPEG10k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚乙基；n为227)
1、制备mPEG10k-NH2
制备方法同实施例1制备mPEG5k-NH2，不同之处在于反应原料为mPEG-10000。
2、制备mPEG10k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.231gN-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺与5gmPEG10k-NH2在二氯甲烷中在80℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG10k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺。
产物熔点为60℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)
实施例4、mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚丁基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚丁基；n为454)
1、制备N-马来酰亚胺丁基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将1.796g丁二胺与5g马来酸酐在DMSO中反应，所用催化剂为0.5g乙酸镁，反应在100℃下进行2h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到N-马来酰亚胺丁基马来酰亚胺。
2、制备mPEG20k-NH2
制备方法同实施例1制备mPEG5k-NH2，不同之处在于反应原料为mPEG-20000。
3、制备mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚丁基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.13gN-马来酰亚胺丁基马来酰亚胺与5gmPEG20k-NH2在丙酮中在65℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚丁基马来酰亚胺。
产物熔点为62℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)
实施例5、mPEG40k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚乙基；n为909)
1、制备mPEG40k-NH2
制备方法同实施例1制备mPEG5k-NH2，不同之处在于反应原料为mPEG-40000。
2、mPEG40k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.041gN-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺与5gmPEG40k-NH2在二氯甲烷中在70℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG40k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺。
产物熔点为61℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)
实施例6、mPEG10k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚己基；n为227)
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.248gN-马来酰亚胺己基马来酰亚胺与5gmPEG10k-NH2在二氯甲烷中在70℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG10k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺。
产物熔点为61℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)
实施例7、mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚乙基；n为454)
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0082gN-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺与5gmPEG20k-NH2在二氯甲烷中在75℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺。
产物熔点为61℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)
实施例8、mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚己基；n为454)
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.097gN-马来酰亚胺己基马来酰亚胺与5gmPEG20k-NH2在二氯甲烷中在75℃反应3h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺。
产物熔点为62℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
实施例9、mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚丙基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚丙基；n为113)
1、制备N-马来酰亚胺丙基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将1.573g丙二胺与5g马来酸酐在DMF中反应，所用催化剂为0.4g乙酸钾，反应在50℃下进行6h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到N-马来酰亚胺丙基马来酰亚胺。
2、制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚丙基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.243gN-马来酰亚胺丙基马来酰亚胺与5gmPEG5k-NH2在二氯甲烷中在75℃反应2h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚丙基马来酰亚胺。
产物熔点为60℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
实施例10、mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚戊基马来酰亚胺的制备(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为NH；M为亚戊基；n为454)
1、制备N-马来酰亚胺戊基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将2.59g戊二胺与5g马来酸酐在DMSO中反应，所用催化剂为0.2g乙酸钾和0.1g乙酸铵，反应在80℃下进行4h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到N-马来酰亚胺戊基马来酰亚胺。
2、制备mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚戊基马来酰亚胺
制备方法同实施例1制备mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺，不同之处在于是将0.138gN-马来酰亚胺戊基马来酰亚胺与5gmPEG20k-NH2在丙酮中在75℃反应3.5h。反应结束后的沉淀、结晶等步骤与实施例1相同，得到mPEG20k-N-取代琥珀酰亚胺亚戊基马来酰亚胺。
产物熔点为61℃，颜色为白色，略带浅黄色。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
实施例11、制备mPEG5k-S-(N-取代琥珀酰亚胺亚乙基)马来酰亚胺(式I中R为甲基；R’为H；R”为H；X为S；M为亚乙基；n为113)
按实施例1的方法制备N-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺，取0.42gN-马来酰亚胺乙基马来酰亚胺加入到100ml氯仿中，加入5g mPEG5k-SH(购于Nektar Therapeutics公司)，室温搅拌反应2.5h。反应结束后经过滤、浓缩和乙醚沉淀。沉淀以100ml四氯甲烷溶解，过滤，浓缩，100ml异丙醇重结晶，得到mPEG5k-S-(N-取代琥珀酰亚胺亚乙基)马来酰亚胺。
产物熔点为60℃，颜色为白色，略带浅黄色。产物紫外光谱如图1所示，证明产物正确。
NMR：δH(CDCl3)6.72(2H，S，CH＝CH)，δ3.5(br m，PEG)，δ3.38(3H，S，-OCH3)。
其他一端为乙基、正丙基或异丙基的PEG乙硫醇也可以从Nektar Therapeutics公司购买得到，采用上述的制备方法即可得到式I中R为乙基、正丙基或异丙基等马来酰亚胺衍生物。
实施例12、mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺修饰牛血清白蛋白(BSA)
牛血清白蛋白(BSA)经二巯基苏糖醇(DTT)处理后，与mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚己基马来酰亚胺(按实施例2方法制得)分别以摩尔比为1∶1和1∶5在pH6.0条件下反应，分别得到低修饰和高修饰产物。修饰方法采用常规的马来酰亚胺衍生物修饰方法，产物的SDS-PAGE电泳图谱如图2所示。图中M道为标准分子量蛋白；1道为BSA对照品；2道为低修饰mPEG-NS-BSA混合样品；3道为低修饰mPEG-NS-BSA混合样品；4道为高修饰mPEG-NS-BSA混合样品，其中-NS-表示N取代琥珀酰亚胺基，-BSA表示牛血清白蛋白。电泳结果表明BSA出现有一条或多条修饰带。
实施例13、mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺修饰rINF-γ
从SCHERING CORPORATION公司购得重组蛋白97Cys-rINF-γ和131Cys-rINF-γ(INF-γ的N末端第97位或131位氨基酸残基突变为半胱氨酸)，用实施例1制得的mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺对上述两种蛋白进行修饰。
在50mmol醋酸钠缓冲液中加入3ml浓度为0.36mg/ml的97Cys-rINF-γ，调节pH3.6，加入mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺6mg，室温反应2小时，可得50％～80％收率的修饰产物mPEG-NS-97Cys-rINF-γ。
mPEG-NS-131Cys-rINF-γ制备方法与上相同。
在制备mPEG-NS-97Cys-rINF-γ时，室温反应2小时后在反应体系中加入30毫摩尔DTT，得到mPEG-NS-97Cys-rINF-γ修饰样品，含二巯基苏糖醇(DTT)30毫摩尔。
几种产物的SDS-PAGE电泳图如图3所示，图中M道为标准分子量蛋白；1道为97Cys-rINF-γ包涵体；2道为mPEG-NS-97Cys-rINF-γ修饰样品；3道为131Cys-rINF-γ包涵体；4道为mPEG-NS-131Cys-rINF-γ修饰样品；5道为含二巯基苏糖醇(DTT)30毫摩尔的mPEG-NS-97Cys-rINF-γ修饰样品。电泳结果表明mPEG5k-N-取代琥珀酰亚胺亚乙基马来酰亚胺对rINF-γ具有很好的修饰效果。
Claims (10)
1. 结构式为通式I的马来酰亚胺衍生物，其中，R为1-6个碳原子的烷基；R’为H或甲基；R”为H或甲基；X为NH或S原子；M为2-18个碳原子的亚烷基；n为3-4000之间的正整数；
2. 根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于：所述R为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
3. 根据权利要求2所述的衍生物，其特征在于：所述R为甲基；所述R’为H；所述R”为H。
4. 根据权利要求1或2或3所述的衍生物，其特征在于：所述n为113-1500之间的正整数。
5. 根据权利要求1或2或3所述的衍生物，其特征在于：所述X为NH；所述M为2-6个碳原子的直链亚烷基。
6. 根据权利要求5所述的衍生物，其特征在于：所述M为亚乙基。
7. 权利要求2所述衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)制备双马来酰亚胺衍生物：将摩尔比为1∶2.01-2.5的脂肪族二胺与马来酸酐在丙酮或二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中反应，然后加入醋酐和催化剂，反应得到双马来酰亚胺衍生物；所述催化剂选自乙酸钠、乙酸钾、乙酸胺和乙酸镁中的一种或几种的组合；
2)将摩尔比为1∶1.01-2.1的一端为甲基、乙基、正丙基或异丙基的PEG胺或PEG乙硫醇与双马来酰亚胺衍生物在氯仿或二氯甲烷或丙酮中加热到40℃-80℃，反应得到产物。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述催化剂用量为每5克马来酸酐加入催化剂0.1-0.5g，其反应是在25℃-100℃条件下进行2-10h；步骤2)所述反应温度为65℃-80℃，反应时间为1.5-3.5小时。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤1)所述反应是在50℃-80℃条件下进行4-6h。
10. 权利要求1-6所述衍生物在修饰蛋白质或多肽中的应用。
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