CN1257907C - 银杏内酯化合物及其制备方法和含有该化合物的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从银杏内酯总提取物当中分离获得新化合物，本发明将其命名为银杏内酯K，该化合物具有局灶性脑缺血保护作用和弥散性全脑缺血保护作用，作为活性成分，可以制备成各种临床药物剂型。本发明还公开了银杏内酯K的制备方法和含有银杏内酯K的药物组合物。

Description

银杏内酯化合物及其制备方法和含有该化合物的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种新的化合物，该化合物是银杏内酯的一种，是从中草药银杏叶中提取的银杏内酯分离获得的一种单体。本发明将其命名为银杏内酯K。

背景技术

银杏内酯是从中草药银杏叶当中提取获得的有效物质，该物质从结构上还可以进一步细分为银杏内酯A、B、C等，对于银杏内酯的提取方法已经有详细的文献报道，例如，李新岗等人介绍了银杏内酯的实验室提取方法(参见李新岗等，银杏叶中银杏内酯的实验室提取方法研究，中国医药工业杂志1998年第1期)，中国专利文献CN1195665A介绍了银杏内酯的提取方法和含有银杏内酯的制剂，该方法是将银杏叶用水煮沸提取，用吸附剂对提取滤液吸附，再用乙醇脱附，回收乙醇，将析出的结晶溶解，重结晶，干燥制得银杏内酯。中国专利文献CN1313287A公开了一种银杏内酯的生产工艺。从银杏内酯的总提取物当中分离银杏内酯单体的方法，也有很多相关的文献报道，例如，游松等人介绍了银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定方法(参见游松等，银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定，中国药物化学杂志1995年第4期)。中国专利文献CN1287121A公开了由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A、B的方法。银杏内酯作为一个有效的活性物质，可以将其制备成不同的临床药物剂型。用银杏内酯制备注射剂的方法已经在中国专利文献CN1315175A当中公开。刘洁等使用银杏叶注射剂治疗急性脑梗塞取得了一定疗效[参见刘洁等，银杏叶注射液对急性脑梗塞后肢体运动功能及TXB_2、6-Keto-PGF_(1a)的影响]。关于银杏内酯的药理作用，已经有较为详细的文献报道(参见陈维军等，银杏内酯的化学结构及药理作用研究进展，中国药学杂志1998年第9期)。尽管现有技术当中对于银杏内酯及其制剂的研究已经有很多的报道，但是，对于银杏内酯的研究一直没有停止，特别是对于银杏内酯单体的分离及其衍生物的研究，不断有文献报道。目前对于银杏内酯当中有效单体的研究，已经报道了银杏内酯A、B、C等结构，由于银杏内酯是从银杏叶当中提取获得的一类物质的总称，对其中单体的进一步分离，是本领域的重要研究课题，由于银杏内酯总提取物的药理活性已经得以普遍认可，从中进一步分离出的有效单体，将为人们提供一种新的活性化合物，为新药的研究和开发提供物质基础。本发明就是对银杏内酯有效单体的进一步提取和分离。

发明内容

本发明目的是提供一种新的药物化合物，该化合物是银杏内酯的一种，并且具有一定的药理活性。

本发明的化合物，是发明人通过提取和分离，从银杏内酯总提取物当中分类得到的物质，将其命名为银杏内酯K，是一种新的化合物。

该化合物的提取分离方法是：

取银杏内酯粗品3g置索氏提取器中，加乙酸乙酯(或丙酮)2500ml回流24小时，回收乙酸乙酯至浸膏状，用硅藻土拌样，烘干，研细，用石油醚∶乙酸乙酯/9∶1湿法装于低压硅胶柱(压力0.2-0.3k/cm²)，以石油醚∶乙酸乙酯梯度递增洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯/6∶4时，97～121流分，经TCL检查(甲苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇/5∶2.5∶2.5∶0.3，4％NaAc硅胶H板)出现银杏内酯斑点(与银杏内酯对照品比较)，将其合并浓缩，放置出现沉淀，母液留用。将沉淀以丙酮溶解，以制备型高效液相纯化，可得银杏内酯K。

制备本发明银杏内酯K使用的原料银杏内酯粗品，可以经市售购买或者根据已知方法提取获得，该粗品是银杏内酯总提取物，薄层色谱鉴别应检查出银杏内酯K。

上述提取获得的银杏内酯K，经确证为白色针晶(MeoH)，mp＞300℃(分解)，易溶于醇、丙酮、微溶于水。略显淡黄色(空气中放置渐变为白色)。

其红外波谱特征如下：

IRV^kBr _max(cm^-1)：3500，3385，3130，2960，2915，2857，1783，1757，1700，1600，1465，1437，1400，1376，1368，1356，1340，1305，1280，1260，1243，1231，1215，1183，1174，1150，1124，1110，1087，1063，1037，1021，957，750；

质谱：ECI-MS(m/z)：405[M-H]^-。

银杏内酯K的碳氢信号归属及其相关质子信号(DMSO-d6)见表1。

表1  银杏内酯K的碳氢信号归属及其相关质子信号(DMSO-d6)

位置	13C-NMR	1H-NMR	HMBC
				123456789101112131415161718-20	84.0080.20160.3390.5076.3988.9135.6150.8369.1769.0574.1190.5869.1825.14173.4318.8331.9730.81	4.80(dd)6.53(dd)6.47(d)2.201.876.00(d)6.01(S)1.91(d)	5.11(1-OH)，5.47(6)5.53(2)4.83(1)，5.28(1-OH)2.90(16)，5.53(2)6.06(12)2.19(7)，3.83(1)，5.00(10)2.19(7)，3.83(1)2.87(8)7.18(10-OH)5.00(10)，6.06(12)1.87(8)5.47(6)1.91(16)，5.53(2)1.91(16)1.05(18-20)1.87(8)

注：¹³C-NMR、¹H-NMR、HMBC分别指核磁共振碳谱、核磁共振氢谱、二维C-H远程相关谱。

通过理化分析和近代波谱技术(C-H相关、H-H相关、HMQC和HMBC谱)对银杏内酯K化合物的碳氢信号进行全归属，并确定其化学结构如下：

本发明银杏内酯K的化学名称为：1，10-二羟基-3，14-二去氢银杏内酯(1，10-Dihydroxy-3，14-didehydroginkgolide)。分子式C₂₀H₂₂O₉，分子量为406。

本发明的银杏内酯K，作为活性成分，可以制备成临床药物制剂，例如，片剂、胶囊剂、口服液体制剂和注射剂。

因此，本发明还提供了含有银杏内酯K的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的银杏内酯K，优选银杏内酯K的含量大于0.1％。

本发明的药物组合物优选含有0.1-90％的银杏内酯K，进一步优选含有0.5-60％的银杏内酯K，更好是含有0.5-30％的银杏内酯K，最好含有0.5-5％的银杏内酯K。

本发明的银杏内酯K在制备成液体制剂时，优选使用葡甲胺作为助溶剂，特别是在将银杏内酯K制备成注射剂时，葡甲胺是优选的助溶剂。

本发明银杏内酯K可以单独作为活性成分，制备成药物，也可以和其他的活性成分组合制备成药物，例如，可以和其他的银杏内酯组合，制备成药物。

银杏内酯K与银杏内酯A、B组合形成的药物组合物，对缺血性中风具有治疗和预防作用。该组合物的组成如下：

银杏内酯A 30-40％，银杏内酯B 50％-65％，银杏内酯K 0.5-5％。

上述各组份的最佳配比是：35.59％的银杏内酯A、58.39％的银杏内酯B、2.07％的银杏内酯K。

经过活性实验证明，本发明银杏内酯K具有药理活性。银杏内酯K(GinkgolideK)静脉注射能显著降低局灶性脑缺血再灌注后大鼠脑组织的梗塞范围和含水量，改善其神经行为。脑组织匀浆生化指标检测发现该药能显著降低脑组织中MDA、LA含量，升高GSH、SOD含量。脑组织病理切片显示该药对神经细胞保护作用明显。表明该药对大鼠实验性局灶性脑缺血有显著的保护作用。银杏内酯K(GinkgolideK)静脉注射能明显缩短实验性弥散性全脑缺血大鼠的翻正反射恢复时间和EEG恢复时间，还能显著降低脑缺血再灌注后脑组织中伊文思蓝的含量，即降低脑血管通透性，表明该药对大鼠实验性弥散性全脑缺血有保护作用。

用银杏内酯K、银杏内酯A和银杏内酯B组成的组合物制成的注射剂进行了如下一系列药理实验，证明了该组合物的药理作用。

(1)、银杏内酯组合物注射液7.5、15.0、30.0mg/kg iV能使MCAO大鼠的脑卒中评分降低，MCAO梗塞范围缩小，脑组织含水量减少(P＜0.01)，其作用强度与金钠多注射液比较无明显差异。

(2)、银杏内酯组合物注射液7.5、15.0、30.0mg/kg iV可使局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的脑组织内的MDA，LA等含量降低(P＜0.01)，表明脑组织缺血缺氧和过氧化程度受到明显抑制；同时SOD和GSH含量增加(P＜0.01)，反映了药物对机体抗氧化能力和清除自由基的能力有提高。

(3)、银杏内酯组合物注射液7.5、15.0、30.0mg/kg iV可明显保护局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的脑组织结构，大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度比缺血对照组明显减轻，软化灶减少。

(4)、银杏内酯组合物注射液7.5、15.0、30.0mg/kg iV与模型组相比可使弥漫性全脑缺血大鼠的EEG恢复正常时间和翻正反射恢复时间明显缩短(P＜0.01)，使伊文思蓝通透性显著降低(P＜0.01)，其作用与金钠多注射液比较无统计学显著性差异。

(5)、银杏内酯组合物注射液能够明显增加急性不完全性脑缺血小鼠的存活数。按Bliss法计算银杏内酯注射液iV的ED₅₀为21.3(17.6-25.6)mg/kg；银杏内酯ig的ED₅₀为29.2(16.5-51.7)mg/kg；金纳多iV的ED₅₀以银杏提取物计为12.2(6.3-23.3)mg/kg，ED₅₀值经t检验组间比较无差异。

(6)、银杏内酯组合物注射液iV10min即开始起效，达峰时间20min左右，持续时间可达90min以上；而该药ig起效时间20-30min，达峰时间45min左右，持续时间可达120min以上。同一剂量组iV的效应强于ig。

(7)、银杏内酯组合物注射液12.0、24.0、48.0mg/kg iV可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间(P＜0.01)。

(8)、银杏内酯组合物注射液2.5、5.0、10.0mg/kg iV对麻醉犬CBF、CVR、SBP、DBP、MBP和HR均无明显影响(P＞0.05)，表明该药三个剂量不影响麻醉犬的脑血流量、脑血管阻力、血压和心率。

(9)、银杏内酯组合物注射液0.99、1.96、3.80μg/ml对PAF诱导家兔体外血小板聚集均有明显抑制作用(P＜0.01)，并有明显解聚作用(P＜0.01)。对ADP诱导血小板聚集作用较弱(P＜0.05或P＜0.01)，无明显解聚作用(P＞0.05)。该药iV0.75、1.50、3.0mg/kg对PAF诱导的家兔体内血小板聚集均有明显抑制作用(P＜0.01)，中、高剂量组还有明显解聚作用(P＜0.01)。对兔血小板数无明显作用(P＞0.05)。

(10)、银杏内酯组合物注射液iV1.50、3.0mg/kg可明显降低兔红细胞压积(P＜0.01)和全血粘度(比)尤其对高切变速率的全血粘度(比)作用更明显(P＜0.01)。

(11)、银杏内酯组合物注射液iv 0.75、1.50、3.0mg/kg能明显抑制兔动——静脉旁路的血栓形成(P＜0.01)。

(12)、银杏内酯组合物注射液iv 3、6、12mg/kg对大鼠动——静脉旁路血栓有明显溶栓作用(P＜0.01)。

(13)、银杏内酯组合物注射液iv6、12、24mg/kg能明显延长小鼠凝血时间(P＜0.01)。

(14)、银杏内酯组合物注射液iv6mg/kg后10min-20min时可明显延长大鼠凝血时间，峰时12min左右，可使大鼠凝血时间延长32％左右，ig50mg/kg后45min有效，持续120mm，峰时69min左右，大鼠凝血时间延长34％左右。

(15)、银杏内酯组合物注射液iv 1.5mg/kg药后立即就可明显抑制PAF诱导免体内血小板聚集并有明显解聚作用(P＜0.01)，作用持续30min，其峰时为5min，血小板聚集抑制率可达80％左右，1分钟解聚为81％左右。银杏内酯ig25mg/kg药后30min可明显抑制PAF诱导兔体内血小板聚集并有明显解聚作用(P＜0.01)，持续60min，其峰时为42min左右，血小板最大聚集抑制率为38％左右，1分钟解聚率为32％左右。

(16)、银杏内酯组合物注射液iV延长小鼠凝血时间的IC₅₀为6.42mg/kg，银杏内酯ig延长小鼠凝血时间的IC₅₀为29.41mg/kg。银杏内酯注射液iv对家兔血小板和PAF诱导体内血小板聚集的IC₅₀为2.32mg/kg，银杏内酯ig对家兔血小板和PAF诱导体内血小板聚集的IC₅₀为87.72mg/kg。

上述实验表明，本发明的银杏内酯组合物注射液安全有效，可用于缺血性中风的预防和临床治疗。

银杏内酯K的药理实验如下：

实验例一  银杏内酯K静脉注射对局灶性脑缺血大鼠脑功能、梗塞率和脑含水量的影响

1.受试药物：银杏内酯K，由江苏康缘药业股份有限公司提供；尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，为德国拜尔出品，批号：CATEZ1，规格：50ml：10mg；金纳多注射液，德国舒培大药厂出品，批号：6580199，规格：17.5mg；银杏提取物，5ml/支。

2、动物：SD大白鼠，体重为300-400g，雌雄各半，由中国药科大学动物饲养室提供，合格证号：苏动质97004。

3、试验方法和结果

取雄性SD大鼠80只，体重300-400g，按体重随机分为8组，分别为银杏内酯高剂量组2.0mg/kg，中剂量组1.0mg/kg，低剂量组0.5mg/kg，溶媒对照组，阳性对照尼膜同注射液组0.2mg/kg，阳性对照金纳多注射液组1.0ml/kg，假手术组及缺血模型对照组(均给以等量生理盐水0.6ml/100g)。于实验前四天，每天尾静脉注射给药一次，第四天最后一次于缺血前30分钟给药。参考Longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合三氯乙醛(300mg/kg)ip麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线(长4cm，直径0.26mm)经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。一小时后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。

术后24h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下：

0级：未观察到神经症状；

1级：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；

2级：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；

3级：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；

4级；软瘫，肢体无自发活动。

MCAO 24h后，断头处死大鼠，取出全脑，左右脑分别切开，称重。在右脑视交叉及其前后各2mm处，做冠状切，脑切片于1％TTC溶液中避光37℃孵育25分钟，用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下：

梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％

将染色后的脑组织置于110℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下：

脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％

由表2可知，银杏内酯K0.5，1.0，2.0mg/kg iv能使MCAO大鼠的脑卒中评分降低(P＜0.01)，MCAO梗塞范围缩小(P＜0.01)，脑组织含水量减少(P＜0.01)，其高、中剂量作用强度与金纳多比较无明显差异。

表2银杏内酯Kiv对局灶性脑缺血大鼠神经行为、脑梗塞率和脑含水量的影响( x±s，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	神经行为评分	脑梗塞率(％)	脑含水量(％)
					假手术组模型对照溶媒对照银杏内酯K金纳多组尼膜同组	---2.01.00.51.0ml/kg0.2	0.2±0.43.2±0.83.0±0.8*△△△◇◇◇1.5±0.7***△◇◇◇2.1±0.7**△◇◇2.9±0.7*△◇◇◇1.9±0.7**◇◇◇1.9±0.7**◇◇◇	021.0±2.320.7±2.0*△△△◇◇◇13.8±2.0***△◇◇◇16.4±2.4***△◇◇◇18.4±2.0*△△◇◇◇15.6±3.0***◇◇◇16.9±1.9***◇◇◇	77.7±0.681.0±1.781.1±1.4*△△◇◇◇78.1±0.9***△◇79.2±1.2**△◇◇◇80.0±1.4*△△◇◇◇78.0±2.1**◇78.4±1.3**◇

^*p＞0.05， ^**p＜0.05，  ^***p＜0.01     νs模型对照

^△p＞0.05，^△△p＜0.05，^△△△p＜0.01  νs金纳多组

^◇p＞0.05，^◇◇p＜0.05，^◇◇◇p＜0.01  νs假手术组

实验例二  银杏内酯K静脉注射对局灶性脑缺血大鼠脑匀浆生化指标的影响

1.受试药物：银杏内酯K，由江苏康缘药业股份有限公司提供；尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，为德国拜尔出品，批号：CATEZ1，规格：50ml：10mg；金纳多注射液，德国舒培大药厂出品，批号：6580199，规格：17.5mg；银杏提取物，5ml/支。

2、动物：SD大白鼠，体重为300-400g，雌雄各半，由中国药科大学动物饲养室提供，合格证号：苏动质97004。

3、试验方法和结果

取雄性大鼠80只，300-400g，分组给药及手术方法同实验例一。MCAO 24h后，大鼠断头处死，取脑，去除小脑。将大脑用生理盐水制成10％匀浆，按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书，测定大脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)和乳酸(LD)含量。脑匀浆蛋白含量按考马斯亮蓝法测定由表3可见银杏内酯K可使局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的脑组织内的MDA，LA等含量降低，表明组织缺血缺氧和过氧化程度受到明显抑制；同时SOD和GSH含量增加，反映了药物对机体抗氧化能力和清除自由基的能力有提高(P＜0.01)。

表3银杏内酯Kiv对局灶性脑缺血大鼠脑匀浆生化指标的影响( x±s，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	MDA(nmol/mgprot)	LA(mmol/gprot)	SOD(NU/mgprot)	GSH(mg/mgprot)
						假手术组模型对照溶媒对照银杏内酯K金纳多组尼膜同组	---2.01.00.51.0ml/kg0.2	57.3±17.1116.9±24.3104.6±23.6*△△△◇◇◇56.2±16.2***△58.4±7.3***△78.1±14.5***△△△◇◇57.3±10.2***56.9±22.3***	1.9±0.68.8±1.58.0±1.0*△△△◇◇◇3.4±0.4***△◇◇◇4.3±0.8***△◇◇◇6.3±1.0***△△△◇◇◇4.0±0.6***◇◇◇3.3±0.7***◇◇◇	935.8±52.9363.8±121.1432.7±34.0*△△△◇◇◇760.5±53.6***△◇◇◇757.7±56.9***△◇◇◇631.0±117.7***△△△◇◇◇720.0±36.3***◇◇◇799.1±75.4***◇◇◇	79.8±20.138.1±15.144.5±7.8*△△△◇◇◇60.5±14.1***△△◇50.8±11.6**△◇◇◇46.0±15.4*△△△◇◇◇53.9±18.9***◇◇◇61.3±16.7***◇◇

^*p＞0.05， ^**p＜0.05，  ^***p＜0.01     νs模型对照

^△p＞0.05，^△△p＜0.05，^△△△p＜0.01  νs金纳多组

^◇P＞0.05，^◇◇p＜0.05，^◇◇◇p＜0.01  νs假手术组

实验例三  银杏内酯K对局灶性脑缺血大鼠脑组织学的影响

1.受试药物：银杏内酯K，由江苏康缘药业股份有限公司提供；尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，为德国拜尔出品，批号：CATEZ1，规格：50ml：10mg；金纳多注射液，德国舒培大药厂出品，批号：6580199，规格：17.5mg；银杏提取物，5ml/支。

2、动物：SD大白鼠，体重为300-400g，雌雄各半，由中国药科大学动物饲养室提供，合格证号：苏动质97004。

3、试验方法和结果

取雄性大鼠40只，300-400g，随机分为每组5只，给药及手术方法同实验例一。MCAO后24h断头处死大鼠，取出全脑于10％甲醛溶液中固定。标本于腊制模具中切片后作H.E.染色，对大脑皮层海马进行病理组织学检查。结果由病理切片报告和照片所示：

假手术组：各例脑组织神经元及胶质细胞正常，核膜清楚，核仁明显，未见神经变性、坏死及炎细胞浸润等明显病理改变。

缺血模型组：各例脑组织均见神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染，核固缩，核溶解，核体不规则，并见明显软化灶形成。

银杏内酯K三个剂量组，大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞的核固缩、核溶解程度比缺血对照组明显减轻，软化灶减少。其中高剂量效果比较显著，而低剂量组的效果不明显。

金纳多注射液对照组和尼膜同注射液对照组也对脑缺血造成的脑组织损伤有明显保护作用。

结果表明，银杏内酯K0.5，1.0，2.0mg/kg连续静脉注射4天可剂量相关性地改善中动脉闭塞所致局灶性脑缺血大鼠的神经功能，明显缩小梗塞面积、减轻脑水肿；该药还可剂量相关性地显著降低中动脉闭塞大鼠大脑组织中的丙二醛(MDA)和乳酸(LA)含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽(GSH)含量。病理切片也表明银杏内酯可明显改善局灶性脑缺血下大鼠的脑代谢；维持脑缺血状态下神经细胞的正常形态和功能，延缓、减轻其坏死。

实验例四  银杏内酯K静脉注射对大鼠实验性弥散性完全性脑缺血的保护作用

1.受试药物：银杏内酯K，由江苏康缘药业股份有限公司提供；尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，为德国拜尔出品，批号：CATEZ1，规格：50ml：10mg；金纳多注射液，德国舒培大药厂出品，批号：6580199，规格：17.5mg；银杏提取物，5ml/支。

2、动物：SD大白鼠，体重为300-400g，雌雄各半，由中国药科大学动物饲养室提供，合格证号：苏动质97004。

3、试验方法和结果

取雄性SD大鼠80只，体重300-400g，随机分为8组，每组10只。分为银杏内酯K高剂量组2.0mg/kg，中剂量组1.0mg/kg，低剂量组0.5mg/kg，尼膜同注射液组0.2mg/kg，金纳多注射液组1.0ml/kg，溶媒对照组，模型对照组和假手术组(均给以等量生理盐水0.6ml/100g)。于实验前三天，每天尾静脉注射一次。第三天给药后30min，用10％水合氯醛麻醉(300mg/kg，ip)。然后制作大鼠急性完全性脑缺血模型。于枕骨下作1cm左右切口，于正中分离两侧背阔肌及斜方肌，暴露第一颈椎左右两个横突孔，以电烙铁插入横突孔烫闭双侧椎动脉。24h后最后一次给药，乙醚麻醉状态下切开颅顶皮肤，于矢状缝与冠状缝相交及颞骨与人字缝相交处分别埋植脑电极，接于SJ-42多导生理记录仪，以在试验过程中记录大鼠的脑电图(EEG)及翻正反射恢复时间。将大鼠背位固定，分离双侧颈总动脉。于给药后30min大鼠清醒状态下用带硅胶管的小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，可见大鼠意识和翻正反射消失，眼变白，竖毛，呼吸加快。30min后去除动脉夹，造成再灌注模型，再灌同时股静脉注射60mg/kg伊文思蓝。60min后大鼠断头取脑，然后用生理盐水和丙酮混合液(3∶7v/v)制成10％匀浆(W/V)，密封放置过夜后，2500rpm离心15min，取上清液，以生理盐水-丙酮混合液调零，在620nm处测吸光度表示脑组织中伊文思蓝含量[以生理盐水-丙酮混合液为溶剂建立伊文思蓝吸光度值与浓度的标准曲线，以此反映该药对脑血管通透性的影响。结果由表4所示，银杏内酯K0.5，1.0，2.0mg/kg连续静脉注射4天可剂量相关性地缩短四动脉结扎-再灌所致全脑弥散性缺血大鼠的EEG和翻正反射恢复时间，降低脑匀浆伊文思蓝含量(高剂量组p＜0.01)。说明银杏内酯K能够保护缺血后的脑功能，降低毛细血管通透性。

表4银杏内酯Kiv对大鼠实验性弥散性完全性脑缺血的保护作用(n＝10， x±s)

组别	剂量(mg/kg)	EEG恢复时间(min)	翻正反射恢复时间(min)	伊文思蓝含量(μg/g脑重)
					假手术组模型对照尼膜同组金纳多组溶媒对照银杏内酯K	--0.21.0ml/kg-20.01.00.5	-46.5±7.839.0±5.7**37.5±6.8**47.0±4.8*△△△38.7±3.5***△41.0±2.1**△40.5±3.7**△	-30.1±4.324.7±4.8**24.1±5.5**31.9±2.8*△△△23.9±5.1***△26.4±3.3**△26.5±3.2**△	7.51±1.017.5±1.6◇◇◇15.5±2.2**◇◇◇15.2±1.9**◇◇◇17.9±1.4*△△△◇◇◇15.0±1.5***△◇◇◇15.3±2.0**△◇◇◇15.9±1.6**△◇◇◇

^*p＞0.05， ^**p＜0.05，  ^***p＜0.01     νs模型对照组

^△p＞0.05，^△△p＜0.05，^△△△p＜0.01  νs金钠多组

^◇P＞0.05，^◇◇p＜0.05，^◇◇◇p＜0.01  νs假手术组

具体实施方式

实施例1

      银杏内酯K       5.0g

    葡甲胺          5.0g

    NaCl            8.0g

    10％柠檬酸溶液  适量

取葡甲胺加新鲜注射用水1000ml溶解，于120℃高压灭菌30min，取出后于一万级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的银杏内酯K，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，加入NaCl 8.0g，针用活性炭2.0g，室温搅拌吸附30min，过滤除炭，加新鲜注射用水至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22μm微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿熔封，质检，印字，包装。

实施例2

    银杏内酯A       1.78g

    银杏内酯B       2.72g

    银杏内酯K       0.1g

    葡甲胺          5.0g

    NaCl            8.0g

    10％柠檬酸溶液  适量

取葡甲胺加新鲜注射用水1000ml溶解，于120℃高压灭菌30min，取出后于一万级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的银杏内酯A、B、K，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，加入NaCl 8.0g，针用活性炭2.0g，室温搅拌吸附30min，过滤除炭，加新鲜注射用水至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22μm微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿熔封，质检，印字，包装。

Claims (16)

1、一种银杏内酯K的制备方法，其特征在于该方法为：

取银杏内酯粗品3g置索氏提取器中，加乙酸乙酯或丙酮2500ml回流24小时，回收乙酸乙酯至浸膏状，用硅藻土拌样，烘干，研细，用石油醚∶乙酸乙酯/9∶1湿法装于低压硅胶柱，压力0.2-0.3k/cm²，以石油醚∶乙酸乙酯梯度递增洗脱，当石油醚∶乙酸乙酯/6∶4时，97～121流分，经TCL检查，甲苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇/5∶2.5∶2.5∶0.3，4％NaAc硅胶H板，与银杏内酯对照品比较出现银杏内酯斑点，将其合并浓缩，放置出现沉淀，母液留用，将沉淀以丙酮溶解，以制备型高效液相纯化，即得该化合物。

2、一种含有银杏内酯K药物组合物，其特征在于该组合物中银杏内酯K的有效剂量为组合物中含有0.1-90％的银杏内酯K。

3、根据权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物中银杏内酯K的有效剂量为组合物中含有0.5-60％的银杏内酯K。

4、根据权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物中银杏内酯K的有效剂量为组合物中含有0.5-5％的银杏内酯K。

5、银杏内酯K在制备治疗脑缺血药物中的应用。

6、银杏内酯K在制备治疗局灶性脑缺血或弥散性脑缺血药物中的应用。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指降低局灶性脑缺血再灌注后脑组织的梗塞范围和含水量，改善神经行为。

8、如权利要求6所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指降低脑组织中MDA、LA含量或升高超氧化物歧化酶和谷胱苷肽的含量，抑制组织缺血缺氧和过氧化过程。

9、如权利要求6所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指改善中动脉闭塞所致局灶性脑缺血脑组织的神经功能，或缩小梗塞面积、减轻脑水肿或降低中动脉闭塞大脑组织中的丙二醛和乳酸含量。

10、如权利要求6所述的应用，其特征在于所说的治疗弥散性脑缺血是指缩短弥散性全脑缺血脑组织的翻正反射恢复时间和EEG恢复时间，或降低脑血管通透性。

11、如权利要求2、3或4所述的药物组合物在制备治疗脑缺血药物中的应用。

12、如权利要求2、3或4所述的药物组合物在制备治疗局灶性脑缺血或弥散性脑缺血药物中的应用。

13、如权利要求12所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指降低局灶性脑缺血再灌注后脑组织的梗塞范围和含水量，改善神经行为。

14、如权利要求12所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指降低脑组织中MDA、LA含量，或升高超氧化物歧化酶和谷胱苷肽的含量，抑制组织缺血缺氧和过氧化过程。

15、如权利要求12所述的应用，其特征在于所说的治疗局灶性脑缺血是指改善中动脉闭塞所致局灶性脑缺血脑组织的神经功能，或缩小梗塞面积、减轻脑水肿；降低中动脉闭塞大脑组织中的丙二醛和乳酸含量。

16、如权利要求12所述的应用，其特征在于所说的治疗弥散性脑缺血是指缩短弥散性全脑缺血脑组织的翻正反射恢复时间和EEG恢复时间，或降低脑血管通透性。