CN1252158A - 极细小物体的高分辨率x射线成像 - Google Patents

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Abstract

一种用于X射线成像的样品室(10),它包括形成一样品腔(12)的装置(11),以及装在该装置上的可被合适的入射束(5)激发产生X射线辐射(6)的物质体(20),该样品室如此设置,使得在使用时,至少一部分所述X射线辐射穿过所述样品腔(12)而照射到其中的样品(7),然后穿出所述装置接受探测(35)。

Description

极细小物体的高分辨率X射线成像
发明领域
本发明总体上涉及利用穿透性辐射线比如X射线对极细小物体进行高分辨率成像。本发明尤其适于进行X射线相衬显微成像，并可有效地应用于显微物体与显微特征的极高空间分辨率(spatial resolution)成像，所述显微物体与显微特征包括细小的生物系统，比如病毒和细胞，可能还包括生物大分子。
背景技术
一种已知的利用X射线的显微术是投影X射线显微术(projectionX-ray microscopy)，在这种显微术中，聚焦的电子束激励并在金属箔或别的靶中生成一个点状X射线源。物体被置放在所述靶和一照相底板或其他探测板之间的发散射线束中。最近又提出了许多关于利用电子显微镜的电子束来激励用于X射线显微术的点状源的方案。Sasov在《显微学杂志》(J.Microscopy)147、169、179(1987年)提出直接将层析X射线照相设备结合到电子显微镜中去。Cazaux等人在《电子显微学杂志》(J.Microsc.Electron.)14，263(1989年)，Cazaux等人在《物理学杂志》(J.Phys.)(巴黎)IV C7，2099(1993年)，以及A.Michette等人编辑、Cheng等人的《X射线显微学 III》(Cheng et al X-rayMicroscopy III，ed.A.Michette et al(Springer Berlin，1992))第184页，提出了一种层析X射线照相附属设备的原型机，以作为使用电荷耦合器件(CCD)探测器的扫描电子显微镜的附属设备。Ferreira de Paiva等人(Rev.Sci.Instrum.67(6)，2251(1996年6月))研究并进一步改进了基于上述Cazaux及Cheng的方案的一种X射线显微层析照相(microtomography)系统的性能。上述方案是对商品化的电子显微镜的改进，能够生成分辨率大约为10μm的图像，而不需要对电子光学组件(electron optical column)进行大的变动。上述作者断定，对于他们所提出的设备，在X射线层析照相中，可获得1μm的分辨率。在这些产品中，所有的系统部件和图像密度数据(image intensity data)的判读方法均以吸收衬度机制(mechanism of absorption contrast)为基础。
在A Michette同S.Pfauntsch编辑的《X射线：第一个百年》(“X-rays：The First Hundred Years”)(Wiley，1996，ISBN 0.471-96502-2)第43-60页，可找到W.Nixon关于X射线显微学的一篇回顾文章。
本申请人的国际专利公开说明书WO 95/05725公开了适用于利用硬性X射线进行微分相衬成像的各种方案和条件。其他的公开文献有苏联专利1402871和美国专利5319694。在本申请人待授权的国际专利公开说明书WO 96/31098(PCT/AU96/00178)中，公开了实施硬性X射线相衬成像的实际方法。这些方法最好使用微聚焦的X射线源(可以是多色的)，且在物体和射线源之间以及物体和像平面之间要有合适的距离。在该申请中，以及在Wilkins等人的《多色硬性X射线相衬成像(“Phase Contrast Imaging Using Polychromatic Hard X-rays”)》(《自然》(伦敦)384，335(1996年))，以及在本申请人待授权的国际专利申请PCT/AU97/00882中，公开了得到来自物体的X射线波场(wavefield)在输出平面(exit plane)处的相变的各种数学方法和数值方法。在这些参考文献中给出的例子主要涉及宏观物体及宏观特征，以及在空间上与样品良好隔离的整装的普通实验室型X射线源。
本发明的目的是，至少在一优选实施例中的目的是，为显微物体及显微特征的X射线相衬成像提供便利。
发明方案
通过一种将电子显微镜作X射线成像改造的新方法，或者使用强激光源或X射线同步辐射源(synchrotron sources)生成微聚焦X射线源，本发明可以实现上述目的。
按照本发明的第一方面，提供了一种用于X射线成像的样品室，它包括形成一样品腔的装置，以及装在该装置上的可被合适的入射束激发产生X射线辐射的物质体，该样品室如此设置，使得在使用时，至少一部分所述X射线辐射穿过所述样品腔而照射到其中的样品，然后穿出所述装置接受探测。
在一种实施例中，所述样品室是一个完整的独立装置，其方式和尺寸适于插入与之匹配的扫描电子显微镜或显微探针的支承装置，例如样品载物台，中的合适位置，使得所述显微镜或显微探针的电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供用来激励所述物质生成X射线的入射束。
在另一种实施例中，所述物质可被入射的聚焦电磁辐射束激励而产生X射线，所述电磁辐射束例如是激光束或者同步辐射射线束。
所述样品室最好是一个层列，各层在平行于层平面方向上的尺寸在一微米左右到若干毫米例如10mm的范围内。所述样品室最好有下述特征，以适合用于相衬成像：所述被激产生的X射线从中穿过的各层应当高度均一，并具有非常平的表面，以使照射样品的入射射线束保持高度的空间相干性，从而使有用的图像衬度最优化。在所述可激励物质层之后的出射表面，以及样品室中随后的各层尤其应当如此。
所述可激励物质最好是一个贴附在形成所述样品室的结构上的物质层，但也可以是独立式的。该结构最好包括一个底层和/或一个隔离层，其将所述可激励物质层与所述样品隔离开，对X射线总体上透明，或者对X射线的某个或某几个能带透明。尽管对于有关的射线能带基本上透明，所述底层和/或隔离层也可以如此选择，使之强烈吸收所述能带之外的能量，以加强对生成图像有用的X射线束的色相干性(chromatic coherence)。
所述样品室可以是开放的，或者可以是密封的，例如可以允许在向电子显微镜样品腔中置入样品之后将所述样品腔抽为真空。所述样品腔或样品室可以设计为闭合的，若然，则所述结构包括一个透X射线的窗口，通过该窗口，所述X射线射出所述结构，以被探测到。
所述可激励物质层的厚度最好在10到1000nm的范围内，而该层与所述样品间的间隔可在1到1000μm的范围内。
按照该第一方面，本发明提供了一种X射线显微镜或显微探针，例如一种扫描X射线显微镜或显微探针，其具有生成聚焦电子束的装置和一个样品室，所述样品室如前述各方面或若干方面所述，被固定在支承装置的适当位置，使得所述电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供所述入射束以激励所述物质生成X射线。最好，为了实现极高分辨率成像，所述生成聚焦电子束的装置包括一个场致发射极尖电子源(field emission tip electron source)。
按照本发明的第二方面，本发明提供了一种方法，用来对一样品的一个或若干个内部边界或者其他特征形成放大的X射线图像，该方法包括：
将样品置入本发明第一方面所述的一个样品室中，然后将所述样品室安进一电子显微镜或显微探针的支承装置中的合适位置，使得所述显微镜或显微探针的所述电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供所述入射束以激励所述物质生成X射线；
用一电子束照射所述可激励物质，使所述物质产生X射线，所述射线的至少一部分穿过所述样品腔照射到所述样品，包括所述样品的一个或多个内部边界或其他的特征，然后射出所述样品室结构；
在所述射线照射所述样品之后，探测并记录其至少一部分射线，以生成所述样品之一个或多个内部边界或其他特征的图像。
所述X射线成像可以是吸收衬度(absorption-contrast)成像或相衬成像，或二者的因素都有。本发明尤其适合进行相衬成像。所述图像可以由所述探测器系统或别的装置进行能带过滤(energyfiltered)，或者也可以同时采集对应于一系列X射线能带的一组图像。
由所述可激励物质生成的X射线最好在中性到硬性X射线范围内，也就是从1keV到1MeV；所述X射线可以基本上是单色的，也可以是多色的。在前一情形下，所述方法可能还包括增强单色性的步骤。在实践所述方法或使用所述设备的过程中，样品到像平面的距离最好在约10到200mm。
进一步，本发明提供了一种X射线显微成像设备配置，包括支承样品的装置、可被合适的入射束激励以生成X射线的物质体，以及调节所述样品与所述物质体间的相对位置的装置。所述物质体被固定在一个底层上，使用中所述底层设置在所述物质体和所述样品之间从而用作一隔离层。
图面说明
下面结合附图通过实施例对本发明作进一步说明，图中：
图1是本发明第一方面的一个实施例的样品室的横剖面图，该样品室用来进行如本发明第二方面的一实施例所述的高分辨率硬性X射线显微成像；
图2是一变化的适于软性X射线的样品室；
图3是本发明另一实施例的样品室的类似视图，该样品室可对图像放大率进行相当大的改变，例如从100倍到100 000倍；
图4是所述靶层被刻图或被分割的一个实施例的示意图；
图5示出的是图1中的样品室被安装到一扫描电子显微镜(SEM)的样品载物台中的情况；
图6是另一个实施例，示出的是一结构更为松散的样品室安装在其工作位置的情况；
图7是示于图6的实施例的修改；
图8是一示意图，用以示出图1中影响图像放大倍数以及此后要加以引用的主要几何参数；
图9到图12是说明性的X射线强度分布图，是简单的圆柱形样品在不同尺寸和不同条件下所计算出的X射线强度分布。
优选实施例
示于图1中的所述样品室10是一个完整的独立装置，通常为三维长方体构型。该样品室包括形成一封闭样品腔12的结构，以及贴附在该结构11上的可被合适的入射束5激励以生成X射线6的物质体或者靶层20。样品室10如此设置，使得至少一部分所述射线6穿过样品腔12，从而照射该腔中的样品7，然后从所述结构中射出，接受X射线探测器35的探测。
装置10包括一个相对较厚的底层/隔离层22和一个相对较薄的窗口层24。所述两层之间有一定距离，以形成所述样品腔12，该腔在侧面由一圆周侧壁26封闭。靶层20系通过汽相淀积技术比如磁控电子管喷镀、热发射或电子束发射或化学汽相淀积(CVD)而镀到所述底层22的主表面23上，该面对于所述样品腔12来说是外表面。
在另一种方案中，所述样品腔12可以是开放的，但是，尤其是用于在自然条件下或实验室中研究生物样品材料时，其最好用密封垫圈或者其他合适的方式比如键合聚酯薄膜(bonded mylar)或环氧树脂加以密封。
在本实施例中，所述可激励物质靶层20是一个被激层，其通常由原子序数足够高的物质组成，以在电子束的激励作用下提供易于穿透该被激层及所述样品室其余部分的中性到硬性X射线(＞～1keV)。合适的材料例如包括金、铂、铜、铝、镍、钼和钨。该靶层20的厚度通常可以在10nm到1000nm。该层厚的选择要依据所希望的有效源大小，而后者尤其受到所需要的视场及激励射束的几何形状的影响，因为，由在所述被激层中激励产生的X射线源发出的X射线有一个发射角。
在用电子激励靶层20的情况下，该靶层可能需要电接地，以防止靶层充电，如果该层是导体的话。别的通过所述底层借助于热传导冷却所述靶层的改进措施也可以很有好处。
入射粒子或射线束，在此优选实施例中是电子束，最好有足够的能量，以激励出具有成像所需特征能量的X射线或成像所需的X射线韧致辐射波段。在由电子束激励的情况下，电子的能量最好是这样的，即，相对于建议在成像中使用的干线(principal lines)特征X射线能量，其具有足够的超压，以产生足够的X射线强度。这要求电子的加速电压可能在1kV到150kV。
所述底层或隔离层22的可能作用方式如下：
(i)作为相对较薄的靶层20的物理支承；
(ii)作为隔离层，以提供样品和射线源之间的可控隔离；
(iii)作为透射射线的能带过滤器；
(iv)作为靶层的辅助冷却装置。
在此，其厚度可以在1μm到500μm。该厚度是控制要得到的放大倍数的主要决定因素。该层的另一功能是减小在其上产生相对较硬的X射线的层厚，为此，与靶层20相比，该层通常要由原子序数较低或密度较小的材料组成。合适的材料包括：精制硅(商品化的晶片)，研磨或抛光的玻璃，铍、硼、云母、青玉、金刚石的薄层及其他用作底层的半导体材料。这些材料可以加工出接近原子级的光滑表面。在用作底层时，该层最好能够为被激材料薄膜(层20)提供物理支承，且最好：
(i)高度均一，即，在原子级别上密度、厚度均一；
(ii)具有极为光滑的表面。
以便不会显著降低由所述被激层产生的X射线波场的空间相干性，也就是保持照射样品的入射射线束的高度的空间相干性。这样，基于在国际专利公开说明书WO96/31098中所描述的设计，图像衬度就得到了最优化。
层22另外的一个功能是截去电子束在所述被激层中的溅射和散布，从而缩减X射线源的有效尺寸。在特定情况下，如果所述靶材料力学上足够稳固，且如果靶厚并不会加剧X射线源有效尺寸的扩大的话，可以不需要层22。
对所述样品室的所述基础设计的一种可能的修改是，挖空所述底层/隔离层，以减弱吸收效应(尤其是在激励低能X射线比如Al Kα的情况下)。在图2中示出了加以修改后的这种通常类型的样品室10′，在该图中，加撇的相应标号表示与前图中类似的部件。在层22′中形成的空腔标为30。在该空腔30和样品腔12′之间有一个剩余的薄部22a。该剩余薄部可以在样品一侧再镀上类似于薄层20′的一薄层材料25，但该层的目的是用作低能X射线的吸收过滤层。
出射层或者窗口层24、24′的作用可以是容纳所述样品，还可以过滤掉所述底层/隔离层22、22′被激产生的任何不希望有的X射线。所述底层/隔离层的有效源尺寸比被激层的要大，从而导致分辨率的损失，所以需要上述过滤过程。用于该出射层或窗口层的合适的材料可以是卡普顿(聚酰亚胺薄膜)、铝、聚酯薄膜、硅和锗。层24最好是光滑的且具有均一的密度，以避免在图像中因为相衬效应而产生额外的图像纹理。合适地选择所述厚度，以实现充分的能带过滤及对其中被封闭的样品的充分的物理支承。该出射窗口还可以镀上一层合适的X射线选择吸收剂。
对所述样品室的另一种改进为图3中的10″，其可使图像的放大倍数在相当大的范围内变动，比如从100倍到100 000倍。在图3中，类似的部件以带双撇的相应标号指示。放大倍数的改变是通过提供可激励靶层20″和底层22″而实现的，所述靶层和底层整体作为一个可在一圆周壁42内朝向或背离22a部分平动的单元40。或者是，所述周壁结构42可以朝向或背离所述靶层20″平动。
在另一种改进方案中，靶层20可以在一连续的底层22上被分割或刻图。图4示意了一个举例性的方案，其中，构成靶层20的金点20a间隔分布在一个硅基底22上。这种设计的优点是，用较宽的、聚焦不那么严格的电子束5仍然可以生成“源”尺寸可精确预测的X射线束6。
所述的样品室通常可以用微切削加工技术或普通技术加工成选定的尺寸，使之可以作为一个完整的独立单元，在其样品腔12中预置入样品7之后，被插入一种或多种类型的商品化电子显微镜或显微探针的样品载物台中。图5正是示意了一扫描电子显微镜(SEM)中基于图1的实施例的这样的装置。样品室10在装上样品之后被置放在一个支座50中，后者然后被悬挂固定在样品载物台60的上壁61上。支座50包括一对带有内折的底翼52a、53a的固定侧壁52、53，该两侧壁悬垂固定在上壁61上。在所述底翼52a、53a上，支承有可调的滑轨54、55。各相应的压力调节器(piezo-actuators)61对滑轨54、55相对于侧壁52、53在水平方向上，对样品室10相对于滑轨54、55在垂直方向上，进行精确的细调。
样品室10在载物台上壁61上的一个照射孔62的下方对中，通过所述照射孔，一电子束从保持在一扫描线圈72中的屏蔽管内射向靶层20。该电子束系从一合适的电子束源(图中未示出)生成，被一聚焦磁体75环绕以将该电子束聚焦至靶层20上。对于极高空间分辨率X射线成像，所述电子束源最好是场致发射极尖电子源，以使点源尺寸最小，从而增强如早先所述的侧向空间相干性(lateral spatialcoherence)。
样品载物台60用作针对杂散辐射的屏蔽，如同在通常技术中一样被固定在一个可进行大幅垂向调节的支架64上。整个装置安放在一个易抽空的由一层外壁76构成的室77中。在该装置的侧边装有一个辅助电子探测器78，以帮助准直和聚焦。
样品载物台60还包括一个环形部分66，其有一个中央孔67，该孔由一个带驱动装置69的光阑68控制。样品载物台60的底部63支承有一个X射线记录介质，用作探测器35，在此，其处于真空状态。但应当注意，在许多情况下，探测系统可以在所述真空室之外，如果是这样，就要在所述外壁76上设置合适的X射线透窗装置。另外，在本发明的另外的改进方案中，所述样品室本身可以构成所述外壁76上的真空窗。
使用上述的改进方案，就可以用显微镜来实现X射线吸收衬度成像或相衬成像：X射线6在穿出窗口层24之后，在X射线记录介质35上被探测到。使用CCD探测器的X射线成像系统或者感光的荧光成像板适合用作所述记录介质35。扫描仪可以用来影印所述成像板。本发明另一种有有益效果的实施例中，使用二维能量析像探测器，比如基于CdMnTe者，或者超导Josephson结，以同时生成各对应于一个X射线窄能带的一个或多个有效的X射线图像。所述图像是可用于本申请人待授权的国际专利申请PCT/AU97/00882所述的相位恢复方法(phase retrieval methods)中的相当适合的数据，尤其适合用于本文所述的显微成像所要求的高空间分辨率成像。
示于图4的设计适用于显微物体和显微特征，包括细小的生物系统比如病毒、细胞，可能还有生物大分子，的极高空间分辨率成像。该方案使得可以实现极细小的有效射线源尺寸，从而可以通过使源物距离非常小(直至几十微米量级或更小)同时使物至像平面的距离在宏观量级比如约10到100nm而获得高空间分辨率和高效的放大倍数。入射电子束5在靶上的聚焦宽度最好在10到1000nm。如前所述，为了使相衬成像效果最佳，如同本申请人待授权的国际专利申请WO96/31098所述，除了样品之外，所有的部件都应当尽可能地保持X射线束高度的侧向空间相干性，在实践中，这意味着，这些部件应具有极为光滑，事实上为原子级光滑的表面，而且最好具有高度均一的密度，也就是说，各部件应当高度均一，没有宏观缺陷和杂质。
所述X射线基本上既可以是多色的，也可以是单色的，这要随用途和图像的生成方法而定。在后一情况下，最好对单色性进行增强，例如通过合适地选择材料和/或撞击所述靶层的电子的激励电压。在前一情况下，最好使用能敏探测器。
图6示出了另一种实施例，其中，样品室110装在样品载物台上壁161的照射孔162中。孔162包括一个总体上为圆柱形的腔200，后者具有一个渐张的或锥形的上开口202和一个直径缩小的下开口204。腔200被一个固定的圆周环126分为下部和上部。所述圆周环126类似于图1所示实施例中的侧壁26。用来放置样品127的一个窗口台124被可调节地放置在一个唇状的环轨154上：与前文所述的实施例一样，由压力调节器156、157对样品的位置进行侧向和轴向的调节。
一个包括靶层120和底层/隔离层122的组合板置放在环126上，并且，如果需要的话，在顶上再设置一个固定环95，就完全完成了样品室的组装。可以看到，样品腔112部分地是由底层/隔离层122、环126和窗口台124限定而成的，所述靶层到样品的间距可以由压力调节器156、157在轴向上进行调节。
当然，一般来说，在显微镜中可以调节所述靶层或样品载物台以改变放大倍数。
图7是对图6所示实施例的修改，其中，类似的部分以带撇的相应标号表示。在此，所述部件形成一个由侧壁152限定而成的独立的装置150，该装置密合安装在开口204′的边缘203之上的腔200′中。在所述侧壁152上固定有分隔环126′，所述侧壁还有一个内折的底翼152a，用来滑动支承唇状环154′。
在前述的每一个实施例中，只有单个样品腔12。为了特定的用途，一个独立的样品室装置可以形成具有分立的样品腔的多个子室。
下面对扫描电子显微镜中的利用所述样品室进行X射线成像的装置的重要参数作一详细说明。为了此说明的目的，下列示于图1中的参数值可能要用到：这些值是适合用于实施本发明实施例的典型值或有代表意义的值。
t1  靶层20的厚度            10nm(及100nm)
t2  支承/隔离层22的厚度     10微米
t3  样品腔12的厚度          几微米(通常t3≤t2)
t4  窗口层24的厚度          几十微米，但此参数不是关键参数
α       入射电子束5的会聚角     2°
β       X射线束6的角宽          10°
loi窗口到探测器的距离       100mm
由于源尺寸有限而导致的图像模糊现象
由于射线源的尺寸有限而导致的像平面上的图像模糊在下述空间量级(spatial scale of order)上：
～|t1sin(β/2)|+|t1tan(α/2)|
这里仅考虑了纯几何效应。
对于为上述参数所选定的数值，该式给出的值约为1nm，因此在所取参数的情况下该值可以忽略不计。
放大倍数
影响放大倍数的主要几何参数M示于图8的示意图中。利用该近似，图像的放大倍数可由下式给出：
M≈(loi+t2+t4)/t2～loi/t2
对于loi～100mm，t2～10μm：
M＝100/0.01＝104。
因此，物体上的2.5nm大小的细部特征在图像中看起来有0.025mm(25μm)大。这样就可以与利用基于电荷耦合器件和感光的荧光成像板的高分辨率数字X射线成像系统可得到的一般空间分辨率相比拟了。
视场
为了有对样品(物)的大视场，希望β和t2都大。所述视场为
＝2t2tan(β/2)≈2t2β/2
对于在前选取的特定参数值，在物平面处：
～2×10×tan(5°)≈2μm
如果使用电子成像系统，通过扫描所述探针束，从同一样品可记录到许多图像。一个2微米的样品视场在像平面上对应的面积为
(2×104)×(2×104)(μm2)＝20×20(mm2)
这也与高分辨率电子成像系统比如CCD成像系统等的视场相当匹配。
衬度和分辨率
要对衬度和分辨率与用微聚焦射线源进行X射线成像所涉及的关键物理参数之间的关系进行详细的分析，会涉及以下关键量：
s         射线源尺寸
R1       射线源到物平面的距离
R2       物平面到像平面的距离
λ                 X射线的波长
u＝1/d    其中，u是在物体中的空间频率，其对应的空间周期为d
D         像平面上的空间分辨率
α               在准平面波的情况下的角偏向(angular divergence)
本发明人同其他人一起，对于对薄物体的部分相干照射的衬度和分辨率进行了经典光学处理，文章发表于Rev.Sci.Instrums.68(7)July1997(在本申请的优先权日之后)。对于吸收衬度和相衬对成像的作用，处理结果均可以表达为光学转换函数。在本说明书所附的表1中，归纳了决定X射线显微成像之衬度和分辨率的一些关键条件。更为具体地，可以看出，在球面波情形下(当前情形下)，最佳相衬由下式给出：
u＝(2λR1)-1/2
取R1＝10μm
λ＝0.1nm
则有u＝1/d～10nm。
由于射线源尺寸有限(比如s＝10nm)，对分辨率的相干限制dlow是
u＝1/s＝108m-1或者dlow＝10nm。
u的清晰度上限1/s是与上述最佳相衬相应的，在上述情形下，系当R1＝s2/2λ＝(10×10-9)2/(2×10-10)＝0.5μm时。
这些结果，对于给定X射线波长条件下要得到最佳衬度所需的关键参数的大小，给出了一些感性的认识。
对图像密度数据的分析，以及有效纯相(effective pure phase)图像和吸收衬度图像或者混合图像的分离，最好基于麦克斯韦方程或其合适的变式，例如，利用傅里叶光学或者合适的强度转换方程(Transport of Intensity Equations，TIE)，如在本申请人早先在此领域的申请中，尤其是在待授权的国际专利申请PCT/AU97/00882中所陈述者。
为了帮助说明在利用本发明对极细小物体进行X射线显微成像的情形下所预期的衬度和分辨率的特性，在图9到图12中示出了几个计算出来的说明性X射线强度分布图(图像截面)。这些计算是针对简单的圆柱形样品(物——不同尺寸的聚苯乙烯纤维，在不同的成像条件下进行的，其中，X射线为1keV，R1(射线源到物的距离)可变但R1+R2(R2是物像距)不变。主要的可观测特征是用1keV的X射线可达到的衬度和分辨率水平。在一级近似情况下，可以从表1所给的结果得到最大衬度的条件。
据以绘制图9到图12的计算是利用基于电磁辐射传播的Kirchhoff方程的波动光学进行的。所述计算涉及相当多的数值积分。吸收和相位效应都考虑到了。如图中可见，曲线表示像平面上的强度，其依赖于到物的距离。四幅图的纤维直径各不相同，但X射线都是1keV，R1+R2都固定在10cm。每一幅图都示出了R1(从而可知R2)的不同的值的曲线。垂直的虚线标出了有关纤维的边缘。即使对于最细的纤维(0.05μm)，对于合适的R1值，也有大约4％的衬度，这样的值是有用的。单位强度值对应于在没有物时所获得的强度。
X射线显微镜中的物体再现
样品(物)的投影结构，基于物的性质和所希望达到的精确度和复杂度，可以多种方式对一个或多个数字化图像进行重组而得到。在此，重组意味着要确定物体的投影折射率的实部(折射)和虚部(吸收)沿着光轴的分布。
在许多情况下，尤其对于显微镜一般所观测的薄物体而言，最为有用的出发点或许是下述线性化衍射方程(1维)：
I(u)/Io≌δ(u)-2sin(πλzu2)φ(u)-2cos(πλzu2)μ(u)      (1)
其中，λ是X射线波长，z是物像距，I、φ和μ分别是图像强度、物体相位和吸收传播函数的傅里叶表达式。变量u代表空间频率。假定入射的单色平面波在z方向传播。这里的讨论是在平面波情形下进行的，但对于显微技术来说，球面波事实上更为合适。通过适当的代数变换，球面波的情况可以从所述平面波的情形推导出来。
通常，不可能仅测量一次I(u)就同时确定φ(u)和μ(u)。至少需要利用不同的z值和λ值进行两次独立的测量。但是，如果是纯相位物体(pure phase object)，则式(1)中的最后一项消失，仅测量一次I(u)，也就是仅测量一幅图像，原则上就足以确定φ(u)，也就是由于物体的存在而导致的相移的空间分布了。但是，即使在这里，进行若干次测量也是有好处的，这样可以减少噪声的影响，以及“迁移函数”sin(πλzu2)的零值的影响，对于特定的空间频率u值，这二者会导致信息的损失。这就是在本方法中，“焦距”z和/或波长λ的可变性被视为有用的性能的原因之一。
对于充分小的λzu2值，式(1)还可以进一步简化，即，式中的sin项和cos项可以展开为一阶，从而得到：
I(u)-Io(u)≈-2πλzu2φ(u)                        (2)
该式类似于所述强度转换方程的形式(M.R.Teague J.Opt.Soc.Am.，A73，1434-41，(1983)；T.E.Gureyev，A.Roberts，& K.A.Nugent，J.Opt.Soc.Am.，A12 1932-41，1942-46(1995)；Gureyev & Wilkins，J.Opt.Soc.Am.A15，579-585(1998).)。该式描述了已经被证明(见Wilkins等，《自然》(1996))了的微分相衬方法(Pogany，Gao，& Wilkins，ReV.Sci.Instrum.68，2774-82(1997))。
如果线性理论不适用，则可以回到Fresnel-Kirchoff基础衍射方程(傅里叶空间)：
F(u)＝exp(-ikz)Q(u)exp(iπλzu2)                      (3)
并尝试求得能最好地模拟观测到的强度I(x)＝|F(x)|2的物体透射函数(obiect transmission function)Q。这可以反复迭代进行，类似于光学全息图像和电子显微镜图像的再现(恢复)的数值形式中所用的方式，并有人描述过若干种方法(J.R.Fienup，″Phase Retrieval Algorithms：AComparison″(相位恢复算法的比较)，Appl.Opt 21 2758(1982)；R.W.Gerchberg and W.O.Saxton，Optik(Stuttgart)35 237，(1972))。但是，收敛常常非常慢，因此，算法还有相当大的改进余地。
上述内容涉及的均是物体结构的一维或二维投影。对于三维物体的再现，通常需要至少两次投影(体视术)或更多次投影(用于X射线层析照相)。在本方法中，利用射束的偏转可以实现前者；后者则需要有精确旋转样品的装置，所述装置可以由普通的机械装置实现，但要在本发明所述的标准显微镜结构的基础上作进一步的改进。
所述样品室及与之相关的高分辨率硬性X射线成像(尤其是相衬成像)方法的优点如下：
·极高的空间分辨率(即，高效的放大倍数)。
·可作为专用样品室与高分辨率扫描电子显微镜结合使用。
·可用来在电子显微镜中在自然条件下或实验室中研究生物样品，不必要求生物样品本身处在真空中，尽管样品室是在真空中(但样品室被适当地密封，例如用密封垫圈或环氧树脂)。
·由于具有在比通常的生物材料软性X射线显微术更高的能量下获得图像衬度的能力，减少了辐射对样品的伤害。
·可以通过使用不同的被激靶材料和/或电子加速电压而改变X射线特征能量。
·由于是整体结构，提高了机械稳定性。
·样品室的出射窗可以用作低能X射线的带阻过滤器(rejectionfilter)，因而去除(清除)了不想要的背景辐射(尤其是来自所述底层/隔离层的背景辐射)，所述背景辐射由于具有较大的有效源尺寸而可能损害整体的分辨率。
·样品室的容积可以做得相当小。甚至可以通过合适的密封垫圈和施加压力而现场调节其容积，从而可以作适当的调节，以改善样品有关的特定特征的清晰度。
·样品室一般可重复使用。
·通过显微镜中的合适的加热载物台，样品室可以被维持于例如室温。
·可以通过迁移电子束或者平移样品室而观察大面积的样品，并可记录不同程度的曝光量。
·通过使用所述辅助电子探测器，或者通过使用电子成像探测器，可以方便地监控电子束在被激靶上的聚焦。
·或者通过使激励射束在靶上扫描，或者通过转动整个样品室，可以实现有限区域内的计算机化X射线层析照相(CT)。
表1
无透镜轴向式成像(in-line imaging)的特征总结
(据Pogany等，Rev.Sci.Instrums.1997年7月)
A.总体上
优点：设备简单，也就是，无透镜，无反射镜，无像差。
    一般的单色性要求。
    类似于现有的X射线照相系统。
    减少了非相干的散射的影响。
    波幅和相位信息均可从强度数据得到。
缺点：要求高度侧相干的源。
可能需要合适的图像再现方法。
有效的物理放大倍数受到源尺寸及样品与源间的隔离的限制。
无法物理接触焦平面，从而要考虑使用各种不同的对比机制。
对射束路径上的部件比如窗口和过滤装置的质量的敏感度提高了。
表1续
有关的量 平面波R1＞R2 球面波R2＞R1
B.相位衬度
最佳衬度：u＝ (2λR2)-1/2 (2λR1)-1/2
相干分辨率限度：u＝ 1/αR2  1/s
清晰度，u的上限 无 1/s，在R1＝s2/2λ时有最佳衬度
清晰度，u的下限(如果对微分相衬作一些修正，该下限则可大幅减小) α/2λ(＝相干宽度-1)，在R2＝2λ/α2时有最佳衬度 无(相干宽度＝λR1/s)
对高分辨率的限制 平行性(collimation)，探测器分辨率，物与探测器的接近度，能量的散布(energy spread) 源尺寸，物与探测器的接近度，能量的散布
C.吸收衬度
清晰度，u的上限 无；条件是R2＜1/uα  1/s，任意R1
清晰度，u的下限 无 无
对高分辨率的限制 探测器分辨率，物与探测器的接近度，能量的散布 源尺寸，能量的散布

Claims (32)

1.一种用于X射线成像的样品室，它包括形成一样品腔的装置，以及装在该装置上的可被合适的入射束激发产生X射线辐射的物质体，该样品室如此设置，使得在使用时，至少一部分所述X射线辐射穿过所述样品腔而照射到其中的样品，然后穿出所述装置接受探测。
2.如权利要求1所述的样品室，其中，所述样品室是一个完整的独立装置，其方式和尺寸适于插入与之匹配的扫描电子显微镜或显微探针的支承装置，例如样品载物台，中的合适位置，使得所述显微镜或显微探针的电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供用来激励所述物质生成X射线的入射束。
3.如权利要求1所述的样品室，其中，所述物质可被入射的聚焦电磁辐射束激励而产生X射线。
4.如权利要求1、2或3所述的样品室，其中，所述样品室是一个层列，各层在平行于层平面方向上的尺寸在一微米左右到10mm的范围内。
5.如权利要求4所述的适合用于相衬成像的样品室，其中，所述被激产生的X射线从中穿过的各层高度均一，并具有非常平的表面，以使照射样品的入射射线束保持高度的空间相干性，从而使在图像中有用的衬度最优化。
6.如前述任何权利要求所述的样品室，其中，所述可激励物质是一个贴附在形成所述样品室的结构上的物质层。
7.如权利要求6所述的样品室，其中，所述可激励物质层的厚度在10到1000nm的范围内，其如此设置，使得在使用时该层与所述样品间的间隔在1到1000μm的范围内。
8.如权利要求6或7所述的样品室，其中，所述结构包括一个底层和/或一个隔离层，其将所述可激励物质层与所述样品隔离开，对X射线总体上透明，或者对X射线的某个或某几个选定能带透明。
9.如权利要求8所述的样品室，其中，所述底层和/或隔离层强烈吸收所述选定X射线能带之外的能量，以加强对生成图像有用的X射线束的色相干性。
10.如前述任何权利要求所述的样品室，其中，所述被激物质体是固定在一公共底层上的被分割的或刻图的物质体区段组。
11.如前述任何权利要求所述的样品室，其中，所述样品室是开放的。
12.如权利要求11所述的样品室，其中，在向所述样品腔中置入样品之后将所述样品腔密封起来。
13.如权利要求1到10之任何一项所述的样品室，其中，所述样品腔可以闭合，所述结构包括一个透X射线的窗口，通过该窗口，所述X射线射出所述结构，以被探测到。
14.与一能敏或能量析像探测器结合使用的如前述任何权利要求所述的样品室。
15.一种X射线显微镜或显微探针，其具有生成聚焦电子束的装置和一个如前述任何权利要求所述的样品室，所述样品室可被固定在支承装置的适当位置，使得所述电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供所述入射束以激励所述物质生成X射线。
16.如权利要求15所述的X射线显微镜或显微探针，其中，所述电子束在所述被激物质体中的聚焦宽度在10到1000nm范围内。
17.如权利要求15或16所述的X射线显微镜或显微探针，其中，所述生成聚焦电子束的装置包括一个场致发射极尖电子源。
18.如权利要求15、16或17所述的X射线显微镜或显微探针，其还包括一个能敏或能量析像探测器。
19.适于构成如权利要求1到14之任何一项所述的样品室的一套部件，其中，其被装配到电子显微镜或显微探针的支承装置中的合适位置，使得所述电子束聚焦于所述被激物质体上，从而提供所述入射束一激励所述物质生成X射线。
20.一种用来对一样品的一个或若干个内部边界或者其他特征形成放大的X射线图像的方法，该方法包括：
将样品置入如权利要求1到14之任何一项所述的一个样品室中，然后将所述样品室安进一电子显微镜或显微探针的支承装置中的合适位置，使得所述显微镜或显微探针的所述电子束聚焦于所述可激励物质体，从而提供所述入射束以激励所述物质生成X射线；
用一电子束照射所述可激励物质，使所述物质产生X射线，所述射线的至少一部分穿过所述样品腔照射到所述样品，包括所述样品的一个或多个内部边界或其他的特征，然后射出所述样品室结构；
在所述射线照射所述样品之后，探测并记录其至少一部分射线，以生成所述样品之一个或多个内部边界或其他特征的图像。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述X射线成像是相衬成像，或者是吸收衬度成像和相衬成像的混合。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述入射X射线束和所述照射所述样品的射线具有高度的空间相干性，以使在图像中有用的衬度最优化。
23.如权利要求20到22之任何一项所述的方法，其中，所述电子束在所述被激物质体中的聚焦宽度在10到1000nm范围内。
24.如权利要求20到23之任何一项所述的方法，其中，所使用的样品室是一个层列，各层在平行于层平面方向上的尺寸在一微米左右到大约10mm的范围内，其中，所述被激产生的X射线从中穿过的各层高度均一，并具有非常平的表面，以使照射样品的入射射线束保持高度的空间相干性，从而使在图像中有用的衬度最优化。
25.如权利要求20到24之任何一项所述的方法，其中，由所述可激励物质生成的X射线在中性到硬性X射线范围内，也就是从1keV到1MeV，并且基本上是多色的。
26.如权利要求20到25之任何一项所述的方法，其中，由所述可激励物质生成的X射线基本上是单色的，并且，该方法还包括增强所述X射线单色性的步骤。
27.一种X射线显微成像配置，包括支承样品的装置、可被合适的入射束激励以生成X射线的物质体，以及调节所述样品与所述物质体间的相对位置的装置，所述物质体被固定在一个底层上，使用中所述底层设置在所述物质体和所述样品之间从而用作一隔离层。
28.如权利要求27所述的X射线显微成像配置，其中，所述底层也是所述X射线的一个过滤层。
29.如权利要求27或28所述的X射线显微成像配置，其中，所述物质可被一入射电子束激励，所述入射电子束例如是电子显微镜或显微探针中的电子束。
30.如权利要求27或28所述的X射线显微成像配置，其中，所述物质可被聚焦的入射电磁辐射束激励而产生X射线。
31.如权利要求27到30之任何一项所述的适用于相衬成像的X射线显微成像配置，其中，在所述物质体的出射边界之后，包括该边界，所述物质体和所述底层是高度均一并具有非常平的表面的层，以使照射样品的入射射线束保持高度的空间相干性，从而使在图像中有用的衬度最优化。
32.如权利要求27到31之任何一项所述的X射线显微成像配置，其中，所述被激物质体是固定在一公共底层上的被分割的或刻图的物质体区段组。
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