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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Invitrodiagnostik, wobei die Probe Röntgenstrahlung ausgesetzt wird, sowie eine zur Durchführung eines solchen Verfahrens geeignete Vorrichtung.
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Aus der
DE 10 2004 039 048 A1 sowie aus der
DE 41 278 778 C2 sind verschiedene Verfahren zur Bestrahlung von Proben mit Röntgenstrahlung bekannt, wobei in beiden Fällen von der jeweiligen Probe emittierte Röntgenfluoreszenzstrahlung erfasst wird.
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Die Untersuchung von Proben mittels Röntgenstrahlung ist bekanntermaßen prinzipiell geeignet, Informationen über molekulare Strukturen in der Probe zu erhalten. Beispielsweise sind Bindungsabstände in Molekülen mit Hilfe von Röntgenstrahlung ermittelbar. Als Röntgenquelle kommt für solche Untersuchungen insbesondere ein Röntgenlaser in Betracht. Hintergrundinformationen hierzu sind beispielsweise der Veröffentlichung "Seres J., Seres E., Hochhaus D., Ecker B., Zimmer D., Bagnoud V., Kuehl T., Spielmann C.: Laser-driven amplification of soft X-rays by parametric stimulated emission in neutral gases. Nature Physics, Vol. 6, June 2010, p. 455–461, online 18. April 2010" zu entnehmen.
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Eine Probe für eine Röntgenuntersuchung kann zum Beispiel in flüssiger Form auf ein Substrat aufgebracht werden. In der flüssigen Probe können Bestandteile wie Bakterien enthalten sein, die Gegenstand der eigentlichen röntgentechnischen Untersuchung sind. Hierbei können sich auf dem Substrat eine Mehrzahl an Bakterien oder auch nur ein einziges Bakterium befinden. Die Untersuchung eines einzelnen Objektes wie eines Bakteriums durch Röntgenstrahlung, insbesondere mit einem Röntgenlaser, erfordert eine exakte Positionierung des Objektes, idealerweise im Fokus der Röntgenstrahlung.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Präparation von in flüssiger Form vorliegenden Proben für die Invitrodiagnostik mittels Röntgenstrahlung gegenüber dem genannten Stand der Technik rationeller zu gestalten.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für eine Röntgenuntersuchung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch eine zur Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 10. Im Folgenden im Zusammenhang mit dem Verfahren zur Probenvorbereitung erläuterte Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung gelten sinngemäß auch für die Vorrichtung und umgekehrt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Invitrodiagnostik, das heißt Diagnostik außerhalb des Organismus, umfasst folgende Schritte:
- – auf ein bevorzugt flächiges Substrat, welches mittels eines Probenhalters gehalten wird und mindestens ein relativ zum Substrat ortsfestes Andockelement trägt, wird die Probe in flüssiger Form aufgebracht, derart, dass ein zur Wechselwirkung mit dem Andockelement geeigneter Bestandteil der Probe mit dem Andockelement wechselwirkt,
- – eine auf dem Substrat erkennbare optische Struktur, deren Lage durch die Lage des Andockelements gegeben ist, wird automatisch mittels Bildverarbeitung als relevantes Objekt identifiziert,
- – das relevante Objekt wird automatisch in den Fokus eines Röntgenlasers verfahren.
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Die Erfindung geht von der Überlegung aus, dass die Vorbereitung einer in der Invitrodiagnostik mit röntgentechnischen Methoden zu untersuchenden Probe einen wesentlichen Anteil der gesamten Untersuchungszeit in Anspruch nehmen kann.
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Die Qualität der Probe und damit der gesamten röntgentechnischen Untersuchung hängt typischerweise maßgeblich vom Können der die Probe präparierenden Person oder Personen ab. Dies gilt besonders für Fälle, in denen einzelne Untersuchungsobjekte mit Abmessungen im mikroskopischen Bereich, beispielsweise Bakterien, zu untersuchen sind. Der Fokus eines für die Untersuchung verwendeten Röntgengerätes ist auf die Lage der Untersuchungsobjekte exakt abzustimmen. Nach dem Stand der Technik gibt es hierfür bei Verwendung von Proben, die Untersuchungsobjekte an zunächst undefinierten Stellen enthalten, kein automatisiertes Probenvorbereitungsverfahren. Vielmehr ist jede einzelne Probe durch das Bedienungspersonal hinsichtlich der Verwendbarkeit für eine Untersuchung mit Röntgenstrahlung zu betrachten und, soweit die Probe prinzipiell für eine Röntgenuntersuchung geeignet ist, in der betreffenden röntgentechnischen Apparatur zu positionieren.
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Die Erfindung ersetzt dieses herkömmliche Präparieren, Kontrollieren und Positionieren einer röntgentechnisch zu untersuchenden Probe durch ein einziges maschinelles Verfahren, welches eine automatische Manipulation der Probe mit einem Bildverarbeitungsverfahren verknüpft.
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Im ersten Schritt dieses Verfahrens befindet sich das Substrat, auf welches die Probe, die zunächst im Wesentlichen in flüssiger Form, insbesondere in Form einer ausreichend fließfähigen Emulsion, vorliegt, aufgetragen wird, vorzugsweise in exakt waagerechter Lage. Alternativ kann das Substrat beim Auftragen der Probe in definierter Weise relativ zu einer horizontalen Ebene geneigt sein, so dass die Probe auf dem Substrat zunächst in eine definierte Richtung fließt, bevor das Substrat durch einen hierfür vorgesehenen Probenmanipulator in bevorzugter Weiterbildung verschwenkt wird.
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In beiden Fällen befindet sich bereits vor dem Auftragen der Probe mindestens ein Andockelement auf dem Substrat, welches die Aufgabe hat, einen Bestandteil der Probe, an sich zu binden, wobei diese Bindung chemischer oder mikrobiologischer Natur sein kann. Beispielsweise handelt es sich bei den Andockelementen um Antikörper.
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Um ein gezieltes Fließen der Probe auf dem Substrat in definierter, variabler Richtung zu ermöglichen und dadurch sicherzustellen, dass die der Bestandteil das Andockelement erreicht, ist der Probenmanipulator vorzugsweise zum Verstellen des Probenhalters ausgebildet, insbesondere zum Verschwenken des Probenhalters beispielsweise um zwei Achsen.
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Die allgemein als Andockelemente bezeichneten Elemente auf dem Substrat, welche mit Bestandteilen, insbesondere Molekülen, zum Beispiel Prionen, der Probe wechselwirken und hierbei zumindest ein einziges Exemplar dieser Bestandteile festhalten, sind in vorteilhafter Ausgestaltung an einen Farbstoff, insbesondere an einen Fluoreszenz-Farbstoff, gekoppelt.
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Das mindestens eine Exemplar der zu untersuchenden, in der Probe enthaltenen Bestandteile, beispielsweise Bakterien, ist in dem an das Andockelement gebundenen Zustand optisch auf dem Substrat erkennbar. Die Erkennung geschieht automatisch mittels eines Mikroskops und eines Bildverarbeitungsprogramms, welches datentechnisch auch mit dem Probenmanipulator verknüpft ist. Damit sind die Voraussetzungen gegeben, das als relevant identifizierte Objekt, bei welchem es sich um einen Bestandteil der Probe handelt, in den Fokus des Röntgenlasers zu verfahren.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung erfolgt die optische Untersuchung der Probe unter Nutzung eines Abbe-Komparators. Als technische Hintergrundinformation sei in diesem Zusammenhang die
DE 103 19 711 A1 genannt.
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Der Abbe-Komparator ist besonders zur Messung der relativen Höhe der in der Probe relevanten Strukturen, bezogen auf die Oberfläche des Substrats, geeignet. Die mit dem Abbe-Komparator vorgenommene Messung ist zur Justierung der Röntgenstrahlung geeignet, wobei eine Optik mit geringer Schärfentiefe verwendet und der Fokus bis zur Erreichung maximaler Schärfe verstellt wird. Die Einstellung maximaler Schärfe gibt eine eindeutige Information über die relative Höhe der röntgentechnisch zu untersuchenden Struktur.
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Eine sehr hohe Qualität der röntgentechnisch aufzunehmenden Daten ist erreichbar, indem die Probe auf ein Substrat aus Gold, welches als reflektierende Fläche wirkt, aufgetragen wird. Die Goldschicht ist hierbei bevorzugt als sehr dünne, monoatomar glatte Schicht auf Saphir aufgesputtert. Im Fall der Transmissionsspektroskopie ist als Substrat eine Glasplatte verwendbar. Theoretisch kann das Substrat auch durch einen Nährboden in einer Petrischale gebildet sein. Werden mehrere Proben röntgentechnisch untersucht, so werden in jedem Fall die betrachteten Probenausschnitte in vorteilhafter Weise derart in der röntgentechnischen Apparatur positioniert, dass die Streubilder eine im Wesentlichen gleiche Symmetrie bei vergleichbaren untersuchten Objekten aufweisen.
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Nach einer Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in die Probe mindestens ein Referenzobjekt eingebracht, anhand dessen der gesamte Ablauf des Verfahrens prüfbar ist. Als Referenzobjekte kommen insbesondere Nanopartikel, beispielsweise Nanoröhrchen, in Betracht. Derartige Nanopartikel können zum Beispiel aus Kohlenstoff aufgebaut sein. Auch Nanopartikel aus Kunststoff sind als Referenzobjekte geeignet.
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Eine erste mögliche Verfahrensalternative, welche mit sämtlichen vorstehend genannten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung kombinierbar ist, sieht vor, dass die Identifizierung der mindestens einen relevanten optischen Struktur innerhalb einer den Röntgenlaser umfassenden Röntgenanlage erfolgt. Mit anderen Worten: Das die Probe tragende Substrat ist, abgesehen von der Verschwenkung des Substrats, mit welcher ein Fließen der Probe in definierter Richtung bewirkt wird, sowie geringer translatorischer und/oder rotativer Bewegungen, mit welchen der anhand seiner optischen Struktur identifizierte Bestandteil relativ zum Fokus des Röntgenlasers ausgerichtet wird, ortsfest. Somit bleibt das Substrat vom Auftragen der Probe bis zur röntgentechnischen Untersuchung am selben Ort, nämlich in der mit einem Röntgenlaser als Röntgenquelle arbeitenden Röntgenanlage.
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Nach einer zweiten Verfahrensalternative ist vorgesehen, dass außerhalb einer den Röntgenlaser umfassenden Röntgenanlage zunächst die mindestens eine optische Struktur mittels Bildverarbeitung identifiziert und anschließend die Probe innerhalb der Röntgenanlage röntgentechnisch untersucht wird. Die Bildverarbeitung kann dabei mit Hilfe einer rein optischen, das heißt insbesondere nicht röntgentechnischen, Apparatur erfolgen, um anschließend die Probe in der röntgentechnischen Anlage zu untersuchen, wobei die geometrische Relation zwischen dem mindestens einen als relevant identifizierten Objekt und dem Substrat und/oder einem relativ zum Substrat ortsfesten Objekt, beispielsweise Probenhalter, zwischen der optischen und der röntgentechnischen Apparatur automatisch übertragen wird.
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In jeder Verfahrensvariante liegt der Vorteil der Erfindung insbesondere darin, dass durch ein maschinelles Verschwenken einer zumindest anfangs im wesentlichen flüssigen Probe auf einem Substrat, verbunden mit einer automatischen Identifizierung von optischen Strukturen auf dem Substrat, sowohl eine zeitsparende Probenvorbereitung als auch eine sehr gute Basis für die eigentliche röntgentechnische Untersuchung, speziell eine hervorragende Reproduzierbarkeit, gegeben ist.
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Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Hierin zeigt in schematisierter Darstellung:
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1 eine für die Invitrodiagnostik geeignete Röntgenanlage.
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Eine insgesamt mit dem Bezugszeichen 1 gekennzeichnete Röntgenanlage, hinsichtlich deren prinzipieller Funktion auf den eingangs zitierten Stand der Technik verwiesen wird, ist zur Invitrodiagnostik vorgesehen und arbeitet mit einem Röntgenlaser 2 als Röntgenquelle. Die Wellenlänge des Röntgenlasers 2 liegt in der Größenordnung von 30 nm, wobei die Röntgenstrahlung kohärent und monochromatisch ist. Der Fokus der vom Röntgenlaser 2 emittierten Röntgenstrahlung hat einen Durchmesser von ca. 30 μm (0,03 mm). Die Röntgenstrahlung wird gepulst mit einer Pulsdauer ca. 30 fs emittiert. Eine mit dem Röntgenlaser 2 und der zu untersuchenden Probe zusammenwirkende Detektoranordnung ist in 1 nicht dargestellt.
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Die vom Röntgenlaser 2 emittierte, in 1 durch gestrichelte Linien angedeutete Röntgenstrahlung ist geeignet zur Untersuchung einer Probe 3, welche mittels einer Probendosiereinrichtung 4, in der sie in flüssiger Form vorliegt, auf ein Substrat 5 getropft wird. Das Substrat 5 ist durch eine einatomige Goldschicht gebildet, die auf einem Saphir 6 ausgebildet ist.
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Zu Beginn der Probenvorbereitung, wie in 1 dargestellt, befindet sich das Substrat 5 exakt in waagerechter Lage. Auf dem Substrat 5 befindet sich mindestens ein durch ein Dreieck symbolisierter, als Andockelement 7 fungierender Antikörper, welcher mit einem Farbstoff, nämlich Fluoreszenz-Farbstoff, gekoppelt ist. Der Antikörper 7 ist ortsfest auf dem Substrat 5 angeordnet und in der Lage, einen Bestandteil 8 der Probe 3, nämlich ein Bakterium, an sich zu binden. Tatsächlich befinden sich auf dem Substrat 5 mehrere Andockelemente 7, nämlich Antikörper, und innerhalb der auf das Substrat 5 aufgebrachten Probe 3 mehrere potentiell mit diesen zusammenwirkende Bestandteile 8.
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In der Anordnung nach 1 ist noch kein Kontakt zwischen der Probe 3 und dem Andockelement 7, welches sich in bekannter Position auf dem Substrat 5, befindet, gegeben. Um die Probe 3, insbesondere dessen Bestandteil 8, in Kontakt mit dem Andockelement 7 zu bringen, ist ein Probenmanipulator 9 vorhanden, welcher dazu ausgebildet ist, das Substrat 5 über einen Probenhalter 10 um zwei zueinander orthogonale Schwenkachsen – im skizzierten Ausführungsbeispiel waagrecht innerhalb der Zeichenebene beziehungsweise senkrecht zur Zeichenebene – zu verschwenken.
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Die Verschwenkung des Substrats 5 geschieht automatisch, sobald die Probe 3 auf dieses aufgetragen wird und erfolgt unter Überwachung mittels eines Mikroskops 11 mit angeschlossener Bildverarbeitungseinrichtung 12.
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Nähert sich dem Andockelement 7 ein mit der Röntgenanlage 1 zu untersuchender Bestandteil 8, das heißt ein Bakterium, aufgrund des durch das Verschwenken des Substrats 5 bewirkten Fließens der Probe 5 auf einen hinreichend geringen Abstand, so dockt das Bakterium 8 an den Antikörper 7 an, welcher ein Bindungsmolekül trägt, das komplementär zu dem einzufangenden Objekt, das heißt Bakterium 8, ist.
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Nachdem mindestens ein zu untersuchender Bestandteil 8 der Probe 3 an einem der mehreren Andockelemente 7 gebunden ist, wird das Substrat 5 mit Hilfe des Probenmanipulators 9 wieder in seine ursprüngliche, horizontale Ausgangslage gebracht. Durch das Mikroskop 11 sowie die Bildverarbeitungseinrichtung 12 ist jeder als relevantes, zu untersuchendes Objekt identifizierte Bestandteil 8, welcher an ein Andockelement 7 gebunden ist, relativ zum Substrat 5 lokalisierbar. Die als relevante Objekte identifizierte, röntgentechnisch in der Invitrodiagnostik zu untersuchenden Bestandteile 8 haben typischerweise eine Größe von etwa 0,3 bis 600 μm. Im Zuge der Probenvorbereitung können die Bestandteile 8, das heißt Bakterien, getrocknet werden, indem durch Vakuum Wasser entzogen wird. Die verbleibenden festen Anteile, die die Struktur des jeweiligen Bakteriums darstellen, stehen dann für die röntgentechnische Untersuchung mittels des Röntgenlasers 2 zur Verfügung. Zur Ermittlung der relativen Höhe der zu untersuchenden Strukturen über dem Substrat 5 ist ein in 1 nicht dargestellter Abbe-Komparator verwendbar.
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Die Information über als relevante Strukturen vorliegende, gebundene Bestandteile 8, welche sich auf dem Substrat 5 nach dem Auftragen und automatischen, mit Methoden der Bildverarbeitung überwachten, mehrachsigen Verschwenken der Probe 3 befinden, wird weitergeleitet an eine Datenverarbeitungs- und Steuereinrichtung 13.
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Die Datenverarbeitungs- und Steuereinrichtung 13 ist datentechnisch über eine Datenverbindungsstrecke 14, welche kabelgebunden oder kabellos ausgeführt sein kann, weiterhin verbunden mit dem Probenmanipulator 9, so dass regelungstechnisch ein geschlossener Kreis gebildet ist. Abweichend von der symbolisierten Darstellung nach 1 sind einzelne Komponenten der Röntgenanlage 1 wie die Bildverarbeitungseinrichtung 12 und die Datenverarbeitungs- und Steuereinrichtung 13 nicht notwendigerweise als räumlich voneinander getrennte Funktionseinheiten ausgeführt. Insbesondere kann die Bildverarbeitungseinrichtung 12 softwaretechnisch innerhalb der Datenverarbeitungs- und Steuereinrichtung 13 realisiert sein.
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Der Probenmanipulator 9 verfährt das Substrat 5 auf Basis der mittels des Mikroskops 11 gewonnenen Informationen derart innerhalb der Röntgenanlage 1, typischerweise lediglich um höchstens einige mm, dass sich der zu untersuchende Bestandteil 8 genau im Fokus des Röntgenlasers 2 befindet.
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Zur Überwachung und/oder Kalibrierung des gesamten Ablaufs der Probenvorbereitung und -manipulation wird ein Referenzobjekt 15, nämlich mindestens ein Nanopartikel, genutzt, welches in die Probe 3 eingebettet ist.
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Im Ausführungsbeispiel sind sämtliche beschriebenen Komponenten, auch das Mikroskop 11 sowie die Bildverarbeitungseinrichtung 12, in die Röntgenanlage 1 integriert. Abweichend hiervon ist es auch möglich, die Bildverarbeitung außerhalb der Röntgenanlage 1 durchzuführen und erst im Anschluss das Substrat 5 im Fokus des Röntgenlasers 2 zu positionieren.
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In jedem Fall geschieht die Vorbereitung der Probe 3 für die röntgentechnische Invitrodiagnostik automatisiert, indem das Auftragen der Probe 3 auf das Substrat 5 unter automatischer Verschwenkung des Substrats 5 mit Mitteln der Bildverarbeitung überwacht wird und im weiteren Verfahren röntgentechnisch zu untersuchende relevante Objekte, nämlich Bestandteile 8, softwaregestützt identifiziert werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102004039048 A1 [0002]
- DE 41278778 C2 [0002]
- DE 10319711 A1 [0016]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Nature Physics, Vol. 6, June 2010, p. 455–461, online 18. April 2010" [0003]
