CN1236056C - 组织工程血管体外构建方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程血管体外构建方法及所采用的装置。本发明应用生物力学因素，刺激血管平滑肌细胞的增生，促进细胞的定向排布，增加平滑肌细胞的收缩特性和增加细胞——材料复合物中胶原含量及细胞中肌动蛋白重链的表达，并通过切应力诱导内皮细胞形成应力纤维。本发明的装置包括反应器，控制器两部分。控制器的信号端口通过导线与所述及的电磁阀相连接，形成搏动的水流和流量，以模拟体内的生理环境。该装置结构合理、性能稳定，便于操作，可进行数据的处理分析，为血管体外构建提供一个相对封闭、无毒、无菌、充足氧供的环境。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程血管体外构建方法以及所采用的构建装置，具体涉及一种可模拟人体血管搏动刺激及血流的冲刷作用的体外构建方法和生物反应器。
背景技术
随着如高血压、糖尿病等发病率的提高，周围血管疾病的发病率正逐年上升，因血管疾病需要进行血管移植的患者就超过100万，其中60％要求直径小于6mm的小血管，人们尝试了自体动静脉、异体、异种动静脉、人工血管内皮化等多种方法。但这些方法从长远的效果来看均存在或多或少的不足之处。80年代末组织工程概念的提出及飞速的发展给血管替代物的构建注入了新的活力，依据组织工程的方法构建血管也成为人们研究的重点之一。
目前主要面临着两个难题：1、种植的内皮细胞层不能耐受血流的冲刷而脱落，引起继发性的血栓形成，降低其远期的通畅率。2、在体外静态下形成的组织工程血管缺乏足够的弹性中膜支撑，不能达到或接近正常血管的结构强度。为此，许多文献和专利报道了各自的技术，如：Weinberg在1986发表于science的文章“A blood vessel model construcedfrom collegen and cultured vascular cells”所披露的技术，但是该技术存在着许多不足之处，采用该技术构建血管时，没有考虑到生物力学刺激因素，因此，其构建的血管缺乏足够的弹性中膜支撑，不能达到或接近正常血管的结构强度，推广使用具有一定的困难。寻求一种新的组织工程血管体外构建方法，是人们所十分期望的。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种组织工程血管体外构建方法及血管体外构建装置，以克服现有技术存在的血管缺乏足够的弹性中膜支撑，不能达到或接近正常血管的结构强度，以及种植的内皮细胞层不能耐受血流的冲刷而脱落，引起继发性的血栓形成，降低其远期的通畅率等缺陷。
本发明的技术构思是这样的：
发明人认为：在组织工程血管体外构建培养过程中，可应用生物力学因素，特别是搏动时的张力作用于细胞—材料复合物，能够刺激血管平滑肌细胞的增生，促进细胞的定向排布，增加平滑肌细胞的收缩特性和增加细胞—材料复合物中胶原含量及细胞中肌动蛋白重链的表达。另一方面，可通过切应力诱导内皮细胞形成应力纤维，在细胞贴附生长过程中，从弱到强逐步给予切应力的刺激，能够促使内皮细胞内应力纤维的“分布再塑”，同时使细胞的形态和排列方向发生顺应性的改变。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)静态培养：先将血管平滑肌细胞接种于塑形的药学上可接受的生物可降解材料管状物上，静态培养，形成基质，即细胞一材料复合物；
(2)动态培养：将细胞一材料复合物紧紧的贴附于弹性材料制成的圆管外壁，置于培养液中，同时使洁净的液体脉冲式地流过弹性材料制成的圆管，使圆管处于膨胀-收缩的状态，进行动态培养。通过控制所述圆管的搏动膨胀量及膨胀频率刺激血管平滑肌细胞的增生并分泌细胞外基质，促进细胞的定向排布，增加细胞—材料复合物中胶原含量及细胞中肌动蛋白重链的表达；
(3)直接培养：去掉弹性材料制成的圆管，在细胞一材料复合物的内壁种上内皮细胞，直接置于培养液中，同时使培养液连续不断地流过细胞—材料复合物的内壁。通过冲刷，促使内皮细胞沿流体流动方向定向排列。在细胞贴附生长过程中，为了达到促使内皮细胞内应力纤维的“分布再塑”，和促使细胞的形态和排列方向发生顺应性的改变，随着细胞的生长，培养液的流量逐步加大，第一周培养液的流量为800～900ml，第二周培养液的流量为1000～1200ml，第三周培养液的流量为1200～1500ml，培养时间为2～3周。
所述及的血管平滑肌细胞采用本领域公知的细胞块法取材培养和扩增，内皮细胞可采用本领域公知的Jeff创立的酶消化法取材培养和扩增。
所述及的培养液可采用常规的培养液，如DMEM等。
构建时弹性材料制成的圆管的搏动膨胀量为2～18％，优选的为5％；
圆管的工作压力为0.02～0.30Mpa，优选的为0.08Mpa。
搏动频率为30～200次/分钟；
所述及的弹性材料制成的圆管可优选采用硅胶管以及无毒具有弹性的圆管。
生物可降解材料塑制成人体的血管形状或特异圆柱形。
所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶或脱细胞基质及其混合物。
上述血管的构建是在一种血管体外构建装置中实现的，该装置至少包括：
一个设有培养液入口和出口的反应器，该反应器包括两端设有乳头的灌流室，入口和出口分别与乳头相连通；
一个通过管道与生物反应器培养液出口相连通的电动控制阀；
一个通过管道与电磁阀相连通的培养液贮罐；
一个通过管道与培养液贮罐相连通的培养液输送机械，该输送机械的出口与生物反应器培养液入口相连通，从而可实现培养液的循环流动；
一个设置在生物反应器培养液出口处的压力传感器；
一个通过导线与压力传感器相连接的控制器，所说的控制器的信号输出端口通过导线与所述及的电动控制阀相连接，从而使控制器能够根据所测得的压力控制电动控制阀的开和关，形成搏动的水流和控制流量，以模拟体内的生理环境。
该装置结构简单、便于操作，可长时间维持无菌小环境，组合后可方便置入CO2孵箱中，为血管的构建提供相对封闭、无毒、无菌、充足氧供、稳定温度的环境。采用上述的装置和方法所构建组织工程血管，可模拟体内的生理环境，有利于组织的形成及细胞的适应性再塑，能够刺激血管平滑肌细胞的增生，促进细胞的定向排布，增加平滑肌细胞的收缩特性，增加细胞—材料复合物中胶原含量及细胞中肌动蛋白重链的表达，诱导内皮细胞形成应力纤维。减少细胞的脱落。而且搏动性的刺激可促进血管平滑肌细胞的生长、繁殖及分化。同时，适当时间的体外培养可减少形成物中可降解材料的组分，从而减少机体对其的异物反应。
经动物和临床试验证明，采用上述的装置和方法所构建的组织工程血管，其细胞的壁厚为0.020～0.040cm，胶原干重为20～70％，缝合张力为100～500g，平滑肌细胞密度为1.5～3.5，接近正常的细胞组织。
附图说明
图1是本发明的装置的流程框图
图2是反应器结构图。
图3为图2中的A---A向示意图。
具体实施方式
结合图1、图2和图3可见，本发明的装置包括：
一个设有培养液入口14和培养液出口9的反应器7，该反应器7包括两端设有乳头11的灌流室5，入口14和出口9分别与乳头11相连通；
一个通过管道与培养液出口9相连通的电动控制阀10，可优选采用电磁阀；
一个通过管道与电动控制阀10相连通的培养液贮罐12；
一个通过管道与培养液贮罐12相连通的培养液输送机械15，该输送机械15的出口与培养液入口14相连通，输送机械15可优选采用蠕动泵；
一个设置在培养液出口9处的压力传感器16；
一个通过导线与压力传感器16相连接的控制器17，控制器17的信号输出端口通过导线与电动控制阀10相连接，控制器17设有温度、湿度、CO2浓度、培养液浓度以及流量、pH值的参数设定、控制以及调节机构，以及温度、湿度、CO2浓度、培养液浓度以及流量、pH值各参数实时显示、报警和数据的存储打印机构。
在本发明优选的技术方案中，所述及的反应器还包括反应器上盖4，为便于操作，灌流室5上方的上盖4处设有可开启的相对密封的透气盖13，乳头11上设有用于密封固定弹性材料制成的圆管和组织工程血管的锁紧构件6，保证接口的水密性。
按照本发明，在所述及的反应器7中可设置多个灌流室5，灌流室5之间设有密封槽2，乳头11通过树枝状的流道18分别与入口14出口9相连通。反应器7的灌流部分可由聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、不锈钢或玻璃钢加工而成。
实施例1
(1)细胞的培养和扩增：
内皮细胞：采用文献“Jones GE.Methods in Molecular MedicineHuman cell Culture Protocols.”公开的酶消化法取材。将人脐静脉或动物静脉血管，用浓度为0.1wt％的胶原酶灌注，37℃消化15分钟，收集消化液，接种于多孔板中，置于浓度为5％的CO2孵箱中培养，克隆形成后，2～3天换液一次；
平滑肌细胞：采用上述文献公开的组织贴块法。将取到的动脉血管仔细分离后，得到其中层，剪成大小约1-2mm2的小块，贴于培养皿中，粘贴牢固后，加入培养液，置于浓度为5％的CO2孵箱中培养，2～3天换液一次。
(2)细胞性质鉴定：
内皮细胞：VIII因子鉴定：
平滑肌细胞：α-ACTIN检测，平滑肌α-肌动蛋白检测。
(3)构建：
将培养的血管细胞接种于聚乳酸塑形的管状聚羟基乙酸上，在37℃的条件下静态培养5天，待基质形成后，将细胞一材料复合物放入血管生物反应器7内硅胶管外周，然后将附有细胞一材料复合物的硅胶管置于灌流室5中，硅胶管的两端与灌流室5两边的乳头11通过锁紧构件6密封连接，并在灌流室5中加入培养液，启动蠕动泵，使培养液连续不断地流过硅胶管，培养时间为5周，硅胶管的搏动膨胀量为5％，硅胶管的工作压力为0.08Mpa，搏动频率为115次/分钟。
然后去掉硅胶管，将细胞—材料复合物直接密封固定在灌流室两边的乳头上，启动循环泵，使培养液连续不断地流过细胞—材料复合物的内壁，第一周培养液的流量为900ml，第二周培养液的流量为1200ml，第三周培养液的流量为1500ml，培养液时间为1.5周，即可获得所说的的组织工程血管，所述及的培养液的组分和含量为：M199+20％FBS+20ng/mlVEGF+90ng/ml肝素。
采用组织学、免疫学、生物力学进行测试，该血管的性能如下：血管呈平滑肌细胞和内皮细胞两层结构且排列整齐，胶原密集，含量接近正常组织且不渗漏，可承受一定的张力作用，能进行缝合。
Claims (21)
1.一种组织工程血管体外构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)先将血管平滑肌细胞接种于塑形的药学上可接受的生物可降解材料管状物上，静态培养，形成基质，即细胞一材料复合物；
(2)将细胞一材料复合物紧紧的贴附于弹性材料制成的圆管外壁，置于培养液中，同时使洁净的液体脉冲式地流过弹性材料制成的圆管，使圆管处于膨胀-收缩的状态，进行动态培养；
(3)去掉弹性材料制成的圆管，在细胞一材料复合物的内壁种上内皮细胞，直接置于培养液中，同时使培养液连续不断地流过细胞一材料复合物的内壁，
其中在步骤(3)中进行培养时培养液的流量逐步加大。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，圆管的搏动膨胀量为2～18％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，搏动膨胀量为5％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，圆管的工作压力为0.02～0.30Mpa。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，圆管的工作压力为0.08Mpa。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，搏动频率为30～200次/分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶或脱细胞基质及其混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物可降解材料塑制成人体的血管形状或特异圆柱形。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，搏动频率为115次/分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，第一周培养液的流量为800～900ml，第二周培养液的流量为1000～1200ml，第三周培养液的流量为1200～1500ml，培养时间为2～3周。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，圆管为硅胶管以及无毒具有弹性的圆管。
12.一种用于权利要求1所述的组织工程血管体外构建方法的装置，它包括：
一个设有培养液入口(14)和培养液出口(9)的反应器(7)，
其特征在于，该反应器(7)包括两端设有乳头(11)的灌流室(5)，入口(14)和出口(9)管道分别与乳头(11)相连通；并且所述的装置还包括：
一个通过管道与培养液出口(9)相连通的电动控制阀(10)；
一个通过管道与电动控制阀(10)相连通的培养液贮罐(12)；
一个通过管道与培养液贮罐(12)相连通的培养液输送机械(15)，该输送机械(15)的出口与培养液入口(14)相连通；
一个设置在培养液出口(9)处的压力传感器(16)；
一个通过导线与压力传感器(16)相连接的控制器(17)，控制器(17)的信号输出端口通过导线与电动控制阀(10)相连接，并且所述的控制器(17)具有培养液流量的参数设定、控制以及调节机构，从而可使培养过程中的培养液流量逐渐增大。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，控制器(17)具有温度、湿度、CO2浓度、培养液浓度以及pH值的参数设定、控制以及调节机构。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，控制器(17)具有温度、湿度、CO2浓度、培养液浓度以及流量、pH值各参数实时显示、报警和数据的存储打印机构。
15.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，电动控制阀(10)为电磁阀。
16.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，输送机械(15)采用蠕动泵。
17.根据权利要求12～16任一项所述的装置，其特征在于，反应器(7)包括反应器上盖(4)，灌流室(5)上方的上盖(4)处设有可开启的相对密封的透气盖(13)，乳头(11)上设有用于密封固定弹性材料制成的圆管和组织工程血管的锁紧构件(6)。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，反应器(7)中设置多个灌流室(5)，灌流室(5)之间设有密封槽(2)，乳头(11)通过树枝状的流道(18)分别与入口(14)或出口(9)相连通。
19.根据权利要求12～16任一项所述的装置，其特征在于，反应器(7)的灌流部分由聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、不锈钢或玻璃钢加工而成。
20.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，反应器(7)的灌流部分由聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、不锈钢或玻璃钢加工而成。
21.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，反应器(7)的灌流部分由聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、不锈钢或玻璃钢加工而成。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101372663B (zh) * | 2008-03-18 | 2011-07-27 | 北京航空航天大学 | 一种具有血管牵张和脉动流灌注功能的血管组织工程反应器 |
| CN101372662B (zh) * | 2008-03-18 | 2011-06-08 | 北京航空航天大学 | 一种具有培养腔旋转和血管牵张功能的血管组织工程反应器 |
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-
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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