CN2738750Y - 一种心脏组织工程瓣膜脉动流培养装置 - Google Patents
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Abstract
本用新型包括平面和三维立体培养室，以及贮液室，并构建了脉动流培养系统：即体外循环机作为动力源；贮液室通气口供给含5％CO2的混合气体；恒温水浴箱保持脉动培养装置的恒温；瓣膜固定于平面和三维立体培养室内；各装置由医用硅胶管道连接。该系统能在亚生理和超生理状态下对流量进行精确调节，并且具有观察方便；装置牢固耐用，装卸、消毒简便；能保持良好的内环境稳定，可有效地模拟脉动流场进行种植细胞在体外的增殖、重塑；该系统经济、实用，能满足体外脉动培养及构建组织工程瓣的实验研究，极具推广价值。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种心脏组织工程瓣膜脉动流培养装置。
心脏组织工程瓣(tissue-engineering heart valves，TEHV)体外构建的一个关键问题是体外形成的单层内皮细胞能否抵抗血流的冲击，牢固地附着在瓣膜支架表面不脱落，这也是目前TEHV研究中的主要挑战之一。目前，心血管组织工程学研究中强调了种植在支架上的细胞在组织培养基质中，采用单纯静态培养，或用“沐浴”(bathing)培养是不够的，强调了在体外脉动培养，即模拟机体内脉动的流体力学环境，在不延长内皮细胞体外培养时间的情况下，增强种植细胞抗流体的剪切应力(shear stress)，促进内皮细胞骨架张力纤维的形成和成熟，提高其在支架上的粘附率和增殖能力，加快组织的形成和重构，这是实现组织工程瓣体外构建的一个重要方面。
二、背景技术
目前国外许多学者应用搏动性流体生物反应器(pulsatile-flow-bioreactor)中进行培养，以促进细胞增殖和组织的构建，使之更好的机械稳定性。生物反应器就是在体外模拟生理状况下主动脉瓣附近的压力和流场，种植细胞与支架复合体在其中培养一段时期的装置。
一个典型的细胞培养生物反应系统由四个基本构件组成：(1)模拟生理和化学环境的动力系统；(2)含有细胞培养介质的培养室；(3)气体供给的孵育器；(4)包括热传递的温度调控系统。然而，一个现代生物反应器研究装置，不仅包含上述4个组成部分，也包括机械刺激作用，如压力和剪切应力等。此系统应满足以下条件：紧凑的体积、无菌、低容量；容易更换培养液，易于观察组织工程瓣；动力泵不影响孵育器中的气体成分；培养介质必须暴露于控制的气体，包括O2、CO2、N2的弥散；此微环境中有足够的营养成分，并且无新陈代谢代谢产物的堆积。此外，该系统还必须模拟不同的血流动力学条件，如跨瓣压力差、流量和频率等，能满足整个瓣膜流体动力学的检测。目前常使用脉动流生物反应器，其组成主要有二个部分：左室(LV)和后负荷组成的可塑性囊腔。后者代表一个大动脉的弹性功能，一系列阻抗以模仿动脉和毛细血管功能。组织工程瓣被置入LV与囊腔之间，在流体动力学条件下，可控制的阻抗、顺应性、每搏输出量和频率在生理范围内进行调控，并与一个标准的细胞培养器相匹配，有稳定的温度和最佳气体供应，能适应长期的实验研究。这种生物反应器在国外属于专利产品，且价格极其昂贵，而国内尚无类似的装置。
三、发明内容
本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的心脏组织工程瓣膜脉动流装置。
本发明的目的是设计并构建心脏组织工程瓣脉动培养装置，为体外种植细胞与生物瓣支架复合体的脉动培养提供一种研究器材。我们自行设计并制造出平面和三维立体培养室，以及贮液室。用体外循环机作为动力源，贮液室通气口供给5％CO2及95％空气，恒温水浴箱保持脉动培养装置的恒温。脉动培养装置由医用硅胶管道连接，预充量大约为330ml。经2周的培养实验，进行生物力学和生物相容性测试。实验结果显示该装置接口处无渗漏、脱落、以及爆裂等。能保证供给5％±1％CO2；密闭系统中保持37℃±1℃的恒温；pH值在6.8～7.5之间；流量可在0.125～6.0L/min的范围内任意调节。同种瓣的内皮细胞经2周培养，扩增约10倍。同种瓣瓣叶和涤纶包布的细菌和霉菌培养均为阴性。实验结果说明我们自行设计与构建的脉动流培养装置能在亚生理和超生理状态下对流量精确调节，观察方便、牢固耐用；装卸、消毒简便；能保持良好的内环境稳定，可有效地模拟脉动流场实现种植细胞在体外的增殖、重塑。该系统经济、实用，能满足体外脉动培养及构建组织工程瓣的实验研究。
四、附图说明(见说明书附图页)
图1是整个脉动流培养系统构成图。图1中1是恒流转子泵；2是连接各个部件的硅胶管；3是贮液室上的气体进出口；4是贮液室上的加液孔；5是恒温水浴箱；6是贮液室；7是立体流控培养室；8是平面流控培养室。
用医用硅胶管道连接平面流控培养室、立体流控培养室和贮液室，并将三者放置于恒温水浴箱中。贮液室上的气体进口连接含5％CO2+95％空气的贮气瓶管道，加液孔在实验中未加液时用密封盖盖住，一段硅胶管道置于转子泵中，这样构成一个37℃恒温、流速和流量可调节、装置内无菌的密闭的系统，模拟脉动流场实现种植细胞在体外的增殖、重塑，满足体外脉动培养及构建心脏组织工程瓣的实验研究。
图2是平面流控培养室图，由树脂玻璃(Plexiglas)制成。为上、下两半组成，螺纹开口相连两部分，两侧有接头连接管道。图2中的图标9是培养室中的瓣膜片固定处，上面有许多小孔。
图3是立体流控培养室图，由树脂玻璃(Plexiglas)制成。为横卧的圆柱状，由两半组成，中间有螺纹开口相连，双侧有接头连接管道。图3中10是侧流管道；11是带支架瓣膜固定处，上面有许多小孔。
图4是贮液室图，由树脂玻璃(Plexiglas)制成，两侧有接头连接管道。图3中1是气体进出口；4是加液孔；12是气体进出口根部置入0.22μm滤膜，起过滤外界细菌等微生物作用。
下面用实施例对本发明进行进一步详细说明。
五、具体实施方式
实施例1.脉动流培养装置的构成
脉动流培养装置的构成由五大部分组成：
1.动力装置：附图1中的1是恒流转子泵，采用体外心肺循环机的转子泵作为动力源，能够模拟机体内的脉动流场，提供流体流动的剪切应力。在亚生理和超生理状态下对流量进行调控，即能在0.1L～10.0L的流量范围内进行精确调节。
2.气体供给部分：附图1中的6是贮液室，其上有气体进出孔(附图4中的3)和加液孔(附图4中4)。采用贮液室气体进出孔供给含5％CO2的混合气体，即5％CO2+95％空气。因为培养液pH值的恒定有赖于二元混合气(5％CO2+95％空气)。气体进出口底部均置有0.22μm的滤膜，以过滤除菌等微生物，即附图4中的12。附图1中的4和附图4中的4为加液孔，用来更换培养液。底部置有0.22μm的滤膜，以过滤除菌等微生物。
3.流控培养室：即实验瓣膜放置、固定之处。有平面、立体培养两种装置。
平面脉动培养室(附图1中8)：由树脂玻璃(Plexiglas)制成。平面流控培养室由两半组成，由螺纹开口相连上、下两部分的树脂玻璃制成，两侧有接头开口，螺纹旋紧后连接起来，成为一个密闭组件；中间有卡住固定瓣膜片的平板树脂玻璃(图2中9)，上面有许多小孔，缝线穿过小孔缝合瓣膜片。平面流控培养室的直径为4.5cm，高度为4cm。
平面流控培养室的作用是将组织工程瓣中的一个瓣叶平铺于图2中的9处，进行脉动流培养，提高瓣膜上种植的内皮细胞抗剪切应力。
立体流控培养室(附图1中7)：由树脂玻璃(Plexiglas)制成。图3中10是该装置的侧流管道；11是瓣膜固定处，上面有许多小孔，缝线穿过小孔缝合瓣膜。立体流控培养室为横卧的圆柱状，由两半组成，中间有螺纹开口相连，双侧有接头连接管道。上、下两半各有卡住带支架瓣缝合环的垫圈，以固定瓣膜(图3中的11)。，循环液流动时可模仿机体内流场对瓣膜产生中心性血流。
立体流控培养室的作用是将带支架的组织工程瓣整体置入，进行脉动流培养，改良组织工程瓣上种植的内皮细胞的生物学性能，提高其覆盖率和抗剪切应力。
3.贮液室(附图1中6)：由树脂玻璃(Plexiglas)制成。图4中3是气体进、出口。进入的气体为95％空气+5％二氧化碳；4是加液孔；12是气体进出口根部置入0.22μm滤膜，起过滤外界细菌等微生物作用。贮液池的高度为10cm，直径为4.5cm。
贮液室的作用是将95％空气+5％二氧化碳引入培养液中，同时定时更换培养液，以保持脉动流培养系统内环境的稳定。这些孔的根部均置入0.22μm的滤膜，以过滤除菌等微生物，保证整个脉动流系统内环境的无菌状态。
5.温控装置(附图1中5)：由于体积较大，无法放入二氧化碳培养箱中，因此，我们采用恒温水浴箱来保持脉动培养装置的恒温，即将流控培养室、贮液室和其连接部分管道完全置入恒温水浴箱中，使脉动培养装置中培养的内皮细胞与同种瓣支架均保持在恒温37℃。
实施例2.脉动培养装置的组装
整个脉动培养系统由平面流控培养室、三维立体培养室、转子泵、医用硅胶管道、贮液室和恒温水浴箱构成。
转子泵、恒温水浴箱和医用硅胶管道利用阜外心血管病医院现有设备。平面流控、三维立体培养室和贮液室田北京惠普医疗器械公司制造出。采用性能良好的医用硅胶管道连接平面流控培养室、立体流控培养室和贮液室。贮液室上的气体进口连接含5％CO2+95％空气的贮气瓶管道；加液孔在实验中未加液时用密封盖盖住。将平面流控培养室、立体流控培养室和贮液室置入恒温水浴箱中，一段硅胶管道置于转子泵中，这样构成一个37℃恒温、流速和流量可调节、装置内无菌的密闭的系统(附图1)，模拟脉动流场实现种植细胞在体外的增殖、重塑，满足体外脉动培养及构建心脏组织工程瓣的实验研究。整个系统完全透明，可直视观察。
培养系统的预充量大约为330ml。培养液由转子泵泵出后，经管道分别流入两个培养小室，对种植在瓣膜上内皮细胞施加剪切应力后，再经管道回到贮液室中。
实施例3.脉动流培养装置的流体力学和生物相容性的测试
一.方法
1.流体力学测试：在2周的培养实验中，逐渐增加流量和压力，即125ml/min、30mmHg，1～4天；250ml/min、40mmHg，5～7天；500ml/min、50mmHg，8～10天；750ml/min、75mmHg，11～14天。整个系统在运行期间，观测随流量变化，在亚生理流量、尤其是在超生理流量(3.5～7.0L/min)状态下，各装置与管道接口处有无渗漏、脱落、爆裂，以及溢出等；pH值变化，CO2供给的浓度及整各系统能否保持在预设范围等。
2.生物相容性测试：在三维立体培养室中放置带支架的同种瓣，并用培养内皮细胞的培养液预充整个系统。培养液组成：高糖DMEM，10％胎牛血清、谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、二性霉素B 2.5μg/ml。培养共持续2周，每隔4～5天半量更换培养液。
实验于培养的第8天、14天取其同种瓣瓣叶、培养液、瓣膜和支架涤纶包布分别作细菌和霉菌培养。
二.结果
1.生物反应器的流体动力学评价：实验中和结束时，各装置与管道接口处均未发现渗漏、脱落，以及爆裂等。CO2的供给能保证控制在5％±1％；密闭系统中温度保持在恒温37℃±1℃；pH值在6.8～7.5之间。流量在0.1L～10.0L/min之间能任意精确调节，可满足实验所需。
2.生物相容性测试结果：经2周的培养，同种瓣瓣叶、涤纶包布，以及培养液的细菌和霉菌培养均为阴性。证明该系统可维持细胞的生长环境不受外界影响，成为一个无菌、恒温、参数可调节的密闭系统。
Claims (5)
- 一种心脏组织工程瓣膜脉动流培养装置，其特征在于此装置由五个部件构成：(1)动力装置：采用体外心肺循环机的转子泵作为动力源，提供脉动流培养的流体流动的剪切应力。转子泵的流量和流速大小可调节，
- (2)气体供给部分：采用贮液室气体进出口供给含5％CO2+95％空气的混合气体，气体进出口均置有0.22μm的滤膜，以过滤除菌等微生物，保证培养液内环境的稳定，
- (3)流控培养室：即放置、固定实验瓣膜的组件，分平面流控培养室和三维立体流控培养室两种，由树脂玻璃制成，故透明。两者均为上下各半、靠螺纹旋紧构成完整的圆柱形，内部有固定瓣膜叶片和带支架瓣膜的固定装置，两侧有液体进、出口，
- (4)贮液室：贮液室由树脂玻璃制成，圆柱状，上设置有气体进出孔和加液孔，孔的根部均置入0.22μm的滤膜，以过滤除菌等微生物，保证整个脉动流系统内环境的无菌状态，
- (5)温控装置：采用恒温水浴箱来保持内置的流控培养室、贮液室和其连接的部分管道在恒温37℃；用医用硅胶管道连接平面流控培养室、立体流控培养室和贮液室，贮液室上的气体进口连接含5％CO2+95％空气的贮气瓶管道；加液孔在实验中未加液时用密封盖盖住，将平面流控培养室、立体流控培养室和贮液室置入恒温水浴箱中，一段硅胶管道置于转子泵中，这样构成一个37℃恒温、流速和流量可调节、装置内无菌的密闭的系统，模拟脉动流场实现种植细胞在体外的增殖、重塑，满足体外脉动培养及构建心脏组织工程瓣的实验研究。
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