CN1234447A - 芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体 - Google Patents
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Abstract
将烟草花药特异性基因TA29的启动子与在植物组织中组成型表达的启动子CaMV35S串联组合,在其之前加上花药特异性表达调节元件antherbox,构成高效的花药特异性嵌合启动子antherbox-pTA29－CaMV35S,将Barnase基因置于该嵌合启动子的控制之下,构成Barnase基因的花药特异性表达载体,使Barnase基因在花药中特异产生出一种核糖核酸酶,破坏花药绒毡层,从而导致植物雄性不育,为农业上作物杂交育种雄性不育系的获得开辟了一条崭新的途径。
Description
本发明涉及植物基因工程领域，即将来自解淀粉芽苞杆菌的Barnase基因置于经过改造过的植物花药特异性表达的嵌合启动子antherbox-CaMV35S-pTA29的控制之下，使其在植物花药绒毡层中特异而高效的表达。利用Barnase基因的RNase活性，破坏植物花药绒毡层，从而导致花粉败育，获得植物雄性不育系。该发明在植物杂交育种上有着广泛的应用前景。
Barnase基因编码一种胞外核糖核酸酶，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸组成，分子量为12.4KD[1][2]。
pTA29是来自烟草samsun TA29基因的启动子[3]。该基因的表达是花药特异性的，其产物集中在花药绒毡层中，一般是在减数分裂后不久就出现，在小孢子有丝分裂之前含量达到最高，在开花期迅速下降。启动子的缺失试验表明，TA29的转录控制序列位于该基因转录起始位点上游的-279～-150之间，这段序列是保证TA29基因在花药绒毡层中高效表达所必需的(Koltunow,1990)。试验表明：pTA29启动子可以控制外源基因在植物花药中特异性的表达。由pTA29-barnase构成的嵌合基因可以导致烟草、油菜等多种植物雄性不育[4][5][6]。
antherbox是来自矮牵牛类黄酮合成途径中CHI B基因PB启动子中的一段DNA序列，共有26个碱基对组成。该序列高度保守，其作用为调节CHI基因在花药中特异性表达[7]。此外，该序列还能使组成型表达的CaMV35S启动子在花药中特异性表达[8]。
该发明的目的之一是增强Barnase基因的花药特异性标达的强度。利用串联启动子可以增强表达的特性[9]。在pTA29启动子之前串联上CaMV35S启动子，以期增加表达的强度。
该发明的目的之二是利用antherbox可以调节启动子花药特异性表达的特性，在CaMV35S-pTA29嵌合启动子之前串联上antherbox，以增强该嵌合启动子表达的花药特异性，防止Barnase基因在植物的其它组织中表达。
该发明的最终目的是通过构建Barnase基因的植物花药特异性表达载体，利用基因枪和农杆菌侵染的办法，使Barnase基因在植物花药中高效而特异性的表达，从而破坏花药绒毡层，导致花粉败育，获得植物雄性不育系。为两系法育种中雄性不育系的获得提供了一条崭新的途径。
本发明主要包括以下几方面技术：一·烟草总DNA的提取
烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法，植物遗传转化技术手册，傅荣昭等，1994)1．取0.5g的新鲜烟草幼叶，加液氮研磨至干粉状，转入事先已放入500ul尿素缓冲液的离心管中(8M尿素，500mM Tris.Cl pH8.0,350mM NaCl,20mM EDTA，抽滤灭菌)。2．摇动离心管，使植物材料于缓冲液充分混合，加入500ul的酚∶氯仿(1∶1)，充分混匀。3．10000rpm离心5分钟，收集上清液，转移到一干净的离心管中，加入500ul的氯仿，重新抽提一遍。4．转移上清液到一干净的离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，静置沉淀10分钟。5．15000rpm离心5分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤一遍，室温干燥10分钟，加入200ul ddH2O溶解。6．取5ul琼脂糖电泳检测、定量。二·花药特异性基因TA29启动子的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction PCR)
根据已发表的TA29启动子的全序列，我们选取了该基因5’区-279～+12之间的一段作为目标序列，该序列包含TA29花药特异性表达所必需的122bp的控制序列。采用ABI 380型DNA合成仪合成双端引物：5'GCA AGC TTG CAT AAG GTG GGTGGC TG3’和5'GTC CAT GGA TGA TGT TGT ACT GTT ACA C3’。反应体系为50ul，其中包括：模板DNA2ul(0.2ug/u1),dNTPS 2ul(5mM),Mg2+3ul(25mM),PrimerⅠ1.5ul(20um),PrimerⅡ 1.5ul(20um),10x Buffer 5ul,ddH2O 15ul.反应程序为：94℃变形30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟。35个循环，然后72℃延伸7分钟，终止反应。三·嵌合启动子的构建
由于两个启动子首尾串联能增强基因的表达效率，因此，我们在花药特异性的启动子pTA29之前串联上在植物组织中组成型表达的CaMV35S启动子，构成嵌合启动子CaMV35S-pTA29。为了保证该嵌合启动子的花药特异性，我们在其5’端串联上来自矮牵牛类黄酮合成途径中CHI B基因PB启动子中的调控序列antherbox。该序列能调控CHI B基因表达的花药特异性。此外，该序列也能调控组成型表达的CaMV35S启动子花药特异性表达。四·Barnase基因花药特异性表达载体的构建
我们以pGEM-4Z为载体，将pTA29启动子和Barnase基因串接到该载体的多克隆位点之间。然后在pTA29的5’端连上CaMV35S和26bp的antherbox，在Barnase基因的下游连上NOS终止子。这样便构建成Barnase基因的花药特异性表达载体。报告基因的瞬间表达检测表明，Barnase基因的表达不但是高效的，而且是花药特异性的，其表达的范围局限于花药绒毡层之内。将该表达载体上花药特异性表达所需的元件转到由pBI121衍生的载体pBIC18上，使其置于T-DNA的LB和RB之间。这样便构建成了适合于农杆菌侵染的双元载体。同时，在该载体上加上除草剂抗性基因bar cassette，以便于在性状分离时利用除草剂筛选雄性不育系。图例说明：
在图例(1)中，Barnase为一种RNase基因，pTA29为来自烟草(Samsun)的花药特异性基因TA29的启动子。BamHⅠ,SacⅠ,KpnⅠ等为限制性内切酶识别位点PGEM-4Z为一种大肠杆菌质粒载体，Apr为氨苄青霉素抗性。Polycloning Site为多克隆位点，包括BamHⅠ,SacⅠ,EcoRⅠ.KpnⅠ,SmaⅠ,PstⅠ,HindⅢ等。
图例(2)中，载体pGTB由载体pGEM-4Z构建而来，其多克隆位点中插入了TA29启动子和Barnase基因。CaMV35S Promoter为花椰菜花叶病毒35S启动子。
图例(3)中，载体pGTB35S由载体pGTB构建而来，在TA29启动子上游HindⅢ和SmaⅠ两位点间插入了CaMV35S启动子。Nos Terminator为NOS终止子。
图例(4)中，载体pGTB35SN由载pGTB35S构建而来，在Barnase基因下游EcoRⅠ和SacⅠ两位点之间插入了NOS终止子。pBⅠC18是由pBⅠ121该建而来的载体，含有根癌农杆菌T-DNA两端的边界序列LB和RB。Kanr为卡那霉素抗性。
图例(5)、(6)中，载体pBⅠ-TB35X中HindHⅢ和EcoRⅠ两位点之间插入了NOS,Barnase,pTA29，CaMV35S等元件。并插入了花药盒antherbox。
图例(7)中，在pBⅠ-TB35X中插入了除草剂抗性基因bar cassette，构成了Barnase基因的花药特异性高效表达载体pBⅠ-TBSbar。该载体既适合于农杆菌侵染转化，也适合于基因枪转化。实施例1烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法，植物遗传转化技术手册，付荣昭等，1994)
1．取0.5g的新鲜烟草幼叶，加液氮研磨至干粉状，转入事先已放入500ul尿素缓冲液的离心管中(8M尿素，500mM Tris.Cl pH8.0,350mM NaCl,20mM EDTA，抽滤灭菌)。2．摇动离心管，使植物材料于缓冲液充分混合，加入500ul的酚∶氯仿(1∶1)，充分混匀。3．10000rpm离心5分钟，收集上清液，转移到一干净的离心管中，加入500ul的氯仿，重新抽提一遍。4．转移上清液到一干净的离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，静置沉淀10分钟。5．15000rpm离心5分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤一遍，室温干燥10分钟，加入200ul ddH2O溶解。6．取5ul琼脂糖电泳检测、定量。实施例2pTA29启动子的PCR扩增与克隆。
根据已发表的TA29启动子的全序列，我们选取了该基因5’区-279～+12之间的一段作为目标序列，该序列包含TA29花药特异性表达所必需的122bp的控制序列。采用ABI 380型DNA合成仪合成双端引物：5’GCA AGC TTG CAT AAG GTG GGTGGC TG 3’和5’GTC CAT GGA TGA TGT TGT ACT GTT ACA C 3’。反应体系为50ul，其中包括：模板DNA2ul(0.2ug/ul),dNTPS 2ul(5mM),Mg2+3ul(25mM),PrimerⅠ1.5ul(20um),primerⅡ 1.5ul(20um),10x Buffer 5ul,ddH2O 15ul.反应程序为：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟。35个循环，然后72℃延伸7分钟。终止反应。取40ul PCR扩增产物，加入2.5ul 134mM MgCl2,1ul1.25mM dNTPs,1ulKlenow(lu/ul),5.5ul ddH2O。25℃反应15分钟，然后72℃10分钟使Klenow失活。用酚∶仿抽提，乙醇沉淀DNA，然后用70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于10ul ddH2O中。将PCR产物与载体pUC18按摩尔比1∶1的比例混合，加入T4ligase于14℃连接5小时。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。实施例3Barnase基因花药特异性表达载体的构建
1．用BamHⅠ/SacⅠ,KpnⅠ/BamHⅠ分别从携有Barnase基因和pTA29启动子的质粒载体上切下这两个片段，琼脂糖凝胶电泳并回收。2．将回收的两个片段等体积混匀，加入T4 DNA连接酶，置于16℃连接5小时。3．将连接产物于经KpnⅠ/SacⅠ消化并回收纯化的pGEM-4Z载体以适当比例混合，加入T4 DNA连接酶，置于16℃连接5小时。4．将连接产物转化处于感受态的大肠杆菌Top10，并在含有100ug/ul氨苄青霉素以及IPTG和x-Gal的LB培养基上37℃倒置培养过夜。利用蓝白斑法筛选阳性菌落。5．挑取阳性菌落，提取质粒，进行限制性内切酶图谱分析，以确认各个元件都处于正确的连接，将该质粒命名为pGTB。6．从载体pBI221上切下NOS终止子，连接到pGTB中Barnase基因的下游，筛选阳性菌落，命名为pGTBN。7．用HindⅢ/SmaⅠ从载体pBI221上切下CaMV35S启动子，连接到经HindⅢ/EcoRⅠ消化过的pGTBN上。筛选阳性菌落，命名为pGTB35S。8．用HindⅢ/EcoRⅠ从pGTB35S上切下35S-pTA29-Barnase-NOS元件，连接到同样用HindⅢ/EcoRⅠ处理过的pBIC18上，构建成载体pBI-TB35S，使35S-pTA29-Barnase-NOS插入到T-DNA的LB和RB之间。该载体可以用根癌农杆菌侵染的方法转化植物。9．将人工合成的antherbox两条26bp的寡聚核苷酸各lug按等比例混合，置于60℃水浴中，在室温下随着水温的降低而使两条寡聚核苷酸链复性。用HindⅢ消化3小时后，连接到同样用HindⅢ消化过的pBI-TB35S上。利用原位杂交和PCR方法筛选阳性克隆，构建成载体pBI-TB35X。10．用HindⅢ从载体pBARGUS上切下除草剂抗性基因barcassette，连接到经HindⅢ消化过的载体pBI-TB35S上，构建成表达载体pBI-TB35Sbar。
与本发明有关的参考文献1．Hartley,R.W.et al.,1988,J Mol.Biol.202,913-915.2．Hartley,R.W.et al.,1989,Trends Biochem.Sci.14,450-4543．Seurinck,J.et al.,1990,Nucl.Acids Res.18,34034．Koltunow,A.N.et al,1990,Plant Cell 2,120l-12245．Mariani,C.et al.,1990,Nature 347,737-7416．Mariani,C.et al.,1992,Nature 357,384-3877．Van Tunen A.J.et al.,1990 Plant Cell 2,393-4018．Van der Meer I.M.et al.,1992 Plant Cell 4,253-2629．Omirulleh,S.et al.,1993,Plant Mol.Biol.21,415-42810．傅荣昭等，1994，植物遗传转化技术手册，中国科学技术出版社，北京
Claims (5)
1．一种质粒载体，含有高效的花药特异性嵌合启动子、Barnase基因、终止子和筛选标记基因。其特征在于该嵌合启动子可以调控Barnase基因在植物花药绒毡层中高效而特异性的表达。Barnase基因表达的产物为一种核糖核酸酶(RNase)，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸组成，分子量为12.4KD。该酶可以特异性的破坏植物花药绒毡层，导致植物雄性不育。
2．根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于Barnase基因的5’端组装了花药特异性的嵌合启动子antherbox-CaMV35S-pTA29。该嵌合启动子可以调节Barnase基因在植物花药绒毡层中高效而特异性的表达。
3．根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于在Barnase基因的3’端串联组装了增强表达能力的NOS终止子。
4．根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于在该载体上组装了NPT-Ⅱ基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡那霉素筛选。
5．根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于在该载体上组装了除草剂抗性基因bar cassette，作为转基因植物的筛选标记，可以用除草剂Bastar筛选。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 98101817 CN1234447A (zh) | 1998-05-04 | 1998-05-04 | 芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体 |
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| CN (1) | CN1234447A (zh) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN101410522B (zh) * | 2004-09-22 | 2013-06-26 | 阿博根公司 | 繁殖去除构筑体 |
| CN104164448A (zh) * | 2013-05-20 | 2014-11-26 | 清华大学 | 耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用 |
| CN104164448B (zh) * | 2013-05-20 | 2016-11-30 | 清华大学 | 耐高温核酸酶在培育植物雄性不育系中的应用 |
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1998
- 1998-05-04 CN CN 98101817 patent/CN1234447A/zh active Pending
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