CN1232392A - 包含Tyrphostin化合物的药物组合物 - Google Patents

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A·诺沃格洛德斯凯
A·勒维茨基
A·加兹特
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Abstract

用于对抗不希望有的细胞,组织或器官毒性作用的化合物,具有式(Ⅰ)的结构,其中:Ar是结构式(i)或(ii)的基团,n是0,或者当Ar是上面结构式(i),则n也可以是1,R是CN,－C(S)NH2,－C(O)NHR3,或者当R1是4－NO2,R2是H或3－OH时,则R也可以是结构式(iii),(iv),(v),(vi)的基团,在此R3是H,苯基,苯基(低级烷基),或吡啶甲基;R1和R2各自独立地是H,OH,NO2,或者当R是CN,也可以是CH3,F,或CF3,条件是R1和R2不同时是H。

Description

包含Tyrphostin化合物的药物组合物
发明领域
本发明是关于一类可用于对抗有害药物试剂引起损害的组合物，这种有害药物试剂特别包括用于癌症治疗的抗肿瘤药物如细胞毒性药物。本发明中损害意指对细胞，组织或者是器官的有害作用。本发明还涉及对抗这种损害的治疗方法。并且，本发明还提供了几种用于这种组合物和治疗方法的新型化合物。
发明背景
绝大多数常用的抗肿瘤治疗，包括化疗和放疗，都显示对分裂的细胞和某些器官功能的有有害的毒性作用。特别易受这种治疗影响的细胞是骨髓细胞，皮肤细胞和胃肠道上皮细胞。此外，这种治疗还经常引起特定的器官损伤，如肾脏和肝脏。由于这种毒性作用，从而限制了这种治疗的治疗指数(therapeutic index)。
长时间以来医学研究的一个愿望是，试验和开发既不影响药物治疗活性，又能降低有害毒副作用的治疗方式和方法，从而提高这种药物的治疗指数。
程序性(apoptosis)或渐进性细胞死亡，是在胚胎发育和机体正常体内平衡过程中细胞死亡的基本生理学调节机制。最近的研究资料指出，许多化学治疗剂的抗肿瘤作用，都与它们能够诱发程序性细胞死亡有关。这些药物试剂的毒性也可能与它们诱导正常细胞程序性细胞死亡有关。
已有初步报告论述，多种药物试剂可用于防止使用抗癌药引起的肾毒性(Skinner.R.,Current Opinion in Oncology,7:310-315,1995)。尝试对抗因使用细胞毒性药物顺铂引起的严重慢性近曲小管毒性。在对大鼠进行的体内试验中，对-氨基苯甲酸(PABA)与顺铂一起共同给药，导致顺铂的肾毒性降低，而不降低其抗肿瘤活性。其它一些药物试剂如mitimazole，氯丙嗪和L-精氨酸，也用于在各种与顺铂毒性有关的体内试验中对动物给药，仅得到了一些初步的不明确的结果。
被脱磷酸产生硫羟部分的药物氨磷汀也被用于降低抗肿瘤药物的毒性作用(Cancer Res.55:4069,1995)。
本发明概述
首先，本发明提供了一种药物组合物，用于对抗，即降低或者防止对细胞或组织的损害，此组合物含有作为活性剂的有效量的通式Ⅰ的化合物以及可药用载体：
Figure A9719859600091
其中：
-Ar是下式基团，
Figure A9719859600092
或
-n是0，或者当Ar是上面结构式(ⅰ)时，则n也可以是1，
R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者当R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH时，R也可以是下式基团，
Figure A9719859600094
或
Figure A9719859600095
在此R3是H，苯基，苯基(低级烷基)或吡啶甲基；
-R1和R2各自独立是H,OH,NO2，或者R是CN时，也可以是CH3,F，或CF3，条件是R1和R2不要同时是H。
该活性剂和药物组合物，可以在各种疾病中给药，或者使之与细胞或组织接触，以便降低或防止对细胞，组织或器官的有害损伤。例如，这种疾病可能是导致细胞程序性死亡的疾病。防止这种有害的程序性死亡是本发明的特定实施方案。这种疾病还可能是使细胞，组织或器官暴露于有害因子，这类因子可能是外源性或内源性因子，以及其它一些可能导致损害的生理性疾病，例如温度改变，血流减少，暴露于电离辐射等。有待预防的损害还可能是一种天然的生理学衰退过程的结果，例如那些在体外保存，生长或培养的细胞、组织或器官中发生的衰退过程。
本发明还提供了一种用于治疗病人，对抗细胞，组织，器官损害的方法，包括对病人给予有效量的通式(Ⅰ)化合物。
名词“有效量”应该被理解为意指对抗损害有效的活性化合物的量，而这种损害表现为对正常(无病的)细胞的破坏或者对组织或器官的损伤。
有害因子可能是外源性因素例如具有细胞毒性作用的治疗药物(如抗肿瘤药)，放射作用，有毒的化学药品等。此外，有害的因子也可能是内源性的，如在多种代谢过程中或其它紊乱中升高水平的自由基，自身抗体，细胞因子等。
本发明的药物组合物还可用于如下范围：治疗多种疾病，紊乱或病症，如AIDS，导致肝中毒的病症，辐射损伤，减少或抑制由于移植排斥作用对移植细胞或组织的损伤，用于治疗中毒如扑热息痛中毒，对抗治疗药物中有毒溶剂和载体的有害作用，对抗酒精引起的损害等。并且，该组合物还可以用于对抗不需要的免疫中介反应或炎症反应，如脓毒性休克，减少自身免疫反应引起的损伤，等等。最后，本发明的药物组合物还可以用于在体外保存将用作移植的细胞或组织，减少或防止在移植之前的体外保存过程中将发生的细胞或组织的衰退或死亡等。
本发明的药物组合物在对抗细胞毒性药物或抗代谢药物的，特别是例如用于癌症治疗药物的毒性作用中是非常有用的。有时，本发明的药物组合物将和此细胞毒性药物一起共同给药。据此实施方案的药物组合物可能含有这种药物和上述结构式Ⅰ的化合物。
结构式Ⅰ的化合物属于Tyrphostin化合物(Levitzki,A.，和Gazit,A.,Science,267:1782,1995)。在下面的叙述中，结构式Ⅰ的化合物将被称为“Tyrphostin”，而含有这种化合物的组合物常常被称为“Tyrphostin组合物”。
在来自结构式Ⅰ的Tyrphostin化合物中，有一些是已知的，但它们具有不同于本发明所提供的用途，而另一些是新颖的。这些新颖的Tyrphostin化合物构成了本发明的另一独立方面，它们是如下的结构式Ⅰ化合物，其中Ar,R1,R2和R3定义同上，但条件是：
a)R不能是
Figure A9719859600111
b)当R是CN，并且n是0时，那末
(ba)如果R1和R2中的一个是H或OH，则另一个不能是NO2，
(bb)如果R1和R2中的一个是H或F，则另一个不能是H或F，以及
c)当R1是4-NO2,R2是H，和n是0时，则R不能是-C(O)NH2，或-C(S)NH2。
用于该组合物的优选的式Ⅰ化合物，是那些其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5或如下结构式的基团
Figure A9719859600112
并且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
tyrphostin化合物实例被列举在化合物表1中。列举在化合物表1中的一些tyrphostin化合物是新颖的，这些新颖的tyrphostin化合物也被列举在化合物表Ⅱ中。
化合物表Ⅰ
1该号码指下文所附的参考文献号
化合物表Ⅰ(续)
化合物表Ⅱ(新化合物)
本发明所使用的某些已知
化合物的参考文献列表
1．Mowry,D.T.,J.Am.Chem.Soc.,67:1050,1945.
2．Zabichy,J.,J.Chem.Soc.,683,1961.
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4．Junck,H.,and Wolny,B.,Monat.Chem.,107:999,1976.
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6．Sakamoto,M.,et al,J.Chem.Soc.,Perkin Trans I.,1759,1995.
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(b)Lythgoe,K.,Todd,A.and Tapham,C.J.Chem.Soc.,515,1944
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11．Gazit,A.,et al.,J.Med.Chem.,32:2344,1989.
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13．Blox Ram,J.,Dell,C.P.,and Smith,C.W.,Heterocycles,38:400,1994.
本发明特别优选的tyrphostin化合物，是在上面“化合物表Ⅰ”中被指定为AG1714,AG1744,AG1801和AG1843的化合物。这四个化合物中，后二个是新的。
式Ⅰ的tyrphostin化合物可以同另一种治疗剂结合对病人给药，例如同细胞毒性药物或放疗剂结合。在这种协同治疗中，tyrphostin化合物可以同其它治疗同时进行，或者不同时间进行，以便产生最大的效果。一个特别的例子是在给予其它治疗之前给予tyrphostin化合物，例如在放疗或给予细胞毒性药物之前几小时给药。
本发明发现，当把结构式Ⅰ的tyrphostin化合物同另一种治疗剂一起给药时，它们不会降低另一种活性剂的治疗活性，而是有助于降低对正常细胞或组织不希望有的毒副作用。这意味着，以相同剂量的治疗剂，仍然可达到所希望的相同治疗效果。例如，在使用化疗药物的情况下，以一定的给药剂量给予tyrphostin化合物，对药物降低肿瘤重量或者阻止肿瘤生长或复发的作用没有影响，或者可能只有极小的影响。但是，在某些情况下，给予tyrphostin化合物甚至会增强这种治疗作用。因此在这种组合治疗中，tyrphostin化合物的总体作用是增加另一种治疗的治疗指数，也就是说，增加其治疗作用与其有害毒副作用之间的比率。治疗指数增加有时可能对增加治疗剂的剂量是有利的，例如，增加细胞毒性剂或放疗剂的剂量，而不会同时增加有害的毒副作用。
本发明的tyrphostin可以是一次给药，或者在一段时间内，例如，在以细胞毒性剂治疗或放疗之前，之中和之后重复给药。
tyrphostin对人的优选给药方式是静脉内给药，尽管如此通过适当地配制，也可以按其它方式给药，例如肌肉注射，腹膜内注射或口服给药。
虽然tyrphostin组合物一般都包含一个tyrphostin化合物，但有时也可能以组合物和/或共同给药的形式，包含2个或几个tyrphostin化合物，它们以协同或补充的方式共同发挥作用来对抗由例如治疗过程引起的损伤。
附图简述
图1A图解显示用阿霉素处理的小鼠死亡率，与在用阿霉素处理之前二小时接受一次AG1714注射给药的小鼠死亡率相比较。
图1B图解显示用顺铂处理的小鼠死亡率，与在用顺铂处理之前二小时接受一次AG1714注射给药的小鼠死亡率相比较；
图2图解显示21天内接受10次腹膜内注射阿霉素(5mg/kg，累积剂量50mg/kg)的小鼠死亡率，与同样处理，并且在每次阿霉素注射之前二小时接受一次AG1714腹膜内注射(5mg/kg)的小鼠死亡率相比较；
图3图解显示仅用顺铂处理的，或者在顺铂给药后的10天时间内以顺铂和AG1801处理的小鼠死亡率；
图4图解显示仅用阿霉素处理的，或者在阿霉素给药后10天的时间内以tyrphostin化合物和阿霉素处理的小鼠死亡率；
图5图解显示多种tyrphostin化合物对顺铂处理小鼠肾毒作用的影响。这种毒性作用是通过检测被处理小鼠血清中肌酸酐的水平来测定的，高水平肌酸酐表明肾脏受损伤(肾毒性)；
图6图解显示对小鼠仅给予顺铂或AG1714，或者合并给予顺铂和AG1714后，血清中的肌酸酐(图6A)和血脲氮(BUN)(图6B)水平(它们表明肾毒性)。此肌酸酐和BUN水平与只给予赋形剂的对照小鼠血清中相同物质的水平相比较；
图7的照片显示对仅给予顺铂的小鼠，或在给予顺铂之前先给予tyrphostin AG1714的小鼠所进行的肾脏(图7A-C)和小肠(图7D-F)的组织病理学分析。最后的放大倍数为×400；
图7A-未处理的正常小鼠肾组织；
图7B-仅给予顺铂的小鼠肾组织，显示近曲小管内有蛋白质大斑块；
图7C-在给予顺铂之前先给予AG1714的小鼠肾组织，显示正常的肾组织结构；
图7D-未处理的小鼠小肠组织；
图7E-仅给予顺铂的小鼠小肠组织，显示严重的坏死和损伤；
图7F-在给予顺铂之前先给予AG1714的小鼠小肠组织，显示正常的小肠组织结构；
图8图解显示仅给予抗-FAS抗体注射液的小鼠，或者合并给予tyrphostin AG1801的小鼠血清中二种转氨酶，天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。转氨酶的高水平表明抗-FAS抗体诱发了对肝脏的损伤(肝毒性)，
图9图解显示，仅给予抗-FAS抗体注射液的小鼠，或者合并给予tyrphostin AG1714的小鼠血清中二种转氨酶AST和ALT的水平，转氨酶的高水平表明抗-FAS抗体诱发了对肝脏的损伤(肝毒性)；
图10图解显示，仅用ConA处理的小鼠，或者合并给予AG1714的小鼠血清中AST和ALT水平；
图11图解显示用TNF/GalN处理的小鼠，或者合并给予tyrphostinAG1714的小鼠血清中AST和ALT水平；
图12图解显示，仅以阿霉素处理的，仅以AG1714处理的，或者以它们合并处理的小鼠股骨骨髓中，具核骨髓细胞的数量(图12A)，或集落形成单位(CFU)(图12B)的数量；
图13图解显示，仅以阿霉素处理的，或者以AG1714和阿霉素处理的小鼠骨髓中具核细胞的数量；
图13A显示给予不同剂量阿霉素的小鼠骨髓中具核细胞的数量；
图13B显示用阿霉素处理后，在不同时间被处理小鼠的骨髓中具核细胞的数量；
图14图解显示，仅以阿霉素处理的，或者在阿霉素给药之前先以AG1714处理的小鼠脾重量(图14A)和胸腺重量(图14B)；
图15图解显示仅以5FU处理的，或者以5FU和AG1714处理的小鼠股骨中具核骨髓细胞的数量；
图16图解显示仅以丝裂霉素-C处理的，或者以丝裂霉素-C和AG1714处理的小鼠股骨中具核骨髓细胞的数量；
图17图解显示仅以阿霉素处理的，或者在阿霉素给药之前不同时间以AG1801处理的小鼠骨髓中具核细胞的数量；
图18图解显示放射性照射的小鼠(300R)和照射之前先以tyrphostin AG1714处理的小鼠骨髓中具核细胞的数量；
图19图解显示放射性照射的小鼠(450R)和照射之前先以tyrphostin AG1714处理的小鼠骨髓中细胞的数量；
图20图解显示以致死剂量照射(800R)后小鼠的死亡率，同在照射之前用tyrphostin AG1714处理的小鼠死亡率相比较，显示照射后23天内的死亡率；
图21图解显示以MCA-105肌纤维瘤细胞(图21A)，路易士肺癌细胞(图21B)，或B-16黑素瘤细胞(图21C)接种的，并且用顺铂或AG1714单独治疗，或者用顺铂和AG1714合并治疗的小鼠肺重量；
图22图解显示负有SK-28人黑素瘤细胞肿瘤的，并且用阿霉素，AG1714或用它们合并治疗的裸鼠肺重量；
图23图解显示在用顺铂或AG1714单独治疗，或者用它们合并治疗的小鼠中，人卵巢癌肿瘤(OVCAR-3)的体积；
图24图解显示，在上面图23中所述的，反复接受给药治疗的小鼠中，OVCAR-3肿瘤的体积；
图25图解显示，在用顺铂或AG1801单独治疗，或用此二者合并治疗的(图25A)，或者用阿霉素，或AG1801单独治疗，或用它们合并治疗的(图25B)负有MCA-105肌纤维瘤的小鼠中肺的重量；
图26图解显示用顺铂或AG1801单独治疗的，或者用此二者合并治疗的小鼠肺重量；
图27图解显示，在含有或不含有各种浓度AG1714下生长的骨髓细胞培养物中，集落形成单位(CFU)的数量；
图28图解显示，存在或不存在AG1714下生长的胸腺细胞，在对细胞加入AG1714后不同时间的生存能力；
图29图解显示，作为细胞生存能力指示的，存在或不存在AG1714下生长的培养心肌细胞每分钟的搏动次数；
图30图解显示，存在或不存在AG1714时，以鼠腹膜渗出物胞毒淋巴细胞(PEL)胞溶EL-4靶细胞而导致其特异性51Cr释放的百分数来测定的细胞溶解百分数。
制备实施例
在下面的制备实施例中，示范性地制备了几个上述的新颖化合物。在下面所有的实施例中，这种新颖化合物是通过醛与丙二腈或其取代的酰胺，进行knoevenagel缩合反应来合成的。实施例1-AG1801：
将0.45g,3mM对-硝基苯甲醛，0.61g,3.5mMN-(氰基乙酰)苄酰胺(参考文献9)和50mgβ-丙氨酸在20ml乙醇中回流加热5小时。冷却，过滤后得到0.67g淡黄色固体物，产率73％,mp-164°。NMR(CDCl3)δ8.44(1H,S，乙烯基)，8.35,8.07(4H,AB,JAB=8.8Hz),7.35(5H,m),6.6(1H,br.t,NH),4.63(2H,d,J=5.8Hz)。
MS-m/e307(M+,50％),290(M-HCN,63),260(M-H-NO2,91),201(M-NHCH2C6H5,15),173(M-CONHCH2C6H5,13),155(22),127(21),105(100)。实施例2-AG1798：
将0.4g2.65mM对-硝基苯甲醛，0.57g,2.8mMN(氰基乙酰)3-丙苯酰胺(参考文献9)和40mgβ-丙氨酸在30ml乙醇中回流加热4小时。然后通过蒸发使此溶液浓缩，冷却，过滤后得到0.38g淡黄色固体物，产率43％,mp-98°。
NMR(CDCl3)δ8.38(1H,S.乙烯基)，8.35,8.06(4H,ABq,JAB=8.6Hz),7.3(5H,m),3.50(2H,J=8.0Hz),2.74(2H,t,J=8.0Hz),2.0(2H，五重峰，J=8.0Hz)。实施例3-AG1719：
将146mg,0.87mM3-羟基4-硝基苯甲醛，48mg,0.89mM丙二腈二聚物和20mgβ丙氨酸，在10ml乙醇中回流加热1小时。蒸发后以CH2Cl2-己烷研磨，过滤得到190mg黄色固体物，产率78％，mp-105°。NMR(丙酮d6)δ8.32(1H,d,J=8.6Hz),8.20(1H,S，乙烯基)，7.77(1H,d,J=2.2Hz),7.65(1H,dd,J=8.6,2.2Hz)。实施例4-AG1762：
将170mg,1mM 3-氟4-硝基苯甲醛，80mg,1.2mM丙二腈和15mgβ-丙氨酸回流加热1小时，蒸发后以已烷研磨，过滤得到202mg，粉红色固体，产率93％mp-120°。NMR(CDCl3)δ8.22(1H,m)，7.83(3H,m)。
MS-m/e217(M+,100),187(M-NO,78),171(M-NO2,19),159(M-NO-HCN-H,80),151(M-NO2-HF,33),144(M-NO2-HCN,71),132(75),124(M-NO2-HCN-HF,81)。实施例5-AG1799：
将0.4g2.65mM4-硝基苯甲醛，0.51g,2.8mM苯磺酰乙腈和40mgβ-丙氨酸，在30ml乙醇中回流加热4小时。冷却后过滤，并用乙醇洗，得到0.68g淡黄色固体，产率82％,mp-158°。NMR(CDCl3)δ8.36(2H,d,J=8.6Hz),8.31(1H,S，乙烯基)，8.07(4H,m),7.70(3H,m)。生物活性和治疗活性实施例
在下面的非限制性实施例中，将必要时参照附图，对可用于本发明组合物的某些化合物的生物活性和治疗作用，作例证性说明。Ⅰ．用tyrphostin化合物降低由阿霉素或顺铂引起的小鼠死亡率实施例6
将6周龄的雌性CD1小鼠如下分组：
ⅰ．腹膜内注射(i.p)阿霉素(20mg/kg)的小鼠，
ⅱ腹膜内注射顺铂(14mg/kg)的小鼠，
ⅲ．在给予阿霉素之前2小时，一次腹膜注射AG1714(20mg/kg)的小鼠，
ⅳ．在给予顺铂之前2小时，一次腹膜注射AG1714(20mg/kg)的小鼠。
如图1中可见，与仅给予阿霉素的小鼠死亡率(P≤0.001)(图1A)，或仅给予顺铂的小鼠死亡率(P≤0.005)(图1B)相比较，以AG1714处理的小鼠，显著地降低了小鼠的死亡率。实施例7
将6周龄的雌性CD1小鼠分为如下二组：
ⅰ．在21天内，以每次注射5mg/kg的剂量，进行10次腹膜内阿霉素注射(累积剂量为50mg/kg)的小鼠，
ⅱ．在21天内，以5mg/kg的剂量进行10次腹膜内阿霉素注射，并在每次阿霉素注射之前2小时，补充一次腹膜内注射AG1714(5mg/kg)的小鼠。
每组由10只小鼠组成，并如上面所述，对每组小鼠的死亡百分率进行检验。
如图2中可见，与仅用阿霉素处理的小鼠的高死亡率相比较，在每次阿霉素给药之前给予AG1714注射液的小鼠的死亡率显著降低了。实施例8
对二组CD1小鼠如上所述注射顺铂14mg/kg。其中一组在给予顺铂注射液之前2小时，以1mg/kg的低剂量腹膜内给予一次AG1801注射液。如在图2中可见，仅给予顺铂组中的所有小鼠，在注射后10天内全死亡。与此对比，在顺铂注射之前给予一次低剂量AG1801注射液的小鼠组中，死亡率仅为20％。实施例9
将CD1小鼠分成如下5组：
ⅰ．腹膜内一次注射阿霉素20mg/kg的小鼠，
ⅱ．腹膜内一次注射AG1714 20mg/kg的小鼠，并在2小时后腹膜内注射阿霉素20mg/kg，
ⅲ．腹膜内一次注射AG1782 20mg/kg，并在2小时后腹膜内注射阿霉素20mg/kg的小鼠，
ⅳ．腹膜内一次注射AG126 20mg/kg，并在2小时后腹膜内注射阿霉素20mg/kg的小鼠。
通过每天记录死亡小鼠的数目，直到注射后10天，来确定上面各组小鼠的百分死亡率。
如图10所示，在仅给予阿霉素的小鼠组(ⅰ)中，在注射后的1周内，90％的小鼠死亡了。在阿霉素给药之前给予tyrphostin化合物的其它小鼠组中，死亡率降低到50％(ⅲ)-10％(ⅱ)。Ⅱ．用tyrphostin化合物降低多种有害药物试剂对受处理小鼠
器官(肾，肝，肠，心)的毒性作用实施例10
对每组包括3只小鼠的多组CD1小鼠，以14mg/kg的剂量腹膜内注射顺铂。在注射顺铂之前2小时，对除1组以外的各级小鼠以10mg/kg的剂量腹膜内注射了一次tyrphostin化合物。为了测定顺铂对受处理小鼠肾的毒性作用(肾毒性)，顺铂给药后4天，用Sigma生产的商品试剂盒，检测了每只小鼠血清中肌酸酐的水平。
如在图5中可见，在仅给予顺铂的小鼠血清中检测的肌酸酐水平是大约2mg/dl，表明这些小鼠的肾功能降低了大约50％。与仅给予顺铂的小鼠血清中肌酸酐水平相比较，在顺铂注射给药之前给予tyrphostin化合物注射液的许多小鼠血清中，测定到较低水平的肌酸酐。这表明，在顺铂注射给药之前注射tyrphostin化合物，可降低顺铂对肾功能的毒性作用。不同的tyrphostin化合物对降低顺铂肾毒性的作用各不相同。例如，AG1824,AG1744,AG1751,AG1714,AG1823,AG1782,AG1801明显地降低了顺铂的肾毒性，使血清中肌酸酐的水平接近对照小鼠的水平。实施例11
对雌性CD1小鼠单独注射顺铂，或者在注射顺铂之前2小时注射一次tyrphostin AG1843或AG1714，然后如上所述，测定它们血清中肌酸酐的水平。
如从下面表1中可见，与上面实施例10的结果一致，从它们的高血清肌酸酐水平(1.53)表明，单独给予顺铂对小鼠具有肾毒性作用。通过在注射顺铂前2小时注射tyrphostin化合物，顺铂的这种毒性作用被显著降低了(为0.45-0.70)。在此实施例中，tyrphostin AG1843的作用，以低剂量(5mg/kg)给药比以高剂量(20mg/kg)更有效。
表1
    组别 肌酸酐mg/dl(平均值±SD)
对照(助溶剂) 0.46±0.01
 顺铂14mg/kgi.p. 1.53±0.04
 AG18435mg/kgi.p.(-2h)+顺铂 0.45+0.06
 AG184320mg/kg(-2h)+顺铂 0.70+0.14
 AG171420mg/kg(-2h)+顺铂 0.58±0.06
实施例12
如上面所述，给CD1小鼠(腹膜内)注射顺铂(14m/kg)，或者先注射AG1714(10mg/kg),2小时后注射顺铂，对照组小鼠仅注射赋形剂(以生理盐水稀释的乙醇：chemaphore(50∶50)贮备液)。给予顺铂4天之后，测定了每只小鼠顺铂给药后4天的血清中几个指示肾毒性和肝损伤的参数。指示顺铂肾毒性的参数是肌酸酐和血脲氮(BUN)，指示肝损伤的参数是以标准方法测定的肝脏转氨酶，丙氨酸-转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。每组由3只小鼠组成，结果以测定参数的平均值±SD表示。
如图6所示，仅给予小鼠顺铂导致肌酸酐(图6A)和BUN(图6B)水平升高。下面表2显示了这些小鼠的ALT和AST水平也升高了。这些结果表明，由于给予小鼠顺铂，既产生了肾毒性，又导致了肝损伤。如图6和表2所示，在注射顺铂之前2小时给予AG1714，导致所有4个检测参数降低至对照小鼠所测定的正常水平。
表2
AG1714对顺铂诱发的肾和肝损伤的预防作用
    处理     ALTu/L     ASTu/L
对照(赋形剂)     30±4.7     58±1.5
顺铂(14mg/kg)     73.5±2.1     209±16.0
顺铂(14mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     36±3.6     70+14.0
实施例13
对CD1小鼠以14mg/kg顺铂注射给药，或者先腹膜内注射一次tyrphostin AG1714,2小时后注射14mg/kg顺铂。用甲醛固定的组织切片，以苏木精伊红染色，对未经处理和经处理小鼠的肾和小肠进行了组织病理学分析。
如图7中所示，在仅给予顺铂的小鼠肾脏，近曲小管中显示有大的蛋白质斑块(7B)，以及在柱状上皮中显示有颗粒状物质。与此相对照，在给予顺铂之前注射AG1714的小鼠肾脏(7C)没有显示出损伤，它们的结构与对照小鼠的(7A)相似。
也如图7中所示，仅给予顺铂的小鼠小肠(7E)显示有小肠柱状上皮细胞严重坏死和瓦解，相比之下，在顺铂给药之前给予AG1714的小鼠小肠(7F)，显示出类似于在未受处理的小鼠小肠(7D)中所见到的正常结构。实施例14
为了测定AG1714对阿霉素诱发的心脏毒性的预防作用，按照标准化程序(在如下文献中所述：毒物学体外试验，模型系统和方法，McQueen.Telford Press New Jersey出版，1990,163页，新生大鼠心肌细胞的初级培养物；和Kessler-Icekson,G.,J.Mol Cell Cardiol.20:649-755,1988)制备了7天的初级大鼠心肌细胞培养物。
将此心肌细胞培养物分成如下4组：
ⅰ．仅给予赋形剂的细胞(对照)，
ⅱ．以20μM最后浓度给予AG1714的细胞，
ⅲ．以10μM的浓度给予阿霉素的细胞，和
ⅳ．以20μM最后浓度给予AG1714后1小时再加入阿霉素(10μM)的细胞。
开始温育后24小时测定心肌细胞丛(“微小的心脏”)的搏动速度。
如表3中所示，在仅以阿霉素温育的细胞培养物中，每分钟搏动次数显著地降低至仅以赋形剂温育的对照培养物搏动次数的大约20％。相比之下，在以阿霉素和AG1714一起温育的培养物中，每分钟搏动的次数类似于在对照培养物中每分钟搏动的次数。在温育后16小时和40小时，在上面的心肌细胞培养物中也看到了类似的结果(未报告)。因此，在加入阿霉素之前1小时以AG1714温育此培养物，可预防阿霉素对细胞培养物的心脏毒性作用。
表3
AG1714对阿霉素诱导的心脏
毒性的预防作用，体外试验
    处理     细胞搏动(搏动数/分)
 对照(赋形剂)     78±2.0
 AG1714(20μM)     68±2.2
 阿霉素(10μM)     15±1.3
 阿霉素+AG1714     62±2.6
实施例15
FAS抗原是一种细胞表面蛋白，属于双因子/神经生长因子受体家族，已显示具有介导细胞程序性死亡的作用(Itoh,N，等人，Cell.66:233-243(1991))。对小鼠腹膜内给予抗-FAS抗体，导致严重的细胞程序性死亡的肝损伤。
为了测定tyrphostin AG1801和AG1714对于抗-FAS抗体诱发肝毒性的作用，给Balb/C小鼠腹膜内注射AG1801(5mg/kg)或AG1714(5mg/kg)。2小时后以5μg/只小鼠的剂量腹膜内注射抗-FAS抗体。另一组小鼠仅给予抗-FAS抗体注射液，预先未接受tyrphostin处理。注射抗-FAS抗体后5小时将动物处死，测定处死小鼠血清中二种转氨酶AST和ALT的水平：这一种转氨酶的高水平可指示肝毒性(Ogasaware,J.等人，Nature,364:806-809,1993)。
如图8和9中所示，仅以抗-FAS抗体处理的小鼠血清中AST和ALT的水平非常高，表明FSA抗体诱发了肝毒性。
对比之下，在注射抗-FAS之前以AG1801(图8)或AG1714(图9)处理的小鼠血清中，二种转氨酶AST和ALT的水平显著降低。因此，对小鼠给予tyrphostin化合物，可使之产生对抗由抗-FAS抗体诱发的肝毒性的作用。实施例16
T-细胞介导的肝毒性是多种紊乱的疾病如乙型肝炎病毒感染的并发症。这种肝毒性可通过注射伴刀豆球蛋白A(Con A)来诱发。按如下方法(见Tiegs.G.等人，J.Clin.Invest.90:196-203,1992)测定了AG1714对Con A诱发的小鼠肝毒性的作用。
将CD1小鼠分成如下各组：
ⅰ．小鼠仅给予赋形剂注射液(对照组)；
ⅱ．小鼠腹膜内注射AG1714(10mg/kg)；
ⅲ．小鼠静脉内注射Con A(35mg/只)；和
ⅳ．小鼠腹膜内注射AG1714(10mg/kg),2小时后静脉内注射Con A(35mg/只)。
小鼠注射Con A之后6小时，如上所述测定经处理小鼠血清中肝脏酶AST和ALT的水平。这二种酶血清中含量增加反映出肝损伤。
如图10中所示，单独给予AG1714对小鼠没有影响，而注射Con A对小鼠引起了显著的肝毒性。Con A给药之前给予AG1714，显著地降低了Con A对这些小鼠诱发的肝毒性。实施例17
现在已知道，多种免疫机制如细胞因子，以及多种已知引发细胞程序性死亡作用的其它药物(如酒精或扑热息痛)都可能诱发肝损伤。已建立了一种由细胞程序性死亡而诱发的这种肝损伤的模型，其中是通过体内注射半乳糖胺和TNF-α诱发肝损伤(见Leist,M.等人，J.Immunol.153:1778-1788,1994)。
按如下方法测定了AG1714对TNF诱发的小鼠肝损伤的作用：
将小鼠分成如下4组：
ⅰ．仅给予赋形剂注射液的小鼠；
ⅱ．腹膜内注射1次AG1714(10mg/kg)的小鼠；
ⅲ．静脉内注射人TNF-α(0.25μg/只)并同时腹膜内注射半乳糖胺(Gal N)(18ml/只)的小鼠；和
ⅳ．接受如上述第ⅲ组处理的小鼠，在注射TNF/Gal N之前2小时，腹膜内注射1次AG1714(10mg/kg)。
注射TNF/Gal N之后7小时，如上所述测定各处理组小鼠血清中肝脏酶AST和ALT的水平。
如图11中可见，在对小鼠给予TNF/Gal N之前注射AG1714，显著地降低了由于TNF/Gal N给药诱发的肝毒性。因此，tyrphostin化合物可用于减少由变种免疫机制诱发的肝损伤。Ⅲ．用tyrphostin化合物可降低多种有害药物活性剂对具核
骨髓细胞和淋巴细胞的毒性作用(骨髓毒性和淋巴毒性)实施例18
将CD1小鼠分成如下各组：
ⅰ．小鼠仅腹膜内注射阿霉素(10mg/kg)，
ⅱ．小鼠先腹膜内注射AG1714(20mg/kg),2小时后腹膜内注射阿霉素(10mg/kg)，和
ⅲ．小鼠先注射一次赋形剂，2小时后腹膜内注射阿霉素(10mg/kg)。
三天后测定受处理小鼠股骨中具核骨髓细胞和集落形成单位(CFU)的数量(Nikerich,D.A.等人J.Immunopharmacol.8:299-313,1986)。每组包括3只小鼠，结果以平均值±SD表示。
如图12中所示，对小鼠注射阿霉素，3天后引起了骨髓毒性，表现为具核细胞数量减少了47％(图12A),CFU减少了55％(图12B)。在注射阿霉素之前2小时以AG1714预处理的小鼠，完全防止了这种骨髓毒性作用。实施例19
还研究了AG1714对由不同剂量阿霉素诱发的骨髓毒性的作用。按实施例18中所述方法处理小鼠。在阿霉素给药后3天(图13A)和不同的时间(图13B)，测定受处理的小鼠中股骨具核骨髓细胞的数量。
如图13A中所示，以10mg/kg和15mg/kg的剂量对小鼠给予阿霉素，在受处理小鼠中诱发了骨髓毒性。以AG1714预处理，显著地降低了阿霉素诱发的骨髓毒性。
如图13B中所示，以AG1714预处理的阿霉素给药小鼠，也可导致阿霉素给药后骨髓细胞迅速恢复正常。单独用阿霉素(15mg/kg)处理时，5天后受处理小鼠股骨中骨髓细胞的数量仍然相当低。在阿霉素给药之前以AG1714预处理小鼠，在此时，它们的骨髓细胞已完全再生了。实施例20
CD1小鼠受腹膜内注射1次阿霉素(10mg/kg)，或者先腹膜内注射1次AG1714(20mg/kg),2小时后腹膜内注射阿霉素(10mg/kg)。阿霉素给药后72小时处死小鼠，测量小鼠的脾重量和胸腺重量，作为淋巴毒性的参数。每个实验组由3只小鼠组成，结果以细胞平均数±SD表示。以仅接受赋形剂注射，而不接受阿霉素注射的小鼠作为对照。
如下面图14中所示，单独给予阿霉素，导致小鼠的脾重量(图14A)和胸腺重量(图14B)显著减少。通过在给予阿霉素之前2小时给予小鼠AG1714，显著地降低了阿霉素的这种骨髓毒性和淋巴毒性作用。实施例21
对CD1小鼠以50mg/kg的剂量腹膜内注射1次环磷酰胺，并分成如下几组：
ⅰ．小鼠在给予环磷酰胺之前2小时，仅接受1次赋形剂腹膜内注射，
ⅱ．小鼠在给予环磷酰胺之前2小时，接受1次AG1714(20mg/kg)腹膜内注射，
ⅲ．小鼠在给予环磷酰胺之前2小时，接受1次AG1801(2.5mg/kg)腹膜内注射。
环磷酰胺给药后72小时处死小鼠，对小鼠骨髓中的具核细胞数量，脾和胸腺的重量进行测定。每个实验组由3只小鼠组成，结果以各组细胞平均数±SD表示。
如表4A和4B中可见，给予环磷酰胺导致骨髓、脾和胸腺中具核细胞数量显著减少，指示环磷酰胺的骨髓毒性和淋巴毒性作用。在给予环磷酰胺之前给予tyrphostin AG1714或AG1801，导致环磷酰胺在上述3个器官中的骨髓毒性和淋巴毒性作用降低。虽然以tyrphostin化合物处理的小鼠骨髓，脾和胸腺中具核细胞的数量尚未达到对照鼠的水平，与仅接受环磷酰胺的小鼠相比较，这些小鼠器官中具核细胞的数量较高。
表4a和4bAG1714和AG1801防止环磷酰胺诱发的骨髓毒性和淋巴毒性
处理 骨髓中具核细胞数量(×106)     脾(mg)     胸腺(mg)
    AG1714(20mg/kg)
    赋形剂    -   +      -     +      -     +
17.3±1.33 17.9±1.1    109±20.0    112+11.3     75+4.0     71±9.8
环磷酰胺(50mg/kg) 6.2±0.31 11.2±0.6     52±2.5     87±2.0     39±6.1     57±3.6
处理 骨髓中具核细胞数量(×106)     脾(mg)     胸腺(mg)
    AG1801(2.5mg/kg)
    赋形剂      -     +    -     +    -     +
17.3±1.33  18.6±1.0  109±20.0  97±1.52  75±4.0  74±7.9
环磷酰胺(50mg/kg) 6.2±0.31  10.9±0.9  52±2.5  69±0.58  39±6.1  57±5.6
实施例22
将CD1雌性小鼠分成如下各组：
ⅰ．对照组仅1次腹膜内注射赋形剂(助溶剂：丙烯碳酸酯-Cremophor-生理盐水)，
ⅱ．小鼠以80mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射5-氟尿嘧啶(5FU)。
ⅲ．小鼠以20mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射AG1714，
ⅳ．小鼠以2.5mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射AG1801，
ⅴ．小鼠以5mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射AG1843，
ⅵ．小鼠先接受1次腹膜内AG1714(20mg/kg)注射，2小时后腹膜内注射1次5FU(80mg/kg)，
ⅶ．小鼠先接受1次腹膜内AG1801(2.5mg/kg)注射，2小时后腹膜内注射1次5FU(80mg/kg)，
ⅷ．小鼠先接受1次腹膜内AG1843(5mg/kg)注射，2小时后腹膜内注射1次5FU(80mg/kg)。
对小鼠5FU给药后5天，将小鼠处死，测定一根股骨的骨髓中具核细胞的数量。每组由2只或3只小鼠组成，结果以细胞平均数±SD表示。
如图15中所示，给予5FU导致这些小鼠骨髓中具核细胞数量减少。在给予5FU之前先给予AG1714，导致显著较低小鼠的骨髓中细胞数量减少。因此，AG17141降低了5FU对这些小鼠的骨髓毒性作用。实施例23
将CD1雌性小鼠分成如下各组：
ⅰ．对照组仅接受1次腹膜内注射赋形剂(助溶剂：丙烯碳酸酯-Cremophor-生理盐水)，
ⅱ．小鼠以2mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射丝裂霉素-C，
ⅲ．小鼠以20mg/kg的剂量接受1次腹膜内注射AG1714，
ⅳ．小鼠先接受1次腹膜内AG1714注射(20mg/kg)，2小时后腹膜内注射1次丝裂霉素-C(2mg/kg)。
如上面实施例22中所述，给予小鼠丝裂霉素-C5天后将小鼠处死，测定1根股骨的骨髓中具核细胞的数量。每组由2只或3只小鼠组成，结果以所计数的细胞平均数±SD表示。
如图16中所示，仅给予丝裂霉素-C的小鼠显示出非常低的骨髓中具核细胞计数。虽然单独给予AG1714对小鼠没有作用，但是，在给予丝裂霉素-C之前先给予AG1714，导致降低了丝裂霉素-C对这些小鼠的骨髓毒性作用，几乎提供了对丝裂霉素-C有害毒性的完全预防作用，使这些小鼠骨髓中具核细胞的计数达到仅给予助溶剂的对照小鼠的水平。实施例24
测定了不同剂量的AG1801对抗阿霉素诱发小鼠骨髓毒性的作用。将CD1小鼠分成如下5组：
ⅰ．小鼠仅接受赋形剂，
ⅱ．小鼠仅接受阿霉素(10mg/kg)，
ⅲ．小鼠在给予阿霉素之前2小时，先接受腹膜内注射AG1801(0.5mg/kg)，
ⅳ．小鼠在给予阿霉素之前2小时，先接受腹膜内注射AG1801(1mg/kg)，
ⅴ．小鼠在给予阿霉素之前2小时，先接受腹膜内注射AG1801(2mg/kg)。
阿霉素给药三天之后将小鼠处死，如上所述测定骨髓中具核细胞的数量。
如图17中所示，给予小鼠AG1801，具有剂量相关的对抗阿霉素诱发骨髓毒性的预防作用。Ⅳ．用tyrphostin化合物可降低放射作用诱发的毒性实施例25
为了测定tyrphostin AG1714对受放射处理小鼠的防御活性，将用钴源以300R放射性剂量照射的CD1小鼠分成如下二组：
ⅱ．小鼠未接受其它处理，和
ⅱ小鼠在受照射之前2小时接受1次20mg/kg剂量的tyrphostinAG1714腹膜内注射。
第3组小鼠仅接受1次AG1714(20mg/kg)注射，第4组小鼠未作处理，作为正常对照小鼠。
在照射后不同的时间处死小鼠，测定1根股骨的骨髓中细胞的数量。
如图18中所示，与未受处理的小鼠，或仅以AG1714处理的小鼠相比较，用300R照射小鼠，引起这些小鼠骨髓中细胞数量减少了。大约放射处理后5天，受照射小鼠骨髓中开始细胞再生。以AG1714预处理受照射的小鼠，可防止受照射小鼠骨髓中细胞数量减少，并引起了小鼠骨髓中细胞数量非常显著地增加。因此，tyrphostin AG1714对放射处理引起的骨髓毒性具有预防作用。实施例26
如上面实施例25中所述方法，测定了tyrphostin AG1714对大剂量照射(450R)引起的骨髓毒性的预防作用，不同的是照射剂量是450R而不是300R。
如图19中所示，以450R照射的小鼠，照射后5天骨髓中的细胞数量显著减少了，表明这种照射对小鼠具有严重的骨髓毒性作用。照射后5天骨髓中的细胞数量开始再生，但是，照射后18天受照射小鼠骨髓中的细胞数量仍然显著低于未受处理的小鼠或仅给予AG1714的小鼠骨髓中的细胞数量。对于照射之前给予AG1714的小鼠骨髓，直到照射后5天骨髓毒性作用仍然可见。但是5天后，可见这些小鼠骨髓中的细胞数量显著地恢复，到照射后18天，给予AG1714的受照射小鼠骨髓中的细胞数量已高于对照小鼠的细胞数量。因此，给予AG1714可促进受大剂量照射的小鼠骨髓中细胞数量的再生。实施例27
用钴源以致死剂量800R照射CD1小鼠，小鼠被分成2组：
ⅰ．小鼠仅接受照射处理；和
ⅱ．小鼠在受照射之前1小时，接受1次20mg/kg剂量的AG1714腹膜内注射。
每组由10只小鼠组成，通过记录照射后每天死亡小鼠的数目，测定每组的死亡率。
如图20所示，接受800R照射的小鼠组，照射后10天小鼠开始死亡，照射后23天这组小鼠的死亡率达到80％。相比之下，在照射之前接受AG1714的小鼠组，照射之后20天其死亡率显著地降低为20％。
这二组的死亡率直到照射之后50天未进一步改变。V．tyrphostin化合物对化学治疗剂抗肿瘤活性的影响实施例28
应用多种小鼠肿瘤实验模型测定了AG1714对化学治疗剂抗肿瘤作用的影响。
分别在C57BL小鼠尾静脉注射MCA-105肌纤维瘤细胞或Lewis肺瘤细胞2×105/只，以及B-16黑素瘤细胞5×104/只。
肿瘤细胞接种后4天腹膜内注射顺铂(4mg/kg)。给予顺铂之前2小时腹膜内注射AG1714(20mg/kg)或赋形剂。肿瘤细胞接种后24天处死小鼠，测定肺的重量和转移病灶数量。每组包括5只小鼠，结果以平均肺重量±SE表示。
从图21A可见，顺铂明显地抑制了MCA-105肌纤维瘤的生长。AG1714本身也具有轻微的抗肿瘤作用。以AG1714和顺铂合并治疗，象单独给予顺铂一样，有效地抑制了已形成的MCA-105肺转移病灶的生长。顺铂和AG1714本身都对Lewis肺癌具有部分抗肿瘤作用。以AG1714和顺铂合并治疗也比顺铂能更有效地抑制已形成的这种肿瘤肺转移病灶的生长(图21B)。
顺铂(4mg/kg)或AG1714(20mg/kg)单独对已形成的B-16黑素瘤肺转移都没有效果(图21C)。以这二种药物合并治疗，比以每一种药物单独治疗都更有效。实施例29
按如下方法测定阿霉素和AG1714对裸鼠体内SK-28人黑素瘤细胞异种移植瘤的作用：
以SK-28人黑素瘤细胞4×105/只，静脉注射接种无胸腺CD1 小鼠(nu/nu)。肿瘤接种后4天腹膜内注射阿霉素(4mg/kg)。在给予阿霉素之前2小时注射AG1714(20mg/kg)或赋形剂。肿瘤接种后24天，测定经治疗小鼠的肺重量和肺内转移病灶数量。每组包括5只小鼠，结果以平均值±SE表示。
从图22中可见，阿霉素明显地抑制了SK-28肿瘤的生长，而AG1714本身也具有轻微的抗肿瘤作用。以AG1714预处理不会削弱阿霉素单独抑制这种肿瘤生长的作用。实施例30
以人卵巢癌(OVCAR-3)细胞皮下注射接种无胸腺小鼠(3×106个细胞/部位)。肿瘤接种后4天注射顺铂(4mg/kg)。在给予顺铂之前2小时腹膜内注射AG1714(20mg/kg)或赋形剂。在肿瘤接种后20天，测定肿瘤的短径(S)和长径(L)，并按公式： V = [ S 2 × L ] 2 计算肿瘤的体积(V)。每组包括5只小鼠，结果以平均值±SE表示。
如图23中所示，顺铂对负有OVCAR-3肿瘤的小鼠其有明显的抗肿瘤作用，而AG1714本身效果较小。给予AG1714不会削弱顺铂的化学治疗作用。
从图24中可见，与仅反复注射顺铂或仅反复注射AG1714的小鼠肿瘤体积相比较，反复注射顺铂和AG1714的小鼠肿瘤体积较小。实施例31
通过测定负有B-16黑素瘤小鼠的死亡率和它们肺中转移病灶的数量或肺重量，检测了AG1714对大剂量阿霉素效果的影响。
对小鼠静脉内注射2×105B-16黑素瘤细胞，肿瘤接种后4天，对每只小鼠腹膜内注射1次阿霉素(4mg/kg或8mg/kg)。在注射阿霉素之前2小时，对每只小鼠以20mg/kg的剂量腹膜内注射AG1714。
如表5A和5B所示，二组如上所述完成的实验中，给予小剂量阿霉素，引起较低的死亡率和显著的治疗作用。给予大剂量阿霉素产生了显著高得多的治疗效果，但对治疗小鼠引起了高死亡率。AG1714单独给药也显示它本身有一些治疗作用。以大剂量阿霉素同AG1714一起合并给药，产生了大剂量阿霉素的高治疗效果，但是，小鼠的死亡率显著降低了。
表5AG1714对大剂量阿霉素效力和对负有B-16黑素瘤小鼠死亡率的影响A．
    治疗 肺转移病灶的数目(+SD)     死亡率(死亡数/总数)
赋形剂     29±9     0/4
AG1714(20mg/kg)     16±5     0/4
阿霉素(4mg/kg)     7±4     0/4
阿霉素(4mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     7±6     0/4
阿霉素(8mg/kg)     1     3/4(75％)
阿霉素(8mg/g)+AG1714(20mg/kg)     2±1     0/4
无肿瘤       -     0/4
B．
    治疗     肺重量(mg+SEM)     死亡率(死亡数/总数)
赋形剂     976±142     0/6
AG1714(20mg/kg)     870±178     0/6
阿霉素(4mg/kg)     306±12     0/6
阿霉素(4mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     303±28     0/6
阿霉素(8mg/kg)        -     7/8(88％)
阿霉素(8mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     246±10     2/8(25％)
无肿瘤     232±12     0/3
因此，AG1714与阿霉素一起合并给药，可导致增强阿霉素的化学治疗作用。与AG1714合并给药，大剂量阿霉素的显著治疗作用可以达到，而大剂量阿霉素引起的高死亡率，通过合并给药被中和了。
这种增强作用也可以在以如下方式治疗的，负有MCA-105肌纤维瘤的小鼠中看见：仅以阿霉素治疗(表6A)或仅以顺铂治疗(表6B)，或者以上而每种药物与AG1714合并治疗。
表6AG1714对大剂量阿霉素效力和对负有MCA-105肌纤维瘤小鼠死亡率的影响A．
    治疗     肺重量(mg+SEM)     死亡率(死亡数/总数)
赋形剂     908±107     0/8
AG1714(20mg/kg)     632±74     0/6
阿霉素(4mg/kg)     47±119     0/5
阿霉素(4mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     494±137     0/5
阿霉素(8mg/kg)     170±4  5/8(62.5％)
阿霉素(8mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     172±6  2/8(25％)
无肿瘤     161±12     0/4
B．
    治疗     肺重量(mg+SEM)     死亡率(死亡数/总数)
赋形剂     982±102     0/6
AG1714(20mg/kg)     656±127     0/6
阿霉素(4mg/kg)     420±69     0/6
阿霉素(4mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     216±33     0/6
阿霉素(8mg/kg)     186±16     5/7(71％)
阿霉素(8mg/kg)+AG1714(20mg/kg)     167±5     2/6(33％)
无肿瘤     161±6     0/6
实施例32
按如下方法测定了AG1801对顺铂对于负有MCA-105肌纤维瘤的小鼠已形成的肺转移病灶，抗转移活性的作用：
将C57BL小鼠分成如下几组：
ⅰ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后接受1次仅含有赋形剂的注射，
ⅱ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后注射10mg/kg顺铂，
ⅲ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后注射10mg/kg阿霉素，
ⅳ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后注射5mg/kg AG1801，
ⅴ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后先注射5mg/kg AG1801,2小时后注射10mg/kg顺铂，
ⅵ．小鼠在6周龄时静脉内注射2×105肌纤维瘤MCA105细胞，4天后先注射5mg/kgAG1801,2小时后注射10mg/kg阿霉素，
ⅶ．未处理的C57BL小鼠。
如图25A和25B中所示，负有肿瘤的小鼠肺的重量显著地大于对照小鼠。虽然单独注射AG1801对肺重量没有影响，但注射顺铂(图25A)或阿霉素(图25B)，可使小鼠肺的重量减少至接近于未负有肿瘤的对照小鼠的肺重量。合并注射顺铂和AG1801(图25A)和合并注射阿霉素和AG1801(图25B)，导致小鼠肺中肿瘤负荷减少，类似于仅给予顺铂的小鼠肿瘤负荷减少。
上述4个实施例的结果清楚地表明，对负有肿瘤的小鼠，以tyrphostin化合物和顺铂一起给药，不会影响顺铂的抗肿瘤作用，并且在某些情况下甚至可增加这种作用。实施例33
如上面实施例29所述方法，测定了顺铂和AG1801对裸鼠体内SK-28人黑素瘤异种移植肿瘤的作用。
如图26所示，单独给予顺铂在一定程度上减少了负有肿瘤小鼠肺的重量，而给予AG1801，它本身没有治疗作用。AG1801同顺铂合并给药则显著地减少了受治疗小鼠肺的重量，因此，在给予顺铂之前给予AG1801，可增强它的治疗作用。
上述实施例清楚地表明，对负有肿瘤的小鼠，同顺铂或阿霉素一起给予tyrphostin化合物，不会削弱这些治疗剂的抗肿瘤作用，并且有时甚至可增强这种作用。因此，tyrphostin化合物可用于提高和增强这些药物的化学治疗作用和效力。Ⅵ．按如下方法测定了AG1714对各种细胞在体外生存能力的作用实施例34
通过在histopaque上作梯度离心，制备鼠骨髓具核细胞。然后将细胞分为二组：
ⅰ．细胞仅在生长培养基中温育1小时(对照)，
ⅱ细胞在加有不同浓度(5μM,10μM或20μM)tyrphostinAG1714的生长培养基中温育1小时。
然后将细胞在半固体琼脂板上作平板培养，温育14天之后，测定集落形成单位(CFU)的数量(参见：Nikerich等人，同上，1986)。
如图27所示，与仅在生长培养基中培育的细胞相比较，加入AG1714的培养物平板培养效力(以每105具核细胞的CFU数量表示)显著地提高了。因此，tyrphostin AG1714能较长时间保存骨髓细胞培养物。实施例35
在含有5％FCS的RPNI 1640生长培养基中，从CD1幼小鼠的胸腺，制备浓度为3×106个细胞/ml的胸腺细胞。将此细胞如下分成二组：
ⅰ．细胞仅在生长培养基中生长；和
ⅱ．细胞在加有AG1714的生长培养基中生长。
应用胰蛋白酶兰色排除试验，在对细胞加入AG1714之后不同时间，测定上面每组培养物中胸腺细胞的细胞生存能力。
如图28所示，对培养的胸腺细胞加入AG1714，显著地增强了它们的生存能力。实施例36
如在Kessler-Iceksan G.,J.Mol,Cell.Cardiol.20:649-755,1988中所述，从大鼠制备了初级大鼠肌细胞培养物。将心肌细胞在培养基内培养7天，然后将此培养物分成二组：
ⅰ．培养物仅在生长培养基中培养，
ⅱ．培养物在加有20μM tyrphostin AG1714的生长培养基中培养。
在对细胞加入tyrphostin化合物之后16小时和40小时，测定每组培养物中肌细胞丛每分钟的搏动次数。
如图29所示，与仅在生长培养基中培养的心肌细胞培养物中每分钟的搏动次数相比较，加入tyrphostin AG1714的心肌细胞培养物中每分钟的搏动次数显著地较多。AG1714增强了培养的心肌细胞的生存活力。Ⅶ．对tyrphostin化合物的毒性研究实施例37
为了研究tyrphostin AG1714和AG1801的毒性作用，将此tyrphostin化合物给ICR小鼠每周注射3次，持续5周。每次注射包含20mltyrphostin化合物，它们是在以生理盐水/碳酸氢盐1∶20稀释的赋形剂丙烯碳酸酯：cremophore(40/60)中制备的。
为了测定tyrphostin化合物累积性给药的毒性作用，对被注射小鼠的多种参数进行测定，包括它们的体重，内部器官(胸腺，脾，肾)的重量，全血化学，骨髓细胞数量等。
如下面表7中所示，与仅注射生理盐水或赋形剂的对照小鼠的相同参数相比较，注射tyrphostin AG1714和AG1801未引起对被注射小鼠所测定的这些参数发生显著的改变。因此，在对小鼠累积性给药之后，这些tyrphostin化合物未显示出任何毒性作用。此外，注射tyrphostin化合物未引起小鼠死亡。
表7亚慢性腹膜内注射给予AG1714和AG1801(ICR雌性小鼠，每周注射3次共5周)
对照1生理盐水 对照2赋形剂    AG171420mg/kg×15    AG18015mg/kg×15
体重(g) 29.3±3.1     28.6±2.3    29.1±1.7
胸腺(mg) 50.2±7.7     53.8±12.3    57±9.3
脾(mg) 118±27     136±16    119±19.6
肾(mg) 176±21     162±12    164±9.8
白细胞(k/ul) 6.1±2.3 5.5±0.98     4.9±2.3    6.8±3.3
淋巴细胞(％) 88.1±2.35 83.3±4.12     81.5±2.35    80.4±6.1
嗜中性细胞(％) 4.2±1.4     4.2±1.2    5.3±1.2
单核细胞(％) 10.6±2.6     11.9±1.3    12.3±5.2
嗜酸性细胞(％) 0.2±0.1     0.1.±0.05    0.3±0.23
嗜碱性细胞(％) 0.22±0.08     0.24±0.11    0.3±0.07
红细胞(M/ul) 8.4±0.33     9.0±0.33    8.4±0.3
血红蛋白(g/dl) 14.0±2.5 14.2±0.5     14.9±0.56    14.5±0.67
PLT(K/ul) 1236±176 1229±12.7     1475±252    1309±304
葡萄糖(mg/dl) 147±11.3 177±2.4     144±17    177±20.5
血尿素氮(mg/dl) 22±4.4 21±2.9     25.2±3.3    24.2±2.2
肌酸酐(mg/dl) 0.4±0.0 0.42±0.04     0.46±0.05    0.42±0.04
总蛋白(g/dl) 5.4±0.17 5.6±0.2     5.8±0.2    5.6±0.08
白蛋白(g/dl) 3.1±0.0 3.1±0.09     3.2±0.13    3.1±0.07
钙(mg/dl) 9.9±0.4 9.9±0.26     9.9±0.3    9.8±0.36
肌苷磷酸(mg/dl) 8.5±0.7 8.0±0.75     8.4±0.43    7.9±1.1
尿酸(mg/dl) 1.1±0.21 2.0±0.44     1.8±0.18    2.0±0.36
表7(续)
对照1生理盐水 对照2赋形剂    AG171420mg/kg×15    AG18015mg/kg×15
总胆红素(mg/dl) 0.23±0.06  0.2±0.0  0.2±0.0  0.2±0.0
碱性磷酸酶(U/l) 110±3.8  79±17  67±12.8  69.6±0.26
乳酸脱氢酶(U/l) 545±157  996±235  960±226  972±238
谷草转氨酶(U/l) 67±11  71.4±6.5  70±18  68±12
谷丙转氨酶(U/l) 30±4.6  28.8±3.1  25.6±4.2  28±5.5
肌酸磷酸激酶(U/l) 461±179  604±115  659±486  582±127
淀粉酶(U/l) 2451±176  2211±352  2392±230  2169±222
胆固醇(mg/dl) 115±25  98.8±17.5  99±5.7  90±6.1
甘油三酯(mg/dl) 216±84  125±17.9  155±54  138±50
具核骨髓细胞×106 16.3±0.7  15.2±2.0  18.6±3.6  16.5±0.87
集落数(股骨内)  12790±1620  17600±2590  15690±2040
丛集数(股骨内)  8170±697  15000±2140  13410±1740
赋形剂：生理盐水和碳酸氢盐按1∶20稀释的丙烯碳酸酯：Cremophore(40/60)。Ⅷ．对特异性免疫活性的抑制作用实施例38
如在Lavy,R，等人J.Immunol 154:5039-5048,1955，中所述方法制备能够特异性溶解FL-4细胞的鼠腹膜渗出细胞毒性淋巴细胞(PEL)，并进行测定。将EL-4细胞分为如下各组：仅同PEL共同温育的细胞，先同AG1714(20μM)共同温育，然后同PEL共同温育的细胞，以及先同AG1714(50μM)共同温育，然后同PEL共同温育的细胞。应用特异性51Cr释放检测法，测定对靶细胞EL-4的细胞溶解作用。
如图30所示，加入AG1714降低了PEL对靶细胞EL-4的特异性细胞毒活性。AG1714的这种抑制作用是剂量依赖性的。
上述结果表明，tyrphostin化合物对降低免疫介导的移植排异作用可能是有用的，还可能用于自身免疫性疾病以及同细胞特异性免疫活性有关的病症(例如在AIDS情况下的抗-CD4细胞)。Ⅸ．tyrphostin化合物的抗炎症作用
个体炎症反应的主要并发症之一是导致败血性休克，它起因于由细胞因子如TNF和IL-1介导的免疫反应的过度作用。如下测定了tyrphostin化合物对TNF和IL-1相关的免疫反应的影响。实施例39A．小鼠成纤维细胞与TNF-α共同温育将导致这些细胞程序性死亡。为了测定tyrphostin化合物对TNF-α诱导的细胞程序性死亡的作用，将A9小鼠成纤维细胞与放线菌酮(50μg/ml)共温育2小时，然后以20μM的最终浓度加入各种tyrphostin化合物，只有AG1801是以5μM的最终浓度加入。与tyrphostin化合物共温育1小时之后，以0.2ng/ml的浓度对细胞加入TNF-α，并将此细胞再温育10小时。在10小时之末，用propidium碘化物，通过FACS对培养细胞进行分析，并且测定每组培养细胞程序性死亡的程度(观察DNA片段)(参见Novogrodsky A.等人Science,264:1319-1322,1994)。
如下表8中所示，对与TNF共温育的小鼠成纤维细胞加入各种tyrphostin化合物，显著地减弱了TNF使细胞程序性死亡的作用。不同的tyrphostin化合物减弱TNF使细胞程序性死亡的作用的程度稍微不同。
表8tyrphostin化合物对TNF-α诱导的小鼠成纤维细胞(A-9)程序性死亡的预防作用
    Tyrphostins*     程序性死亡(％)
    TNF-α(0.2ng/ml)
     -     +
    无(赋形剂)     9.3     28.7
    AG1714     4.5     9.9
    AG1801     6.6     10.2
    AG126     8.3     19.4
    AG1802     7.6     17.2
B．如表9所示，对上述培养细胞的细胞周期分析表明，以TNF-α处理细胞，诱发了G1期停滞。tyrphostin化合物减弱由TNF引起的程序性死亡作用与它们能够防止培养细胞发生G1期停滞有直接关系。
表9AG1714对TNF-α诱导的小鼠成纤维细胞(A-9)G0/G1期停滞和程序性死亡的预防作用
    细胞周期 程序性死亡
    G1     S  G2+M
                 ％     ％
    对照     60.8     36.2     3.0     9.3
 TNF-α(0.2ng/ml)     85.8     7.6     6.6     28.7
 AG1714(30μm)     58.1     38.1     3.8     4.5
 TNF-α+AG1714     64.5     31.2     4.3     9.9
实施例40
如上面实施例39所述，用A-9细胞以体外试验测定了tyrphostin化合物对TNF诱导的细胞毒性的作用。此外，还以LPS(它诱导体内TNF毒性)注射小鼠，测定了tyrphostin化合物对TNF介导的体内细胞毒性的作用，对CD1小鼠以1.3mg/只的剂量腹膜内注射大肠杆菌LPS。除了对照小鼠仅以赋形剂注射之外，其余的小鼠在注射LPS之前2小时，分别腹膜内注射各种tyrphostin化合物(20mg/kg)。如表10A所示，与上面实施例39中显示的结果相一致，对同TNF共温育的细胞加入tyrphostin化合物，显著地减弱了TNF的毒性作用。如表10B所示，绝大多数tyrphostin化合物显示出对LPS诱导的体内毒性有显著的预防作用，同它们的体外活性相关联。
表10tyrphostin化合物对TNF诱导的细胞毒性的作用(体外试验)，以及对LPS诱导的致死性毒性的作用(体内试验)
A
    体外试验，(活细胞，对照的百分数)TNF
 AG(20μM)     无 0.05ng/ml  0.2ng/ml  1.0ng/ml
 Control     100     41     19     6
 AG1714     119     102     90     62
 AG1719     102     83     58     41
 AG26     107     86     64     31
 AG126     107     75     49     33
 AG1641     102     70     41     21
 AG1720     104     53     26     11
B
    体内试验
存活数/总数 存活小鼠的百分数
    4/10      40
    5/5     100
    4/5      80
    4/5      80
    4/5      80
    3/5      60
    2/5      40
实施例41
IL-1是体内败血性休克的主要介导剂之一。为了测定AG1714对于从与LPS共同温育的细胞产生IL-1的抑制活性，将人外周血单核细胞(PBM)以2×106个细胞/ml的浓度分为如下几组：
ⅰ．细胞仅在生长培养基中培养，
ⅱ．细胞在加入AG1714(20μM)的生长培养基中培养，
ⅲ．细胞在加入LPS(10mg/ml)的生长培养基中培养，
ⅳ．细胞在加有LPS(10mg/ml)和AG1714(20μM)的生长培养基中培养。将这些细胞温育24小时，用Genzyme ELISA试剂盒测定IL-1β的量。
如表Ⅱ所示，它显示了如上所述进行的2组实验，对与LPS共同温育的细胞加入AG1714，显著地减少了细胞产生IL-1β的量。
表11AG1714抑制人外周血单核细胞中LPS诱导的IL-1β产生
    IL-1βpg/mlAG1714(20μM)
实验1      -     +
    无LPS(10μg/ml)     252210187     11741230
实验2     -     -
    无LPS(10μg/ml)     5839309     648970
上面的结果表明，tyrphostin化合物可用于减少在败血性休克中IL-1介导的不希望有的作用。
上面3个实施例的结果表明，tyrphostin化合物可用于减少或防止在炎症反应的过程中形成败血性休克。tyrphostin化合物还可以用作抗炎症药物，以及用于对抗如在自身免疫反应中发生的，由各种细胞因子(例如TNF和IL-1)介导的致病作用。

Claims (27)

1．用于对抗对细胞或组织损害的药物组合物，它含有效量的如下通式Ⅰ的化合物，以及可药用载体，
Figure A9719859600021
其中：
-Ar是如下结构式的基团，或
-n是0，或者当Ar是上面结构式(ⅰ)时，则n也可以是1，
R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者当R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH时，则R也可以是如下结构式的基团，或
Figure A9719859600025
在此R3是H，苯基，苯基(低级烷基)或吡啶甲基；
-R1和R2各自独立地是H,OH,NO2，或者R是CN时，也可以是CH3,F，或CF3，条件是R1和R2不同时为H。
2．权利要求1的药物组合物，包含结构式Ⅰ的化合物，其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5，或如下结构式的基团，
Figure A9719859600031
并且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
3．权利要求1或2的药物组合物，是用于对抗由细胞毒性药物引起的损害。
4．权利要求3的药物组合物，是用于对抗由抗肿瘤药物引起的损害。
5．权利要求3或4的药物组合物，包含与细胞毒性药物组合的有效量的权利要求1中的结构式Ⅰ化合物。
6．权利要求3-5的任一药物组合物，其中的药物选自顺铂，阿霉素，环磷酰胺，丝裂霉素-C和5-氟尿嘧啶。
7．权利要求1-6的任一药物组合物，是用于对抗骨髓毒性和淋巴毒性。
8．上述权利要求的任一药物组合物，是适合于静脉内给药的剂型。
9．上述权利要求的任一药物组合物，是适合于口服给药的剂型。
10．权利要求1或2的药物组合物，可用于体外保存细胞，组织或器官。
11．权利要求1或2的药物组合物，可用于对抗由免疫介导或炎症反应引起的损伤。
12．权利要求1-10的任一药物组合物，是用于对抗有害的程序性死亡。
13．一种用于治疗个体，对抗对细胞，组织或器官损害的方法，该方法包括给予此个体有效量的如下通式1的化合物，以及可药用载体，
Figure A9719859600032
其中：
-Ar是如下结构式的基团，
Figure A9719859600041
或
-n是0，或者当Ar是上面结构式(ⅰ)时，则n也可以是1，
R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者当R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH时，则R也可以是如下结构式的基团，
Figure A9719859600043
或
Figure A9719859600044
在此R3是H，苯基，苯基(低级烷基)或吡啶甲基；
-R1和R2各自独立地是H,OH,NO2，或者R是CN时，也可以是CH3,F，或CF3，条件是R1和R2不同时是H。
14．权利要求13的方法，其中结构式Ⅰ的化合物中，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5，或如下结构式的基团，
Figure A9719859600045
并且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
15．权利要求13或14的方法，其中有害的药物是细胞毒性药物。
16．权利要求15的方法，其中的细胞毒性药物是抗肿瘤药物。
17．权利要求16的方法，其中的细胞毒性药物选自顺铂，阿霉素，环磷酰胺，丝裂霉素-C和5-氟尿嘧啶。
18．权利要求13-17的任一方法，是用于对抗骨髓毒性和淋巴毒性。
19．权利要求18的方法，可用于对抗放射治疗中不希望的有害作用。
20．权利要求13-19的任一方法，其中结构式Ⅰ的化合物是与细胞毒性药物或放射治疗组合给药。
21．权利要求1-20的任一方法，其中是在给予细胞毒性药物或放射治疗之前给予结构式Ⅰ的化合物。
22．权利要求13-21的任一方法，其中结构式Ⅰ的化合物是静脉内给药。
23．权利要求13-21的任一方法，其中结构式Ⅰ的化合物是口服给药。
24．权利要求13或14的方法，可用于对抗由免疫介导或炎症反应引起的损伤。
25．一种用于在体外保存器官，组织或细胞的方法，包括使在体外的器官、组织或细胞，与通式Ⅰ的化合物以及可药用载体接触，
Figure A9719859600051
其中：
-Ar是如下结构式的基团，
Figure A9719859600052
或
Figure A9719859600053
-n是0，或者当Ar是上面结构式(ⅰ)时，则n也可以是1，
R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者当R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH时，则R也可以是如下结构式的基团，
Figure A9719859600061
或
在此R3是H，苯基，苯基(低级烷基)或吡啶甲基；
-R1和R2各自独立地是H,OH,NO2，或者R是CN时，也可以是CH3,F，或CF3，只要R1和R2不同时是H。
26．通式Ⅰ′的化合物，
Figure A9719859600063
其中：
-Ar是如下结构式的基团，
Figure A9719859600064
或
-n是0，或者当Ar是上面结构式(ⅰ)时，则n也可以是1，
-R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者当R1是4-NO2,R2是H时，则R也可以是如下结构式的基团，
Figure A9719859600066
或
R1和R2各自独立地是H,OH,NO2，或者当R是CN时，也可以是CH3,F或CF3，并且
R3是H，苯基，苯基(低级烷基)或吡啶甲基；
但条件是：
a)当R是CN和n是0时，则
(aa)如果R1和R2之一是H或OH，则另一个不能是NO2，
(ab)如果R1和R2之一是H或F，则另一个不能是H或F，并且
b)当R1是4-NO2,R2是H，以及n是0时，则R不能是-C(O)NH2，或-C(S)NH2。
27．权利要求26的化合物，其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5或如下结构式的基团，
并且n是0,R1是4-NO2,R2是H和n是0。
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