CN1230557C

CN1230557C - 酶的检测和测量

Info

Publication number: CN1230557C
Application number: CNB018128521A
Authority: CN
Inventors: S·克里兹勒; A·萨瓦
Original assignee: Novapharm Research Australia Pty Ltd
Current assignee: Novapharm Research Australia Pty Ltd
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2005-12-07
Anticipated expiration: 2021-06-20
Also published as: US7244554B2; MY129433A; AUPQ826500A0; AR030705A1; JP2004500127A; NZ523133A; KR20030009544A; CA2411834A1; BR0112283A; CN1443244A; EP1292700A4; US20030166035A1; WO2001098532A1; EP1292700A1

Abstract

本发明涉及用于检测液体中的酶的单一用途的装置。该装置包含用于人工控制的支架结构和结合在支架结构上的组合物，该组合物与酶起反应，从而引起该装置外观的改变。该装置通过具有选择性与一类酶中的一种起反应的组合物可适合于从多种酶中检测一种酶，每种反应引起的该装置外观的改变表示各种酶的存在。本发明还公开了测定液体中酶的活性的方法，其包含下列步骤：将本发明的试条插入液体中，测量从插入时刻到观察到试条外观预定的变化所需要的时间，或记录预定时间后的试条的外观。

Description

酶的检测和测量

技术领域

本发明涉及测量酶或酶的组合的活性的装置以及使用该装置的方法。

背景技术

本发明说明书中的任何有关现有技术的讨论决不应当被认为该现有技术广为所知或构成本领域常识的一部分。

活细胞产生许多催化剂，其目的是加速在生活物质中发生的条件下发生的反应。这些生物催化剂称为酶。它们是加速某些化学反应的蛋白质，而其本身不受该反应的影响。目前其大规模制造，并应用于许多目的。

酶广泛的应用于工业过程、食品加工和制造、以及家庭产品。例如它们用于如洗衣的洗涤剂家庭产品以帮助消化生物学来源的污垢，用于洗碟的洗涤剂以帮助消化或去除食物残余物。它们广泛的用于制造工业，例如用于鞣制皮革、剪羊毛、制造干酪、纸、面包以及应用于其他工业。酶也已经用于医院、医药、牙科实践等，以帮助消化和去除手术器械和随身用具的生物学污染。

已经提出许多分析方法来确定酶的存在和定量其活性。通常这涉及复杂的操作和经常需要熟练的分析人员操作的费时的化学分析。并入于此和标记的附录1是典型的基于USP方法、确定蛋白酶的蛋白水解活性的方法。该方法需要分光光度计和其它装置、试剂(其中一些试剂必须当天新鲜配制)和熟练的技师来完成工作。完成的过程不少于大约2小时。

快速检测组合物样品中是否存在特定酶或某类酶的手段是非常有用的。通常知道系统中一种或多种酶的活性程度也是非常重要的，并且希望具有相对快速、简单和廉价的分析方法，最好是能够由相对不熟练的人就可操作的方法。

最近几年已经开发了许多试条，其使用固定的酶来检测样品中的目的分析物，例如测量血液样品中或粪便中的血液中的葡萄糖。许多此类装置需要复杂的电流测量装置来提供读数，并且都是相对复杂和昂贵的构造。尽管此类装置使用了酶，但它们没有提供酶活性的测量方法，也没有提供分析物中其存在的指示。

本发明的目的是提供酶的检测和/或活性分析的方法，其避免或至少改善一种或多种上述现有技术的缺点，或者提供商业上有益的代用品。

发明描述

本发明的一个方面提供单一用途的分析装置用来检测合适温度的液体中的酶，该装置包含用于人工控制的支架结构和结合在支架结构上的组合物，该组合物与酶起反应，由于至少一部分与所述的支架结构结合的组合物层的消化而显示出具有与被消化的层不同的外观的下层，从而引起该装置外观的改变。

除非文中另有清楚说明，说明书和权利要求书中的词语“包含”是包含的意思，不是排除的或穷举性的意思；也既是”包括但不限于”的意思。

在本发明优选的实施方案中，该装置由试条(test strip)形式的支架结构组成，试条适合于用手浸入或插入被检测的液体中以检测酶的存在或评估其活性。尽管对于某些实施方案支架结构可能使用的是一片纸或硬纸板，但理想地该支架是惰性的载体，如一片塑料等。也可以使用其他支架，例如玻璃的、金属的、陶瓷的或复合材料的。该支架也可以是弥散形式的，如聚合的小珠或无机颗粒。结合的组合物优选地包被或印迹在支架上，并且可以是或包括例如被一种特定种类的酶选择性消化的组合物。例如结合的组合物可以是或包括被蛋白酶类的酶选择性消化的蛋白质；或者其是或包括被脂肪酶类的酶消化的脂；或者其是或包括被纤维素酶类的酶消化的纤维素，等等，或者可以将许多此类组合物结合到单一的支架上。如果需要该组合物可以包括用来保持其与支架结合的粘合剂，或者如果酶可消化的组合物本身能被形成有粘着力的层，其可作为层附着在支架上。

在本发明的实施方案中，组合物与被检测液体中的酶之间的相互作用导致试条外观的改变，例如，该组合物可能改变颜色，或者该组合物可能被消化而显示不同外观的底层。在下文中更详细地讨论可以实现的随酶检测而发生的该装置外观变化的各种方式。

在本发明一个非常优选的实施方案中，所述的组合物是酶可消化的，包括固体粉末(例如硫酸钡)，其中暴露表面或接近暴露表面的层或者层的一部分是彩色的。可有效消化该组合物的酶释放彩色的层中的彩色的颗粒，其从试条上脱落。由于在该表面或接近该表面的彩色的层与下面的剩余部分(如果是硫酸钡弥散物时其为不透明的白色)的外观不同，表层的消化导致试条可见的颜色变化。

在优选的实施方案中，酶的活性的定量可以通过测量从将试条插入到观察到外观变化的时间、并将该时间与参考表或参考样品的时间比较来实现。在另一实施方案中，在预定时间间隔内发生的外观变化的程度用来指示酶的活性。

附图简述

现将结合附图通过实施例描述本发明的各个实施方案，其中：

图1显示了本发明的一种实施方案的示意图，

图2显示了图1沿线2-2的剖面图，

图3显示了本发明另一种实施方案的示意图；

图4显示了图3沿线3-3的剖面图，

图5显示了本发明的第三种实施方案的示意图；

图6显示了图5沿线5-5的剖面图，和

图7显示了在类似图6的剖面图中第三种实施方案的优选的变化。

实施本发明的最佳方式

本发明的一种实施方案如图1和2所示，其中提供了简单形式的装置。图1的装置是单一用来检测蛋白酶、随后展示的试条。该装置由支架结构1组成，其在该说明的实施例中为条形式，但是其不必为矩形的，也不必是平面的。在本发明的实施例中支架1是塑料的，并且制成就其目的应用的方式来讲有助于人工控制的形状。支架结构1是彩色的(例如支架结构1是兰色的彩色塑料)，并且通过用预定厚度的组合物的粘附层包被与酶可消化的组合物2结合。组合物2是明胶，其中是弥散的硫酸钡粉末产生不透明的白色组合物。在应用该试条前，兰色的支架结构1由于覆在上面的白色组合物包被而是不透明的。将试条插入含有蛋白酶的液体中，在已知的温度下分析其中的活性。用秒表来测量从试条插入到液体中直到组合物2被消化(通过该试条的包被部分的外观的改变—从组合物2的白色到支架1的兰色--来表明)的时间。然后停止秒表，并通过参考事先标准化的时间与该组合物的预定厚度的关系表评估该酶的活性。本领域技术人员应当理解酶的活性与酶消化底物的速率是温度依赖性的，样品或者预处理为特定合适的温度，或者必须测量溶液的温度，并使用温度调节因子。在图1的实施方案中，不必用结合的组合物覆盖整个的支架结构。但是在此实施方案中，如果用试条来估计酶活性，准确和可再生地控制组合物2包被的厚度是重要的。

如果需要，该试条可附带校准图表(二者组成试剂盒)，为使用者指明支架的终点颜色，或留下暴露的未覆盖的支架部分来帮助该颜色比较。如果使用固体的悬浮液，其不必是硫酸钡，而可以是二氧化硅、二氧化钛、金属胶体或其它遮光剂。

所述的支架不必为彩色的。支架1可以是透明的薄膜和光束和光电二极管等，同时可以使用任选的计时电路来监测组合物的消化和记录终点(当该光束通过载体和组合物层)和计时消化。在其它实施方案中，可消化的包被被消化时可能显示下面的印迹在载体上的标记，例如词语“蛋白酶”或缩写如“P”。

上述的实施方案是为了检测和测量蛋白酶的活性。但是，可以用其它组合物来检测其它酶类的酶。例如，使用纤维素酶底物的组合物可用来检测纤维素酶类的酶，用包含脂类的组合物可用来检测脂肪酶类的酶，用包含支链淀粉的组合物可用来检测淀粉酶类的酶等。

更优选的实施方案如图3和4所示。图3所示的装置与图1的不同在于一种支架结构1结合几种不同的酶可消化组合物，其中每种对一种或一类酶特异，因此该试条可以测试一种以上的酶的存在，以及分析共存于混合物中的几种不同种类的酶。此时不同的化合物通过例如颜色可以直观地互相区分开来，或者它们可能是相同的颜色，但是直观上占据支架的不同部分。它们可能具有相同或不同的下层颜色或标记。

尽管在优选的实施方案中结合在支架上的组合物以预定的均匀厚度的包被应用到支架上，并测量消化的时间，在不太理想的实施方案中，可使用连续变化的或阶梯式变化的厚度的包被，并确定给定时间内被消化的厚度。此时在每一厚度步骤可能显示不同的值，在预定的时间内得到的最高值可代表活性。

图3举例显示了本发明试条形式的装置的示意图，其包含为纤维素乙酯薄膜的支架结构1，由第一种组合物2覆盖层或条、第二种组合物2′层、第三种组合物2″层和第四种组合物2层所包被，每种组合物2、2′、2″、2可被彼此不同的分别的酶或一类酶选择性消化。

每一覆盖层或条2、2′、2″、2 可被彼此不同的酶或一类酶所消化。层2是蛋白质层，层2′是脂肪层，层2″是纤维素、层2是碳水化合物。更具体而言，本实施例中层2是支链淀粉，其可被淀粉酶而不能被纤维素酶消化。层2、2′、2″、2在底物上排成平行的条纹，并且可能是相邻的(如图1所示)或可能是间隔的。

如图2的剖面图所示，条纹2、2′、2″、2不是均一的厚度，而在3、4、5等层上厚度是阶段式逐步提高的。层中的变化或多或少，或者厚度会连续增加。

通过任何合适的方法可将包被应用到底物上，例如利用轮转凹版印刷术、网板印刷术、墨水喷射印刷、刮涂法(knife coating)，或者其它适合附着预定厚度的层的方法。

在将支架包被精细弥散的硫酸钡混悬液之前每种组合物混合成不透明的。弥散物遮蔽了下层支架。该支架可能是透明的、彩色的、或被彩色层覆盖的。理想上在每一组合物2、2′、2″、2下的支架的颜色是不同的。在每3、4、5步组合物厚度下都有标记。另外，该组合物可以是染色的或彩色的，因此在预定时间后可通过与色彩表比较确定剩余的厚度。

第三种实施方案描述了图5和6。叶片型的支架1具有适于浸入的部分11和手柄部分12。部分11用许多种可消化组合物2、2′、2″(其每种都可被不同种类的酶选择性消化)的酶包被。组合物2、2′、2″的每一种都是彩色的或位于表面层。该技术的一种变化如图6所示，是通过在组合物2、2′、2″暴露的表面印迹或包被墨水6(例如以点状或格子状)来完成的。墨水6在欲测试的含有酶的液体中是不溶的。合适的墨水使用水不溶的染料，例如D&C紫罗兰色No.2。当将部分11插入到含有合适酶的液体中时，起反应的组合物2被消化，随着液体的界面被消耗，墨水6被释放，使外观产生了变化。

第三种实施方案的优选的形式的平面图与图5相同，但正视图如图7所示。该形式中组合物2、2′、2″包含固体粉末，例如硫酸钡。在组合物2的表面使用例如通过墨水喷射印刷方法定量的墨水或染料。墨水穿过组合物2、2′、2″并改变了组合物表面或表面附近悬浮体薄层7的颜色。当将部分11垂直地插入含有酶的溶液中时，与该酶起反应的组合物2被消化，当在液体界面的组合物被消耗，层7的彩色粉末在重力作用下脱落或弥散产生外观的变化，因为在彩色层7下面的层8是白色的。当然该非白色的固体也可用作混悬液。如果需要可通过其他方法将彩色的固体固定在组合物2的表面层上或表面层内。例如，通过暴露于光可使表面上或表面附近的光敏固体颗粒的颜色发生变化。已经发现使用酶可消化的组合物的实施方案中表面层与下面的层具有不同的外观避免了在支架上使用组合物包被厚度的精确和可重现的对照。重复地改变薄层的颜色比产生预定厚度的包被容易得多，其令人惊奇的得到可重现的和精确的终点标记。硫酸钡因为其高比重是用于此目的的优选的弥散物。

到目前为止所描述的实施方案中结合在支架的组合物都是可被特定种类的酶选择性消化的物质。但是该组合物不必是酶可消化的。可选择组合物与酶反应产生产物，或直接或通过一种或多种反应中间体或介质来产生颜色的变化。例如组合物2可包含多孔的结合介质，其中固定化蔗糖及电子转移介质，如铁氰化物、二茂铁、亚甲蓝、对-苯醌、2，6-二氯苯基靛酚(2，6-dichlorophenyolindophenol)、绿脓菌素或硫因。在液体中存在葡糖氧化酶时，测定其活性，该装置中的葡萄糖氧化成葡糖酸，介质被还原例如从铁氰化物到亚铁氰化物。此类反应可伴随颜色的变化或用来在合适的氧化还原作用指示剂(其可指示氧化酶的活性)中产生颜色的变化。其他底物/介质系统可用于其他酶类。

实施例

以下仅通过实施例给出用于本发明的包被组合物：

1 蛋白酶可消化的包被

液体明胶(Norland Products的Hipure) 30％

氧化钛 60％

甘油 10％

2 纤维素酶可消化的包被

高分子量羧甲基纤维素(Tylose(甲基纤维素)30,000)6％

氧化钛粉末 10％

无菌水补足至100％

3 脂肪酶可消化的包被

PNP戊酸酯 0.4％

甘油单硬脂酸酯 0.3％

氧化钛粉末 10％

热水补足至100

4 淀粉酶可消化的包被

琼脂糖和琼脂胶的混合物 1.5％

(Oxoid供应，编码为No.L28)

氧化钛粉末 10％

水补足至100

该混合物置于32-35℃并可以薄层保存。

不能溶解冷水的支链淀粉和任何其他长链多糖可取代琼脂糖和琼脂胶的混合物用于该制剂。

5 用于检测用蛋白酶反应的产物和副产物

该方法是基于检测由底物中不溶于冷水的蛋白质的断裂产生的可溶于冷水的蛋白质片段的多肽键：

该试条可包括空间上分离的两部分，一部分具有底物，另一部分具有试剂，或者各个部分组合成基体。

底物：上述的明胶层

试剂：2，4-二硝基氟苯(DNF) 1％

三乙醇胺 1％

PVP-VA 535 共聚物 10％

(由ISP Corp供应)

乙醇 88％

当受到蛋白酶作用时，明胶断裂为较小的水溶性多肽，其可与DNF反应形成亮黄色。

6 用于检测用淀粉酶反应的产物和副产物

琼脂糖和琼脂胶的混合物 1％

酒石酸铜 1％

三乙醇胺 1％

PVP-VA 共聚物 10％

乙醇补足至100

7 用于检测用纤维素酶反应的产物和副产物

Tylose 30000 2％

酒石酸铜 1％

三乙醇胺 1％

PVP-VA 共聚物 10％

乙醇补足至100

本领域技术人员应能基于此处的教导选择其他合适的底物。

一个实施方案的特征可与另一实施方案的特征组合。

从此处的教导很明显可以不同的方式配制用于本发明的组合物，以及以许多不同的形式互相组合和与合适的底物组合，这都不背离此处公开的发明概念。

附录1

1.0.范围和目的

该方法用来确定酶制剂和去污剂(Azocasein Substrate)中的蛋白水解活性。

2.0.异常安全预防：

无

3.0.方法原理：

用蛋白酶在40℃水解偶氮酪蛋白(azocasein)30分钟。用三氯乙酸沉淀未被消化的蛋白质，用分光光度计定量消化的产物。

4.0.仪器：

4.1 分光光度计

4.2 pH计

4.3 40℃±0.5℃的水浴

4.4 计时器

4.5 涡旋混合器

4.6 16×125mm试管

4.7 重复分配器，5ml容量

4.8 小漏斗和滤纸。Whatman No.3或等效物

4.9 1ml和0.1ml吸移管

5.0 试剂

6.1 2.0M的Tris缓冲液贮存溶液

在700-800去离子水中溶解242g三羟甲基氨基甲烷(Trizma BaseT 1503-或等效物)。用10N H₂SO₄调节pH至8.5。将体积调节至1升。用0.2M Tris缓冲液稀释成最终使用浓度10m/100ml。

6.2 50％的脲溶液

在50ml温的去离子水中溶解50g脲(分析级)。将体积调至1升。

6.3 10％的三氯乙酸溶液(终止剂)

在200ml去离子水中溶解100g三氯乙酸(TCA)。将体积调至1升。

6.4 偶氮酪蛋白(底物溶液)

当天新鲜配制-扔弃任何未用的底物

在250ml烧杯中：

称重0.6g偶氮酪蛋白(Sigma A-2765)

加入10ml 50％的脲溶液并混合至溶解。

加入10ml 2.0M的Tris缓冲液贮存溶液。

加入30-50ml去离子水并继续搅拌至颗粒澄清。

用稀H₂SO₄调节pH至8.5。

调节体积至100ml并彻底混合。

开始试验前冷藏。

7.0酶样品和标准

在溶解蛋白酶试验用Epizyme Rapid Sample后，强烈建议检查一下该溶液的pH，如果需要，将其调节至8.5±0.1单位。

如果想知道去污剂中的蛋白酶的确切活性水平，除非知道所用的特定制剂对该蛋白酶活性没有影响，标准溶液中应当包括去污剂基质。基质去污剂的浓度应该与含有蛋白酶的去污剂的样品溶液中的相等。

溶液中强螯合剂如NTA或EDTA的存在可能使蛋白酶在准备试验用的多种材料时间内失活。可以通过在样品溶液中加入过量的钙克服由此导致的失活。

6.0 流程

6.1 将水浴预热至40℃±0.5℃(大约1小时)。

6.2 在开始试验前大约10分钟，将底物溶液置于40℃水浴至平衡。

6.3 将试管在50℃水浴中温育10分钟。

6.4 从水浴中移出试管并快速向每支试管中以相同的时间间隔加入500ul显色反应溶液。应当在1分钟之内将显色反应溶液加入所有的试管中。重新盖上盖并涡旋。再次重申，应小心不要将反应溅到微量离心试管的盖子上。

6.5 在80℃水浴中温育试管20分钟。

6.6 所有的试管在冰水浴中冷却15分钟。

6.7 将所有试管的反应转移1.5mL的比色皿中并读取560nm处的吸光度。

7.0 结论

计算每个标准的平均吸光度以及样品的平行测定。从每个值中减去平均空白吸光度读数以获得平均净的吸光度读数。

产生净的吸光度与标准的酶浓度的标准曲线。将得到的相关系数(r)为20.999。

从标准曲线中计算每个液体样品的NPC/g的值。

从标准曲线计算每个颗粒样品的NPC/g颗粒值。

8.0 参考文献；

USP

Claims

1.单一用途的分析装置，用来检测合适温度的液体中的酶，该装置包含用于人工控制的支架结构和结合在支架结构上的组合物，该组合物与酶起反应而引起该装置外观的改变，其特征在于所述装置外观的改变是由于至少一部分与所述的支架结构结合的组合物层的消化而显示出具有与被消化的层不同的外观的下层。

2.单一用途的分析装置，用来检测合适温度的液体中的选自第一类的酶和/或选自第二类的酶，所述的装置包含用于人工控制的支架结构、与该支架结构结合的第一种和第二种组合物，该第一种组合物与第一类的酶选择性反应，第二种组合物与第二类的酶反应，每种反应引起该装置的外观的改变表示各种酶的存在，其特征在于该装置外观的变化是由于与所述的支架结构结合的组合物层的消化露出了与被消化层不同外观的下层。

3.权利要求1或2的装置，其中显示的下层是支架结构或支架结构上的包被。

4.权利要求1-2任一项的装置，其中与所述的底物结合的组合物是不透明或半透明的。

5.权利要求4的装置，其中与所述的底物结合的组合物包含固体粉末弥散物。

6.权利要求5的装置，其中所述的弥散物是硫酸钡。

7.权利要求1或2的装置，其中该装置外观的变化是由于结合的组合物表层的消化使附着在与下层组合物外观不同的表层内或表层上的物质被释放。

8.权利要求7的装置，其中所述的附着的物质是应用于组合物表面的墨水或染料。

9.权利要求1或2的装置，其中与所述的底物结合的组合物包含固体弥散物，其中至少表层部分是与剩余部分不同的彩色的。

10.权利要求9的装置，其中该表层通过在组合物表层应用墨水或染料而为彩色的。

11.权利要求1或2的装置，其中从将该装置的预定部分插入液体中直到观察到预定的外观变化时的时间表示该液体温度下所检测的酶的活性。

12.权利要求1或2的装置，其中该装置的外观随着将该装置的预定部分插入到合适温度的含有酶的液体后的时间而变化，并且预定时间后的外观表示在该温度下所检测的酶的活性。

13.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物是蛋白酶可消化的。

14.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物是纤维素酶可消化的。

15.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物是脂酶可消化的。

16.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物是淀粉酶可消化。

17.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物是氧化酶可消化的。

18.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物形成均一厚度的层，并可被预定活性的合适的酶在预定的时间内选择性地消化。

19.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物形成厚度逐渐增加的层，并可被预定活性的合适的酶在预定的时间内选择性地消化，在预定时间内消化的厚度表示该酶的活性。

20.权利要求1或2中的装置，其中结合的组合物为以预定的厚度梯度而厚度不断增加的层，每一梯度可被预定活性的合适的酶在根据该梯度厚度预定的时间内选择性地消化，在预定时间内被消化的梯度的数目表示该酶的活性。

21.权利要求1或2的装置，其中支架结构是由塑料片或薄膜形成的。

22.测定合适温度的液体中的酶的活性的方法，其包括将权利要求1的单一用途的分析装置插入液体中，并且其中液体被预调节至指定的合适温度或测量溶液的温度并使用温度调节因子，所述方法的特征在于其包括测量从插入时刻到观察到所述单一用途分析装置的外观的预定变化所需要的时间，并且其中该组合物表面的外观的变化导致该所述单一用途分析装置外观的变化。

23.权利要求22的方法，其中试条外观的变化是由于组合物条的消化露出了组合物下的支架结构。

24.权利要求22的方法，其中外观的变化是试条透明度的变化。

25.权利要求22的方法，其中所述的液体维持在预定的温度。

26.权利要求22的方法，其中该试条在支架结构上包含许多种组合物，每种可被不同种类的酶选择性地消化，测量每种组合物外观发生变化所需要的时间。

27.测定酶的活性的方法，其包含下列步骤：将权利要求1的单一用途的分析装置插入含有该酶的液体中，该单一用途的分析装置包含用一种或多种可被预定活性的酶在预定的时间内消化的、逐渐增加预定厚度的、并与该支架结构在视觉上可区别的组合物包被的支架结构，并且其中样品被预调节至指定的合适温度或测量溶液的温度并使用温度调节因子，所述方法的特征在于所述组合物在预定的时间被消化并记录在预定的时间内消化的组合物的厚度。

28.包括权利要求1或2的装置和装置的外观预定改变的外观的指示剂的试剂盒。