CN1225575A - 改变体毛生长和其色素形成的方法及用于该方法的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明利用丝氨酸蛋白酶及其诱导毛囊乳头中程序性细胞死亡和细胞凋亡的能力来改变哺乳动物的体毛生长和体毛色素形成。本发明还介绍了含有下述药物的组合物,所述药物的一部分结构上与胰蛋白酶分子的一部分类似,使得所述药物以类似于胰蛋白酶的方式诱导程序性细胞死亡和细胞凋亡。

Description

改变体毛生长和其色素形成的方法 及用于该方法的组合物
相互参照的相关申请
本发明要求1996年7月12日提交的美国临时申请60/021,829的优先权，上述申请全文引作参考。
发明领域
本发明涉及在毛囊乳头中引起程序性细胞死亡和细胞凋亡的方法以及用于该方法的组合物。更具体而言，本发明涉及通过局部应用蛋白酶或影响受体介导的信号传导途径的分子来改变体毛生长和体毛色素形成速度的方法。
发明背景
哺乳动物体毛的一个主要功能是提供环境保护。但是，在人类中该功能大部分已丧失，人类当中，体毛的去留基本上取决于美容目的。
多种方法用于去除不想要的体毛，包括剃除、电针去除、拔除和注射治疗用抗雄激素。这些常规方法有其缺点。如剃除可能在皮肤表面产生切口，使人感到体毛重新生长的速度加快，还可能会留下不希望有的毛桩。而电针去除虽然可能会使某一区域在较长时间内不再出现不想要的体毛，但该方法通常费用昂贵，使人痛苦，还可能会引起疤痕。拔除不但使人疼痛不适，而且经常难以除去短毛。使用抗雄激素则经常伴有某些讨厌的副作用，如对肌肉的影响。而且，除电针去除之外，所有这些方法都必须反复进行，通常是每日进行，这使得使用者深感不便。由于以上原因，需要有延迟体毛生长的化学方法。
Ahluwalia等的美国专利5,455,234中报导，哺乳动物的体毛生长可通过向皮肤使用半胱氨酸途径酶抑制剂而加以改变，该抑制剂会延缓或阻止影响与半胱氨酸相关的体毛生长速度和特性的代谢途径。但是，对半胱氨酸的这种抑制也会引起处理区域该氨基酸的缺乏。与此类似，Ahluwalia的美国专利5,095,007,Ahluwalia等的美国专利5,096,911和5,468,476以及Shander等的美国专利5,132,293和5,143,925中，使用酶抑制剂来改变体毛生长。在上述各例中，一个生化途径被改变以抑制一种终产物的产生。
若能提供一种从化学上影响体毛生长和体毛色素形成，而又不致引起使用者中所需氨基酸的缺乏或不想要的副作用的方法，则是比较理想的。
发明概述
根据本发明，我们发明了一种改变哺乳动物体毛生长和体毛色素形成的方法，该方法包括以下步骤，基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成：
在相对体毛生长终期的体毛生长诱导足够的时间内，向哺乳动物皮肤局部应用有效量的含蛋白酶的局部活性组合物。
在本发明的另一个实施方案中，我们发明了一种诱导毛囊乳头中程序性细胞死亡和细胞凋亡的方法，该方法包括以下步骤，基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成：
向哺乳动物皮肤局部应用局部活性药物，其具有的第一部分形状上与胰蛋白酶三维结构中的第二部分类似，因而该第一部分和第二部分均能影响受体介导的信号传导。
在本发明的另一个实施方案中，我们发明了一种组合物，其包括以下成分，基本上由以下成分组成或由以下成分组成：
a)一种局部活性药物，其具有的第一部分形状上与胰蛋白酶三维结构中的第二部分类似，因而该第一部分和第二部分均能影响受体介导的信号传导；和
b)一种可药用或美容用的载剂。
在本发明的又一个实施方案中，我们发明了一种组合物，其包括以下成分，基本上由以下成分组成或由以下成分组成：
a)含有蛋白酶、能够在毛囊乳头中诱导细胞凋亡的局部活性药物；知
b)一种可药用或美容用的载剂。
本发明的组合物和方法，通过诱导毛囊乳头中的细胞凋亡，提供了延迟体毛生长和体毛色素形成的独特而又方便的手段。
附图简述
本专利的文件中包括至少一幅彩图。向美国专利与商标局提出请求并支付所需费用之后，专利与商标局可以提供带有彩图的该专利文件副本。
参照以下详述和附图，可以更好地理解本发明，本发明的其它优点也是显而易见的：
图1(a)和1(c)为荧光胰蛋白酶标记的C57BI/6小鼠未处理皮肤的横切面图。图1(b)为荧光胰蛋白酶标记的C57BI/6小鼠用胰蛋白酶局部处理12天后皮肤的横切面图。
图2为C57BI/6小鼠背部皮肤彩色视图，其中一些小鼠在诱导体毛生长后立即以载剂或胰蛋白酶处理，处理时间为：(a)诱导体毛生长后8天；(b)诱导体毛生长后11天；(c)诱导体毛生长后14天。图2(a)中，左侧为处理小鼠，右侧为未处理小鼠。图2(b)和2(c)中，左侧为未处理小鼠，中间为载剂处理小鼠，右侧为胰蛋白酶处理小鼠。
图3A为体毛诱导后(a)4天；(b)5天；(c)8天；和(d)12天，未处理小鼠皮肤的毛囊组织切片。图3B为体毛诱导后(a)4天；(b)5天；(c)6天；(d,e)8天；和(f)12天，胰蛋白酶处理小鼠皮肤毛囊组织切片。
图4(A)为体毛诱导后(a)1天；(b)2天；(c)3天，未处理小鼠TUNEL染色皮肤组织的横切面图。图4(B)为体毛诱导后(a)1天；(b)2天；(c)3天；(d)4天；(e)5天；和(f)8天((a)-(e)为使用一次胰蛋白酶，(f)为每日使用胰蛋白酶)，胰蛋白酶处理小鼠TUNEL染色皮肤组织的横切面图。
图5为在一延迟体毛周期中，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定的胰蛋白酶处理小鼠和未处理小鼠皮肤的基因表达图。图5(A)示出该延迟体毛周期中1到11天的mRNA水平。图5(B)示出该延迟体毛生长周期中第8天的mRNA水平。图中示出25ng(A)和250ng(B)总RNA的RT-PCR产物。
发明详述
本文中，“哺乳动物”指包括哺乳纲的高等脊椎动物的任何成员，同Webster＇s Medical Desk Dictionary 407(1986)的定义，包括但不限于人类。“(％,w/v)”指每100ml组合物中给定成分的克数。“受体”包括细胞内和细胞外受体，指能接收和传导信号的分子。
适合用于本发明组合物的局部活性药物包括蛋白酶，结构基本上与胰蛋白酶三维结构的一部分类似的化合物或其混合物。
优选的蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，包括但不限于胰蛋白酶，羧肽酶Y，蛋白酶Ⅳ，枯草溶菌素或混合物。选用的蛋白酶为胰蛋白酶。若不囿于理论，我们认为这些蛋白酶能够延迟体毛生长和体毛色素形成，原因在于它们通过诱导毛囊乳头中的程序性细胞死亡和细胞凋亡而改变了体毛生长周期，这种改变可能是由受体介导的信号传导诱导的。优选本发明组合物的总体积中，蛋白酶的量为约0％(w/v)到约5％(w/v)，更优选约0.01％(w/v)到约1％(w/v)。
如本文实施例10所述，我们意外地发现，蛋白酶的蛋白水解活性不是影响诱导程序性细胞死亡的唯一因素。若不囿于理论，我们还认为，受体介导的信号传导事件可能也有助于诱导毛囊乳头中的程序性细胞死亡，这类药物可能与局部活性药物的结构成分有关。
因此，第二种合适的局部活性药物包括下述化合物，其具有的一个部分形状上与影响该受体介导的信号传导的胰蛋白酶分子三维结构部分类似。本文中，“形状上基本类似”指所述化合物包括充足的表现类似于配体的结构，该结构可能占据一个受体，或取代受体的配体，或者通过蛋白水解激活或灭活受体，因而有助于诱导程序性细胞死亡。这类形状上基本与胰蛋白酶三维结构中的一部分类似的化合物包括但不限于蛋白水解灭活胰蛋白酶，其为不能消化胶原等蛋白的胰蛋白酶形式。优选在本发明组合物总体积中，这些化合物的量为约0％(w/v)到约5％(w/v)，最优选约0.01％(w/v)到约1％(w/v)。
如果局部活性药用或美容用药物的释放参数要求的话，本发明的局部活性组合物可优选进一步包括可药用或美容用载剂，所述载剂能作为释放系统，使得局部活性药物能进入毛囊中。尽管可向皮肤附属结构(此处为毛囊)释放蛋白酶的任何商用载剂均可用作所述可药用或美容用载剂，但优选的是脂质体。脂质体优选非离子型，并由以下成分组成：a)二月桂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯；b)具有见于胆固醇中的类固醇骨架的化合物；c)具有大约12到18个碳原子的脂肪酸醚，其中细成脂质体的化合物各自比例约为53∶10∶22到63∶20∶32，优选约55∶12∶24到61∶18∶30。最优选由二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚(GDL)组成的脂质体。优选在本发明的组合物总体积中，脂质体的量约为10mg/mL到100mg/mL，更优选约25mg/mL到50mg/mL。最优选比例约为58∶15∶27。合适的脂质体优选根据实施例2的方法制备，但其它本领域常用的方法也可使用。
上述组合物可通过以下方法制备：在合适的容器中合并所需成分，在室温下，采用非离子型脂质体制备中熟知的高剪切混合手段将各成分混合，例见Niemiec等“非离子型脂质体组合物对肽药物局部释放进入毛皮脂单位的影响：仓鼠耳模型的活体研究”，12 Pharm.Res.1184-88(1995)(“Niemiec”)，本文全文引作参考。
在一个优选实施方案中，局部活性药用或美容用组合物的pH可使用已知的pH调节剂进行调节，使得最终组合物的pH为约2-8。pH调节剂包括但不限于N-2-羟乙基哌嗪-N′2-乙烷磺酸，其可购自例如Life Technologies，商品名为“Hepes”，或(羟甲基)氨基甲烷，其可购自Life Technologies，商品名为“Tris”，柠檬酸及其混合物。
在另一个实施方案中，局部活性药用或美容用组合物可以与其它成分组合，所述其它成分如保湿剂，发泡剂，美容佐剂，抗氧化剂，表面活性剂，发泡剂，调节剂，湿润剂，芳香剂，增稠剂，缓冲剂，防腐剂等，其使用量应不破坏脂质体结构，从而产生美容用或药用产品，包括但不限于剃毛乳膏，剃毛胶，剃毛粉，化学脱毛乳膏等。
在本发明另一个实施方案中，我们发明了改变哺乳动物体毛生长和体毛色素形成的方法，该方法是大致在体毛生长诱导之时，向动物皮肤表面使用局部活性药用或美容用组合物。
体毛生长终期毛囊的体毛生长诱导可通过本领域熟知的任何方法实现，所述方法包括但不限于剃除，蜡脱毛，化学脱毛及其组合。
尽管局部活性药用或美容用组合物使用于皮肤的时机及组合物保持在皮肤上的时间长短可以变动，但本领域的技术人员无需过多试验就可以认识到，局部活性组合物优选在体毛生长终期进行体毛生长诱导之前、之后立即或同时用于皮肤表面。本文中，“立即”限定为大约一小时之内。更优选局部活性药用或美容用组合物在体毛生长诱导同时或之后立即使用，留置于皮肤上的时间应足以延迟体毛生长，优选时间为使用后至少约5分钟，更优选使用后至少约15分钟。
局部活性药用或美容用组合物的用量应可以有效改变哺乳动物的体毛生长和体毛色素形成。本文中，“有效量”指足以覆盖需要延迟体毛生长和体毛色素形成的皮肤表面区域的量。优选组合物用于皮肤表面使得需要延迟体毛生长和体毛色素形成的区域，局部活性药物的量为约2μl/cm2到8μl/cm2。
我们意外地发现，当局部活性药物如丝氨酸蛋白酶大致在体毛生长诱导之时局部用于动物皮肤时，获得了至少约9天的体毛生长和体毛色素形成的明显延迟。我们进一步认为，由于人类体毛生长周期通常要慢于小鼠，人类的体毛生长延迟可能会大大超过9天。
通过本文公开的内容，无需本文具体公开的成分、组分或步骤亦可实施本发明。以下提供了一些实施例进一步说明本发明的本质和实施方式。但是，本发明并不由具体细节所限定。实施例实施例1：小鼠受试者的脱毛
12只C57BI/6雌性小鼠获自Charles River(Kingston,NY)，它们均为6-10周龄，分别处于体毛生长的静止期(体毛生长终期)，根据Stenn等的方法(“再论糖皮质激素对体毛生长起始的作用”，6 Skin Pharmacol.,125-134(1993))，每只动物背部通过蜡脱毛(拔除)诱导体毛生长。众所周知，在小鼠中脱毛时，所有毛囊的生长周期(生长期)同步起始。
如表1所示，在诱导部位观察到下列现象：
             表1：诱导部位观察结果
诱导后天数 诱导部位形态及组织学观察结果
1-2(早生长期) 新毛囊开始生长
3-4 毛囊充分发育，但毛干仍不可见
8(晚生长期) 每只小鼠皮肤均呈深暗色；毛干组织学上可见
11-12 毛干开始穿过表皮
14 每只小鼠均被短毛
19 组织学观察可见毛囊退化(退化期)
21-25 毛囊回复到静止期
由表1可见，脱毛后几天当动物粉色皮肤开始变暗时可见体毛生长。这可能是由于毛干中的体毛色素形成，因为C57BI/6小鼠只有毛囊中含有黑素细胞，而表皮中没有。
也通过化学脱毛诱导12只类似的C57BI/6小鼠始于体毛生长终期的体毛生长，化学脱毛剂购自Carter-Wallace，商品名为“Nair”，其用量为使每只小鼠背部湿润。化学脱毛中，深部的毛囊不受影响，深部的前一周期中的毛干在真皮中不受影响，直至被新生毛推出。新体毛周期的生长方式与表1所述相同。
由于鼠的体毛周期不仅在不同品系间不同，在不同个体中也不相同，用剪子自每只小鼠取2cm×1cm皮肤样品，用来自Stephens Scientific的10％福尔马林缓冲液，pH6.9-7.1 25℃下固定，然后根据公知的方法制成石蜡包埋块。按本领域公知的方法，用包埋块切片，H&E染料染色，进行组织学检查，确证体毛周期的阶段。本实施例所得的组织切片图示于图3A。
该实施例显示，C57BI/6小鼠的体毛生长周期平均约为25天，不管使用何种脱毛方法，毛囊及毛干发育的时间均相似。实施例2：局部活性组合物的制备
获自Sigma-Aldrich Corporation的足量冻干胰蛋白酶与0.05M N-2-羟乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸缓冲水溶液混合，上述溶液购自LifeTechnologies，商品名为“Hepes”，使所得溶液pH为约7.4，其中胰蛋白酶浓度为约2％(w/v)。1体积所得胰蛋白酶溶液与1体积水为载剂的(5％)二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂质体混合，后者按Niemiec所述方法制备，以使所得局部活性组合物中胰蛋白酶浓度为1％(w/v)。实施例3：将胰蛋白酶释放到毛囊中
4只7-8周龄雌性C57BI/6小鼠购自Charles River(Kingston,NY)，由6cm×2cm区域拔毛后12天，向该区域使用实施例2的局部活性组合物约100μl/鼠。本实施例中所用的胰蛋白酶用FluoReporter蛋白标记试剂盒进行荧光标记，试剂盒来自Molecular Probes,Inc.，使用方法如所附说明书(1997)，使用异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记，其也购自MolecularProbes,Inc。
使用荧光标记的胰蛋白酶处理之后1小时和4小时，按实施例1的方法，每只小鼠取2cm×1cm皮肤样品，制成石蜡包埋块，然后切片，进行组织学检查。
如图1所示，几乎所有荧光标记见于毛囊内。在1小时(图1(c))和4小时(图1(a))检查的小鼠组织学染色特征相同，以后的时间点未见进一步皮肤穿透。该观察结果揭示不存在非特异性细胞外基质的蛋白酶消化，否则在较后的时间点会显示荧光标记更深地穿透进入角质层。
在4只类似的7-8周龄C57BI/6雌性小鼠中重复上述试验，不同的是小鼠在诱导后12天每天用实施例2的1％(w/v)胰蛋白酶处理。诱导后第12天，在使用荧光胰蛋白酶之后4小时，使用类似的组织学方法分析小鼠皮肤。如图1(b)所示，胰蛋白酶释放进入处理区皮肤毛囊的途径未见大的变化。然而，胰蛋白酶处理皮肤角质层的外部轮微染色表明了屏障完整性的一定损失。
本实施例表明向生长期动物皮肤表面使用含胰蛋白酶的局部活性组合物导致胰蛋白酶主要向毛囊释放，短期和长期使用后均是如此。实施例4：胰蛋白酶延迟体毛生长和体毛色素形成
根据实施例3的方法，体毛生长诱导后立即向12只7-8周龄C57 BI/6雌性小鼠局部使用单剂实施例2制备的局部活性组合物。
如图2所示，体毛生长诱导后使用单剂胰蛋白酶延迟了体毛生长和体毛色素形成。较深的皮肤颜色表明体毛周期的进行性阶段，该阶段之后毛干可见。未处理和脂质体(载剂)处理的对照在体毛生长诱导后7-8天可见深色皮肤(图2a，左边为处理小鼠，右边为未处理小鼠)，它们的毛干在11-13天可见(图2b，左边为未处理小鼠，中间为载剂处理小鼠，右边为处理小鼠)。相形之下，胰蛋白酶处理小鼠在第8天皮肤仍为粉红色(图2a，左侧小鼠)；在第11天为略呈深红(图2b，右侧小鼠)；在第14天皮肤为灰色(图2c，右侧小鼠)。尽管胰蛋白酶处理小鼠的毛干在第15-17天可见，但这些毛干质量较差，不如对照浓密；然而，再过4-7天，除长度外这些毛干在各方面都与对照中相同。
本实施例表明胰蛋白酶可有效延迟体毛生长和体毛色素形成。实施例5：胰蛋白酶处理毛囊的组织学
按照实施例3的方法，体毛诱导后向3只7-8周龄雌性C57 BL/6小鼠皮肤表面使用单剂实施例2制备的局部活性组合物。
如实施例1的方法，取未处理、载剂处理(未示出)和胰蛋白酶处理小鼠1cm×2cm皮肤样品，H&E染色，然后进行组织学检查。如图3所示，染色样品的组织学分析揭示胰蛋白酶处理小鼠的毛囊发育明显被延迟。更具体地说，首次观察到特征性板层结构、膨大的毛囊和新体毛色素形成，要较未处理和载剂处理的对照中首次观察到这些特征晚几天。此外，胰蛋白酶处理小鼠皮肤毛囊显示出膨胀的漏斗形，图3B(a-e)中最为清楚，如图3A(a-b)所示，这一现象在未处理和载剂处理小鼠中不存在。这一观察结果证实，用含胰蛋白酶的组合物处理也会导致体毛生长质量下降，即更细、更稀。用胰蛋白酶处理后7-8天，某些处理毛囊的深部开始形成上皮层状结构，如图3B(d-e)所示，但其浅部仍为中空结构，图3B(d)中最为清楚。用胰蛋白酶处理后11-12天，大多数处理的毛囊已成熟，但体毛色素形成较差，毛干长度较短，类似于未处理毛囊诱导后4-5天的特征(比较图3A(d)与图3B(f))。
本实施例通过组织学分析进一步表明，体毛生长诱导小鼠皮肤局部使用胰蛋白酶显著延迟了体毛生长和体毛色素形成。实施例6：胰蛋白酶诱导毛囊乳头中的细胞凋亡
按照实施例3的方法，在体毛诱导之后向3只7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物。
按实施例1的方法取未处理和胰蛋白酶处理小鼠的1cm×2cm皮肤样品，然后通过TdT介导的dUTP-生物素切口末端标记(TUNEL)法分析，该方法见Gavrieli等“通过核内DNA片段的特异标记原位识别程序性细胞死亡，”119 J.Cell Biology 493-501(1992)(“Gavrieli”)。在上述操作中，制备的皮肤石蜡切片使用购自Oncor,Inc.的“ApopTagTM Plus原位细胞凋亡检测试剂盒”染色，方法如Oncor,Inc.的“ApopTagTM Plus原位细胞凋亡检测试剂盒”说明书(1995年2月)，该方法基于Gavrieli所述的DNA片段末端标记。图4示出了组织学分析结果，其中染色包括过氧化物酶终点(棕色)和甲基绿复染。
类似地，由小鼠未处理皮肤制备适合TUNEL染色的石蜡切片。将切片染色并进行组织学分析；结果见图4A(a-c)。
如图4所示，TUNEL染色样品通过形态(致密或片段化的胞核和胞质或凋亡小体)或着色(致密的胞核中DNA片段染成棕色)限定了凋亡细胞。更具体而言，图4B(a-e)显示，在体毛生长诱导后第一周，处理的毛囊乳头中均可检测到凋亡小体。但是，胰蛋白酶处理不影响毛囊其它部分、表皮或真皮。相形之下，图4A(a-c)未处理样品的TUNEL染色显示，未处理的早生长期毛囊中偶尔可检测到极低水平的细胞凋亡；但是，在毛囊峡部总可见到细胞凋亡，因而毛囊滤泡以上细胞凋亡充分。大多数未处理毛囊未显示任何细胞死亡。
本实施例显示向已脱毛皮肤使用胰蛋白酶，使得相对于未处理或载剂处理对照，胰蛋白酶处理的毛囊乳头中细胞凋亡增加。实施例7：胰蛋白酶诱导体毛周期中基因表达的改变
根据实施例3的方法，在体毛诱导之后向6只7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物。
在图5所示时间间隔，按实施例1所述取未处理小鼠和胰蛋白酶处理小鼠的皮肤，然后使用来自Tel-Test“B”的“RNA Stat-60”试剂提取总RNA，上述试剂的描述见Chomczymski，“使用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步提取RNA的方法，”162 Anal.Biochem.156-59(1987)。向每只小鼠中提取的RNA中加入足量无RNase的DNase，酶来自Promega公司，商品名为“RQ1无RNase的DNase”使得各样品均含200ng DNase消化的RNA，方法见Promega公司出版的“无RNase的DNase”说明书(1995年5月)。所得200ng DNase消化的RNA使用随机六聚体进行反转录(“RT”)，方法见Gibco-BRL(现为Life Technologies,Incorporated)出版的“SuperscriptⅡ反转录酶”说明书(1992年4月)，随机六聚体如购自Life Technologies,Incorporated的随机引物。
所得RT产物通过聚合酶链反应(“PCR”)扩增，反应使用约0.5单位(每100μl反应)热稳定性DNA聚合酶和约0.1μmol/反应基因特异性引物，酶购自Rerkin-Elmer-Cetus公司，商品名为“Taq聚合酶”，引物获自Clontech Laboratories,Inc.(“Clontech”)或按表2进行设计，方法同Clontech引物所附说明书中扩增小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)、转录因子和细胞因子的方法，或如表2所述。
表2列出了使用的某些DNA引物，PCR反应所需的MgCl2量及PCR循环的长度。
              表2：用于RT-PCR试验的DNA引物
    引物(见所附序列表) MgCl2量(mM) 循环(min)@℃   循环次数 DNA Seq.ID No.
    转谷氨酰胺酶有义AACCCCAAGT TCCTGAAG     2.5     1@94；2@55；3@72     35     1
    转谷氨酰胺酶反义TTTGTGCTGG GCCACTTC     2.5     1@94；2@45；3@72     35     2
    酪氨酸酶有义TCAGCCCAGCATCCTTCTTC     5     1@94；2@45；3@72     35     3
    酪氨酸酶反义CAGCCATTGTTCAAAAATAC TGTCC     5     1@94；2@55；3@72     35     4
阿黑皮原素(“POMC”)有义AAAAGAAGAGAGAAGAGCGA C     2.5     1@94；2@55；3@72     35     5
    POMC反义AGAGCTGAGACACCCTTACC     2.5     1@94；2@55；3@72     35     6
    胶原酶有义AAGACCCCAACCCTAAGCAC     2.5     1@94；2@53；3@72     35     7
    胶原酶反义CAGCACTGACGGTTTTCACC     2.5     1@94；2@53；3@72     35     8
PCR产物通过2％琼脂糖/溴化乙锭凝胶根据本领域熟知的方法进行分析，以便比较胰蛋白酶处理和未处理小鼠体毛周期中某些基因的表达水平。为更好地进行观察，所得PCR产物根据熟知的方法用乙醇沉淀。当使用G3PDH引物时，只使用10％的PCR反应产物。每一PCR扩增设置一个阴性对照，使用未经反转录的7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤RNA样品。若阳性对照不能够买得到，使用具有非同步体毛周期的6月龄雌性C57BI/6小鼠的皮肤RNA样品作为阳性对照。RT-PCR产物在凝胶上的迁移均与阳性对照相同，亦与报道的扩增引物大小一致。
然后通过分析各产物中一种“管家”基因G3PDH的mRNA水平，比较各RT-PCR反应产物的相对质量。如图5所示，在检查的所有时间点G3PDH基因表达相近，因而可以对所需基因的相对表达水平进行比较。
为证实毛囊发育延迟不是由于非特异性刺激或炎症应答，我们分析了此种情况下一般下调的基因的mRNA水平。检查了RT-PCR产物基因的mRNA水平之后，我们发现IL-6、IL-10和GM-CSF的mRNA水平没有变化，TNFα略微上调，TNFβ和TNF-RI略微下调，巨噬细胞诱导蛋白(MIP)中度下调，如表3所示。
           表3：基因表达特征
基因     未处理     胰蛋白酶处理
IL-6     -       -
IL-10    +/-      +/-
GM-CSF     -       -
TNFα    +/-       +
TNFβ     +      +/-
TNF-RⅠ    +/-    +/- -
TNF-RⅡ     -      -
MIP     +      -
IL-1α     +     + +
IL-1β    +/-    + + +
IL-1R     -      -
IFNγ     -    + + +
c-myc     +      -
c-myb    + +      +
c-fos     +     +/-
c-jun    +/-      +
胶原酶     +     +/-
酪氨酸酶   + + +     +/-
POMC     +     +/-
转谷氨酰胺酶     +      +
*注意RT-PCR仅为半定量。比较仅对每一扩增序列不同体毛周期有意义，而不同基因间比较无意义。
-     未检测到表达    +     强带
+/- - 极弱带          + +   较强带
+/-   弱带            + + + 极强带表3的基因表达分布图否定了炎症反应或对真皮刺激的应答。
IL-1αmRNA水平中度上调(图5b及表3),IL-1α为与培养物中体毛周期抑制相关的基因。由于IL-1α诱导也可能由于表皮屏障功能的丧失，我们通过测定经表皮水损失(TEWL)分析了屏障完整性。TEWL使用获自Servomecl AB的“Evaporimeter EPI”蒸发计测定，首先以室内湿度标定蒸发计，然后将探头置于受试者皮肤上。结果显示，TEWL仅中度增加，与胰蛋白酶浓度不一致，如表4所示。
         表4：胰蛋白酶处理皮肤的TEWL
    处理   样本大小     TEWL
未处理     6     27.01±3.8
0.01％胰蛋白酶     4     36.89±4.6
0.1％胰蛋白酶     4     43.2±5.2
0.5％胰蛋白酶     4     34.53±4.9
1％胰蛋白酶     4     37.5±3.9
1％胰蛋白酶-灭活(温和)     3     33.99±6.2
因此，可能表3和图5所示的RT-PCR产物中IL-1α的任何上调均与体毛生长抑制相联系。
如图5a-b及表3所示，IL-1B及IFNγ的mRNA水平均大幅增加，已知二者在簇状脱发中均上调，均与体毛生长抑制相联系。这进一步表明，只有胰蛋白酶上调的炎症相关基因与体毛生长抑制相联系。
如表3所示，在延迟期中，c-myb、c-myc和c-fos的mRNA水平略微下降，而c-jun水平略微上升。胶原酶基因通过AP-1应答元件调节，其水平也略微下降。某些基因的mRNA水平的普遍略微下降进一步表明胰蛋白酶处理皮肤体毛生长的全面延迟。
如图5A和表3所示，体毛色素形成的关键酶酪氨酸酶在体毛生长期延迟期间下调，而当开始克服延迟时，其mRNA水平增加。如图5A和表3所示，在延迟期间促黑素原肽促黑激素(MSH)的前体POMC中度下调。这两个基因的下调表明胰蛋白酶也影响体毛色素形成的调节。
本实施例表明，胰蛋白酶对体毛周期的影响可通过观察延迟期间一系列基因的表达特征而理解。已清楚地证实了在体毛周期中胰蛋白酶诱导的mRNA水平变化，表明了胰蛋白酶在体毛生长和体毛色素形成中的调节作用。并且，本实施例还反映了局部使用胰蛋白酶对体毛生长和体毛色素形成基因的特异性。实施例8：其它影响体毛生长的丝氨酸蛋白酶
按照实施例3的方法，在体毛诱导后向7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物。
重复实施例3的操作，但分别用羧肽酶-Y蛋白酶Ⅳ和枯草溶菌素代替胰蛋白酶。
处理后8天，每只小鼠的皮肤使用Minolta Chromameter CR300型比色计检查，以比较其皮肤颜色。
我们注意到胰蛋白酶诱导的体毛生长延迟期最长，胰蛋白酶为内肽酶家族的一个成员，它在精氨酸和赖氨酸的C侧切断蛋白。相形之下，羧肽酶-Y在蛋白的C末端水解L-氨基酸，蛋白酶Ⅳ在中性pH切断56％的肽键，它是非特异性外肽酶家族的一个成员，二者只有极低的延迟效应，而枯草溶菌素是非特异性肽酶家族的一个成员，它在碱性pH时切断肽键，它略微增加体毛生长速度。本实施例的结果见表5。
         表5：丝氨酸蛋白酶处理皮肤的颜色测定
    处理   样本大小     L*
未处理     6     49±0.30
1％胰蛋白酶     6     56.1±0.81
1％枯草溶菌素     4     42.9±2.87
1％内肽酶     4     51.8±0.11
1％羧肽酶-Y     4     51.9±0.47
(L*标尺：0=黑，100=白，为根据皮肤表面观察的体毛色素形成的测定值。)
如表5所示，胰蛋白酶处理的毛囊发育最不充分，因而皮肤颜色最浅。本实施例表明，皮肤颜色表现与毛囊中体体毛育有关。
由于胰蛋白酶处理皮肤所得结果表明胰蛋白酶在延迟体毛生长和体毛色素形成方面相对更好，本实施例证实胰蛋白酶对体毛生长和体毛色素形成的作用不仅仅是由于非特异性的蛋白水解，还可能是由于胰蛋白酶诱导的特异活性引起程序性细胞死亡途径的激活。实施例9：胰蛋白酶影响体毛生长诱导的早期步骤
按照实施例3的方法，在体毛生长诱导后向3只7-8周龄雌性C57BL/6小鼠的皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物。另9只小鼠亦重复上述操作，但处理分别为每周2次、3次或7次。
观察小鼠皮肤颜色8天后，可见处理小鼠皮肤颜色浅于未处理的对照。这进一步表明胰蛋白酶处理的毛囊发育最不充分，因而使得皮肤颜色最浅。
按实施例1的方法取各种处理小鼠的1cm×2cm皮肤样品，H＆E染色，然后进行组织学检查。染色样品的组织学分析表明，增加胰蛋白酶处理动物的次数并未延长体毛生长的延迟期。这表明丝氨酸蛋白酶诱导细胞死亡由特异定时的事件引起。
为确定该特异事件的时间，按照实施例3的方法，在体毛诱导后向7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物，但处理在表6所示的不同时间点进行。
如表6所示，根据实施例8的方法对皮肤颜色的比色测定证实深色增加(色素更多，延迟更少)与体毛生长诱导和胰蛋白酶使用之间间隔时间增加相应。体毛生长诱导后立即处理的小鼠体毛生长和体毛色素形成的延迟期最长。体毛生长诱导后2小时和4小时处理小鼠表现出延迟期更短的体毛周期。脱毛后6小时或更长时间处理的小鼠体毛生长未见延迟，与未处理的对照没有区别。
        表6：胰蛋白酶处理皮肤的颜色测定
    处理   样本大小     L*
未处理     6     49±0.32
1％胰蛋白酶，立即     6     56.1±1.54
1％胰蛋白酶，2小时后     4     54.4±1.30
1％胰蛋白酶，4小时后     4     53.3±1.23
1％胰蛋白酶，6小时后     4     48.0±2.01
1％胰蛋白酶，18小时后     4     49.2±1.07
1％胰蛋白酶，48小时后     4     50.4±1.01
**皮肤样品在脱毛后8天测试。
本实施例表明，在体毛生长诱导后4小时，优选立即，向皮肤使用胰蛋白酶可有效延迟体毛生长和体毛色素形成。实施例10：胰蛋白酶的作用可能涉及受体介导的途径
按照实施例3的方法，在体毛诱导后向7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用单剂如实施例2制备的局部活性组合物，但胰蛋白酶浓度由1％(w/v)到0.01％(w/v)(4×10-4M-4×10-6M)变化。脱毛后第9天，按实施例9的方法对小鼠进行比色分析。
如图7所示，比色分析的结果表明亮色增加(L*，白色更多，色素更少)与胰蛋白酶浓度减少及体毛周期延迟增加相应。
             表7：胰蛋白酶处理皮肤的亮色
    处理     样本大小     L*
未处理     6     45±0.97
0.01％胰蛋白酶     4     48.6±1.01
0.1％胰蛋白酶     4     49.5±1.07
0.5％胰蛋白酶     4     47.7±0.3
1％胰蛋白酶     4     47.9±0.08
1％胰蛋白酶-灭活(温和)     3     52.2±0.17
L*标尺：0=黑，100=白**样品在脱毛后9天分析。
本实施例表明存在着受体介导的机制，包括高剂量脱敏。实施例11：胰蛋白酶的蛋白水解活性对延迟体毛生长不是必需的
实施例2的组合物在室温下温育48小时，然后通过获自Pan VeraCorporation的丝氨酸蛋白酶活性检测试剂盒分析其蛋白水解活性，结果表明其中已检测不到蛋白水解活性。按照实施例10的方法，在体毛诱导后向3只7-8周龄雌性C57BL/6小鼠皮肤表面使用该灭活组合物。脱毛后第9天，通过实施例8的方法对小鼠进行比色分析。如表7所示，很明显胰蛋白酶缺乏蛋白水解活性并不降低其延迟体毛生长的活性。
重复以上操作，但温育的胰蛋白酶代之以100℃煮沸10分钟的胰蛋白酶。结果表明，使用同样灭活了蛋白水解活性的煮沸的胰蛋白酶，对体毛生长没有延迟作用。煮沸破坏了胰蛋白酶的三维结构，这表明是胰蛋白酶的三维结构，而非其蛋白水解活性对体毛周期的延迟效应起作用。无论胰蛋白酶是阻断存活信号还是激活死亡受体来引发该过程，本实施例都表明胰蛋白酶分子的构象可能也有助于诱导毛囊乳头中的程序性细胞死亡和细胞凋亡。实施例12：含胰蛋白酶组合物的应用
二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚脂质体按Niemiec的方法制备，其中脂质体各组成成分的比例为约58∶15∶27。
待脂质体温度降至约40℃后，将脂质体按常规混合加至一定量的增稠剂中，增稠剂由聚丙烯酰胺(和)C13-C14异石蜡(isoparaffin)(和)Iaureth-7组成，获自Seppic,Inc.，商品名为“SEPIGEL 305”，使得最终组合物中增稠剂的量为约1-3％(w/v)。
然后向其中加入足量胰蛋白酶，得到1％的胰蛋白酶(w/v)组合物。该组合物适于立即局部使用。
所得产品具有有效剃毛胶的特点和性质。

Claims (49)

1．改变哺乳动物体毛生长和体毛色素形成的方法，包括：
在相对体毛生长终期的体毛生长诱导足够的时间内，向动物的皮肤局部使用有效量的含有蛋白酶的局部活性组合物。
2．权利要求1的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
3．权利要求2的方法，其中蛋白酶选自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
4．权利要求3的方法，其中蛋白酶是胰蛋白酶。
5．权利要求4的方法，其中蛋白酶的量为局部活性组合物总体积的约0％(w/v)到5％(w/v)。
6．权利要求5的方法，其中蛋白酶的量为局部活性组合物总体积的约0.01％(w/v)到1％(w/v)。
7．权利要求1的方法，其中所述的改变之一是延迟体毛生长和体毛色素形成。
8．权利要求1的方法，其中所述局部活性组合物还包括可药用或美容用载剂。
9．权利要求8的方法，其中所述可药用或美容用载剂为脂质体或其混合物。
10．权利要求9的方法，其中所述脂质体为非离子型。
11．权利要求10的方法，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；
b)具有见于胆固醇中的类固醇骨架的化合物或其混合物；及
c)具有约12到18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
12．权利要求10的方法，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯；
b)胆固醇；及
c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
13．权利要求11的方法，其中所述脂质体中各组分的比例约为53∶10∶22到63∶20∶32。
14．权利要求8的方法，其中所述可药用或美容用载剂的量基于所述局部活性组合物的总体积约为0mg/mL到100mg/mL。
15．权利要求1的方法，其中体毛生长终期体毛的生长诱导是通过剃除、电针去除、蜡脱毛、化学脱毛或所述方法的组合完成的。
16．权利要求1的方法，其中所述时间为与体毛生长终期毛囊的体毛生长诱导同时或在其之前或之后即时。
17．权利要求16的方法，其中所述时间为与体毛生长诱导同时或在其之后即时。
18．权利要求1的方法，其中所述组合物还包括表面活性剂、保湿剂、湿润剂、调节剂、芳香剂、色剂或其混合物。
19．权利要求18的方法，其中所述组合物的形式为剃毛乳膏、剃毛胶、剃毛粉、化学脱毛乳膏、其它目的在于促进体毛去除或实际去除体毛的产品或其组合。
20．权利要求1的方法，还包括使所述组合物在皮肤上保留足够的时间从而实现所述改变。
21．权利要求20的方法，其中所述时间为至少约15分钟。
22．权利要求1的方法，还包括将所述蛋白酶与含N-2-羟乙基哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸、(羟甲基)氨基甲烷或其混合物的缓冲液混合。
23．在哺乳动物的毛囊乳头中诱导程序性细胞死亡和细胞凋亡的方法，包括：
向哺乳动物的皮肤局部使用局部活性药物，其具有的第一部分形状上与胰蛋白酶三维结构的第二部分类似，因而所述第一部分和第二部分均能影响受体介导的信号传导。
24．权利要求23的方法，其中所述药物为胰蛋白酶、蛋白水解活性灭活的胰蛋白酶或其组合。
25．含有以下成分的组合物：
a)一种局部活性药物，其具有的第一部分形状上与胰蛋白酶三维结构的第二部分类似，因而所述第一部分和第二部分均能影响受体介导的信号传导；及
b)可药用或美容用载剂。
26．权利要求25的组合物，其中局部活性药物为胰蛋白酶、蛋白水解活性灭活的胰蛋白酶或其组合。
27．权利要求25的组合物，其中局部活性药物为组合物总体积的约0％(w/v)到5％(w/v)。
28．权利要求25的组合物，其中局部活性药物为组合物总体积的约0.01％(w/v)到1％(w/v)。
29．权利要求25的方法，其中所述可药用或美容用载剂为脂质体。
30．权利要求29的方法，其中所述脂质体为非离子型。
31．权利要求30的方法，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；
b)具有见于胆固醇中的类固醇骨架的化合物或其混合物；及
c)具有约12到18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
32．权利要求30的方法，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯；
b)胆固醇；及
c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
33．权利要求31的组合物，其中所述脂质体中各组分的比例约为53∶10∶22到63∶20∶32。
34．权利要求25的组合物，其中所述可药用或美容用载剂的量基于所述组合物的总体积约为0mg/mL到100mg/mL。
35．权利要求25的组合物，其中所述组合物还包括表面活性剂、保湿剂、湿润剂、发泡剂、美容佐剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、调节剂、芳香剂、色剂或其混合物。
36．权利要求35的组合物，其中所述组合物的形式为剃毛乳膏、剃毛胶、剃毛粉、化学脱毛乳膏、其它目的在于促进体毛去除或实际去除体毛的产品或其组合。
37．含有以下成分的组合物：
a)一种局部活性药物，其含有能诱导毛囊乳头中细胞凋亡的蛋白酶；及
b)可药用或美容用载剂。
38．权利要求37的组合物，还包括选自以下的一种组分：表面活性剂、保湿剂、湿润剂、发泡剂、美容佐剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、调节剂、芳香剂、色剂或其混合物。
39．权利要求37的组合物，其中所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。
40．权利要求39的组合物，其中所述蛋白酶选自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶Ⅳ、枯草溶菌素或其混合物。
41．权利要求37的组合物，其中局部活性药物为组合物总体积的约0％(w/v)到5％(w/v)。
42．权利要求37的组合物，其中局部活性药物为组合物总体积的约0.01％(w/v)到1％(w/v)。
43．权利要求37的组合物，其中可药用或美容用载剂为脂质体。
44．权利要求43的组合物，其中脂质体为非离子型。
45．权利要求43的组合物，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯或其混合物；
b)具有见于胆固醇中的类固醇骨架的化合物或其混合物；及
c)具有约12到18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。
46．权利要求43的组合物，其中所述脂质体由以下组分组成：
a)二月桂酸甘油酯；
b)胆固醇；及
c)聚氧乙烯-10-硬脂基醚。
47．权利要求45的组合物，其中所述脂质体中各组分的比例约为53∶10∶22到63∶20∶32。
48．权利要求37的组合物，其中所述可药用或美容用载剂的量基于所述组合物的总体积约为0mg/mL到100mg/mL。
49．权利要求37的组合物，其中所述组合物的形式为剃毛乳膏、剃毛胶、剃毛粉、化学脱毛乳膏、其它目的在于促进体毛去除或实际去除体毛的产品或其组合。
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