KR20000023665A - 모포 유두에서 아포프토시스에 의해 모 생장 및 모 착색을 변형시키는 방법 및 이를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세린 프로테아제를 이용하여 모포 유두에서 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스를 유도하여 모 생장 및 모 착색의 변화에 영향을 주는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명에서는 트립신 분자의 일부분에 구조적으로 유사한 부분을 가지는 물질을 포함하여 트립신과 동일한 방식으로 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스를 유도할 수 있는 조성물을 기술하고 있다.

Description

모포 유두에서 아포프토시스에 의해 모 생장 및 모 착색을 변형시키는 방법 및 이를 위한 조성물 {Methods for altering hair growth and hair pigmentation by apoptosis in the follicular papillae and compositions therefor}

관련 출원에 대한 참고 문헌

본 출원은 1996년 7월 12일자 출원된 미국 임시 출원 제60/021,829호의 장점을 청구하며, 이는 전체가 본원에 인용된다.

포유류에 있어서, 모의 주요 기능 중 하나는 환경으로부터 보호하는 것이다. 그러나, 이와 같은 기능이 사람에게는 거의 상실되어 왔고, 사람들은 미용상의 이유로 모를 기르거나 제거한다.

원하지 않는 모를 제거하는데는 많은 방법이 이용되는데, 가령, 면도, 전기분해, 뽑기, 치료제 항-안드로겐을 주사하는 등의 방법이 있다. 이와 같은 통상적인 방법은 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 면도의 경우는 피부 표면에 상처나 베인 자국이 많이 생기게 되고, 모가 재생장하는 속도가 증가되는 것을 간과하게되고, 짧은 모가 많이 남아 있게 된다. 전기분해는 원하지 않는 모를 장시간동안 제거할 수 있으나, 그 비용이 상당하고, 상처가 남을 수도 있다. 뽑는 경우에는 통증이 있고, 불편하고, 짧은 모는 제거하기가 어렵다. 항-안드로겐을 이용하는 경우에는 건강에 영향을 주는 등과 같은 몇 가지 부작용을 수반한다. 또한, 전기분해를 제외하고는 모든 방법은 매일 반복적으로 행해야 함으로 사용자가 불편을 느낀다. 이와 같은 이유로 모 생장을 지연시키는 화학적인 방법이 필요하다.

문헌 [미국 특허 제5,455,234호, Ahluwalia, et al]에서 설명을 하고 있는 것과 같이, 피부에 시스테인 경로 효소 방해물질을 사용함으로써 포유류 모가 생장하는 것을 변경시킬 수 있는데, 이로써 시스테인이 관여하는 모의 생장 속도 및 특징에 대한 대사 경로를 지연시키거나 중단시킨다. 그러나, 시스테인으로 인한 방해로 치료 부위에 이 아미노산이 부족하게 된다. 유사하게, 문헌 [미국 특허 제5,095,007호, Ahluwalia; 미국 특허 제5,096,911호 및 제5,468,476호, Ahluwalia et al.; 미국 특허 제5,132,293호 및 제5,143,925호, Shander et al.]에서는 모 생장을 변형시키는데 효소 방해물질을 이용한다고 상술하고 있다. 이들 각 경우에 최종 산물의 생성을 방해하기 위해 생화학적인 경로를 변경시켰다.

사용자의 필수 아미노산을 박탈하지 않고, 사용자에게 부작용을 일으키지 않으면서 모 생장 및 모 착색에 화학적으로 영향을 주는 방법이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, 휴지기 모에서 생장을 유도할 수 있는 충분한 시간동안 프로테아제를 포함하는 국소 활성 조성물 유효량을 포유류 피부에 국소적으로 도포함을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이로 구성된, 포유류 모 생장 및 모 착색의 변화에 영향을 주는 방법을 밝혀내었다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 트립신의 3차 구조의 제2 부분과 모양이 유사한 제1 부분을 가지는 국소 활성 물질을 포유류의 피부에 국소적으로 도포(이때 제1 부분과 제2 부분은 수용체-매개된 신호 전달을 할 수 있다)함을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이로 구성된 모포 유두내에 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스를 유도하는 방법을 밝혀내었다.

본 발명의 또 다른 양태에서,

(a) 트립신의 3차 구조의 제2 부분과 모양이 유사한 제1 부분을 가지는 국소활성 물질(이때, 제1 부분과 제2 부분은 수용체-매개된 신호 전달을 할 수 있다); 및

(b) 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이로 구성된 조성물을 밝혀내었다.

본 발명의 또 다른 양태에서,

(a) 모포 유두에서 아포프토시스를 유도할 수 있는 프로테아제를 포함하는 국소 활성 물질; 및

(b) 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이로 구성된 조성물을 밝혀내었다.

본 발명의 조성물 및 방법은 모포 유두에서 아포프토시스를 유도함으로써 모 생장 및 모 착색을 지연시키는 독특하고, 편리한 수단을 제공한다.

본 발명은 모포 유두(follicular papillae)에서 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스(apoptosis)를 야기시키는 방법 및 이에 효과적인 조성물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는 본 발명은 프로테아제 또는 수용체-매개된 신호 전달 경로에 영향을 주는 분자를 국소적으로 이용하여 모 생장 및 모 착색 속도를 변화시키는 방법에 관한 것이다.

본 특허 파일에는 컬러로 작성된 적어도 한가지 도면을 포함한다. 컬러 도면이 포함된 본 특허 복사본은 미국 특허상표청에 필요 경비와 함께 제출될 것이다.

본 발명은 첨부 도면과 다음에서 상술하는 발명의 상세한 설명으로 더욱 명백하게 이해할 수 있을 것이다.

도 1(a)와 1(c)는 형광 트립신이 표지된 아무런 처리를 하지 않은 C57BL/6 마우스의 피부의 단면을 나타낸다. 도 1(b)는 형광 트립신이 표지된 트립신-처리를 한 마우스에 국소 처리후 12일에 C57BL/6 마우스의 피부 단면을 나타낸 것이다.

도 2는 C57BL/6 마우스의 등 피부를 나타낸 것으로, 이중 일부는 모 생장을 유도한 후에 바로 부형제 또는 트립신(1%)으로 처리한 것으로써; (a)는 모 생장 유도후 8일째 취한 것이고; (b)는 모 생장 유도후 11일째 취한 것이고; (c)는 모 생장 유도후 14일째 취한 것이다. 도 2(a)에서는 좌측 마우스는 처리를 한 것이고, 우측 마우스는 처리를 하지 않은 것이다. 도 2(b)와 (c)에서는, 좌측 마우스는 처리를 하지 않은 것이고, 중앙 마우스는 부형제로 처리를 한 것이고, 우측 마우스는 트립신으로 처리를 한 것이다.

도 3A는 모 생장 유도후에 모 포상의 조직을 설명하는 것이로써; (a), (b), (c), (d)는 각 모 생장 유도후 각 4일, 5일, 8일, 12일째의 조직을 나타낸다. 도 3B는 모 생장 유도후에 트립신-처리한 마우스 피부의 모 포상의 조직을 설명하는데, (a), (b), (c), (d,e), (f)는 각 모 생장 유도후 각 4일, 5일, 6일, 8일, 12일째의 조직을 나타낸다.

도 4A는 모 생장 유도후에 처리안된 마우스의 TUNEL-착색된 피부 조직의 단면을 설명하는 것으로써, (a), (b), (c)는 각 모 생장 유도후 각 1일, 2일, 3일째의 조직을 나타낸다. 도 4B는 모 생장 유도후에 트립신-처리된 마우스의 TUNEL-착색된 피부조직의 단면을 설명하는 것으로써, (a), (b), (c), (d), (e), (f)는 각 모 생장 유도후 각 1일, 2일, 3일, 5일, 8일째의 조직을 나타내는데, 이때 (a-e)는 1회 트립신을 제공한 것이고, (f)는 매일 트립신을 제공한 것이다.

도 5는 역 전사-중합효소 연쇄 반응("RT-PCR")에 의해 감지되는 지연된 모 생장 사이클 동안에 처리 안된 마우스 피부와 트립신-처리된 마우스 피부의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 도 5A는 지연된 모 생장 사이클의 1일 내지 11일의 mRNA 수준을 설명하는 것이다. 도 5B는 지연된 모 생장 사이클 8일째의 mRNA의 수준을 설명하는 것이다. 총 RNA의 RT-PCR 생성물의 양은 (a)25ng 및 (b)250ng으로 나타난다.

본원에서 사용된, "포유류"는 사전 [Webster's Medical Desk Dictionary 407(1986)]에서 정의하는 것과 같은 "포유류 강을 포함하는 고등 척추동물"의 구성원을 의미하며, 사람을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 본원에서　사용된 "(%, w/v)"는 전체 조성물 100㎖당 주어진 성분의 g을 말한다. 본원에서　사용된 , "수용체"는 세포내 수용체와 세포외 수용체 둘다를 포함하고, 신호를 수용하고 전달할 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명의 조성물에 이용하는데 적합한 국소 활성물질에는 프로테아제, 트립신의 3차 구조의 일부와 실질적으로 유사한 구조를 가지는 화합물, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

바람직한 프로테아제는 세린 프로테아제이며， 트립신, 카복시펩티다아제-Y, 프로테아제 IV, 서브틸리신 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 선택된 프로테아제는 트립신이다. 본 이론에 국한되지는 않지만, 모 생장 및 모 착색을 지연시킬 수 있는 프로테아제는 모포 유두내에서 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스를 유도하여 모 생장 사이클을 변형시키고, 이와 같은 변형은 수용체-매개된 신호 전달에 의해 유도된다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 총 용적을 기준으로 프로테아제의 양은 약 0%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 보다 바람직하게는 약 0.01%(w/v) 내지 약 1%(w/v)가 된다.

본원에서 실시예 10에서 증명된 것과 같이, 프로테아제의 단백질 분해 활성은 프로그램된 세포 죽음을 유도하는데 기여하는 인자만은 아니다라는 기대이상의 발견을 하였다. 이론에 국한시키고자 함은 아니지만, 수용체-매개된 신호 전달 과정은 모포 유두의 프로그램된 세포 죽음을 유도하는데 기여를 하고, 이와 같은 형태의 물질은 국소 활성 물질의 구조 성분과 연관이 있는 것으로 보인다.

따라서, 두 번째 적절한 국소 활성 물질에는 이와 같은 수용체-매개된 신호전달에 영향을 주는 트립신 분자의 3차 구조의 부분과 모양이 실질적으로 유사한 부분을 가지는 화합물을 포함한다. 본원에서 사용된, "모양이 실질적으로 유사한"이란 화합물이 수용체를 점령하거나, 수용체로부터 리간드를 제거하거나, 단백질 분해성 절단에 의해 수용체를 활성화시키거나 비활성화시켜, 프로그램된 세포 죽음을 유도할 수 있는 리간드와 같은 행동을 하는 구조를 가진다는 것을 의미한다. 트립신의 3차 구조의 부분과 모양이 실질적으로 유사한 부분을 가지는 화합물의 예로는 단백질 분해 활성이 없는 트립신을 포함하나 이에 국한시키지는 않고, 이때, 이와 같은 트립신은 콜라겐과 같은 단백질을 분해할 수 없는 트립신 형태를 말한다. 바람직하게는 본 발명의 조성물 총 용적을 기준으로 프로테아제의 양은 약 0%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 보다　바람직하게는 약 0.01%(w/v) 내지 약 1%(w/v)가 된다.

국소 활성 약제학적 또는 화장용 물질의 운반 매개 변수가 필요한 경우에, 본 발명의 국소 활성 조성물에는 모포로 국소 활성물질을 침투시키기 위한 운반 시스템 기능을 할 수 있는 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 추가로 포함된다. 적절한 피부 부속물(본원의 경우에는 모포에 프로테아제를 운반하기 위한 시판되는 부형제를 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제로 이용을 할 수 있는데, 리포좀이 바람직하다. 좀더 바람직한 것은 비-이온성 리포좀이고; 이 리포좀은 (a) 글리세롤 디라우레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트; (b) 콜레스테롤에서 발견되는 스테로이드 기본구조를 가지는 화합물; (c) 탄소수 약 12 내지 약 18의 지방산 에테르로 구성되고, 이때 리포좀의 구성 성분들의 비율은 약 53:10:22 내지 약 63:20:32이고, 바람직하게는 약 55:12:24 내지 약 61:18:30의 비율이 된다. 글리세롤 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르(GDL)로 구성된 리포좀이 가장 바람직하다. 바람직하게는 리포좀은 전체 조성물의 중량을 기준으로 약 10㎎/㎖ 내지 약 100㎎/㎖로 존재하고, 더욱 바람직하게는 약 25㎎/㎖ 내지 약 50㎎/㎖로 존재한다. 약 58:15:27의 비율이 가장 바람직하다. 당분야에서 흔히 이용되는 방법으로 만들 수 있겠지만, 실시예 2에서 제시한 과정에 따라 적절한 리포좀을 만드는 것이 가장 바람직하다.

적절한 용기에 원하는 성분을 복합시키고, 비-이온성 리포좀 제제를 만들기 위한 당분야에 공지된 통상적인 고전단 믹서를 이용하여 주변온도에서 이를 혼합하여 상기 조성물을 만들 수 있고, 이와 같은 내용은 문헌［Niemiec et al., "Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model," 12 Pharm. Res. 1184-88 (1995) ("Niemiec")］에 상술되어 있고, 이의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된다.

바람직한　양태에서, 국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물의 pH는 공지의 pH 조절물질을 이용하여 최종 조성물의 pH를 약 2 내지 약 8로 조절할 수 있는데, pH 조절물질의 예로는 라이프　테그놀로지즈사（Life Technologies)에서 "Hepes" 상표로 시판하는 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산 또는 라이프　테크놀로지즈사에서 "Tris"상표로 시판하는 (하이드록시메틸)아미노메탄, 구연산 및 이의 혼합물등이 있으나, 이에 국한시키지는 않는다.

또 다른 양태에서, 국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물에는 습윤제, 발포제, 화장용 보조제, 산화방지제, 계면활성제, 컨디셔너, 보습제, 방향제, 점성제, 완충제, 보존제 및 다른 성분 등을 추가로 포함할 수 있는데, 이때 다른 추가 성분은 리포좀의 구조를 파괴시키지 않을 정도의 양으로 존재하게 되어, 면도용 크림, 면도용 겔, 면도용 파우더, 화학 탈모제 크림등과 같은 화장용 또는 약제학적 생성물로 만들 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 포유류의 모 생장 및 모 착색의 변화에 영향을 줄 수 있는 공정을 발견하였는데 그것은 모 생장을 유도하는 시간동안에 동물의 피부 표면에 국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물을 도포하는 것이다.

면도, 탈모제를 도포하거나, 화학적인 탈모 및 이의 복합적인 방법을 포함하는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 휴지기 모포로부터 모 생장을 유도시킬 수 있다.

피부에 국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물을 도포하는 시간 및 피부에 이와 같은 조성물을 잔류시키는 시간은 당업자가 별도의 실험없이도 다양하게 변화시킬 수 있으며, 국소 활성 조성물은 휴지기 상태부터 모 생장 유도후에 바로 또는 동시에 국소 활성 조성물을 피부에 도포하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 "바로"라는 의미는 약 1시간 범위내를 의미한다. 더욱 바람직하게는, 국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물은 모 생장 유도와 동시에 또는 직후에 도포하여, 모 생장을 지연시키는데 충분한 시간동안 피부에 잔류시키고, 이때 잔류시간은 적어도 약 5분정도가 되고, 도포후 적어도 약 15분간은 잔류시키는 것이 더욱 바람직하다.

국소 활성 약제학적 또는 화장용 조성물은 포유류 모 생장 및 모 착색의 변화에 영향을 주기에　유효한　양을 사용하여야 한다. 본원에서 사용된 "유효한 양"이란 의미는 모 생장 및 착색이 지연되기를 원하는 부위의 피부 표면에 도포할 수 있는 충분한 양을 말한다. 바람직하게는 조성물은 피부 표면 ㎠당 국소 활성 물질 약 2㎕/㎠ 내지 약 8㎕/㎠정도의 양으로 모 생장 및 착색이 지연되기를 원하는 부위에 도포한다.

세린 프로테아제와 같은 국소 활성물질을 모 생장 유도 시간동안에 동물의 피부에 국소적으로 도포할 경우에 모 생장 및 착색이 적어도 약 9일간 지연된다는 기대이상의 발견을 하였다. 또한, 사람에서 모 생장 사이클이 마우스의 경우보다는 느리기 때문에 사람에서 모 생장이 지연되는 것은 9일 이상될 것으로 보인다.

본원에서　적절히 설명되는 본 발명은 임의 성분, 활성물질이 없이도 실행될 수 있고 또는 본원에서　설명　안된 단계에 의해 실행될 수 있다. 다음에는 본 발명의 특징 및 이를 실행하는 방법을 추가로 설명하기 위해 몇 가지 실시예를 제공한다. 그러나, 본 발명을 이에 한정시키고자 함은 아니다.

실시예 1 : 마우스　시스템에서 시험 물질의 탈모

주령이 6-10주인 Charles River(Kingston, NY)에서 구한 12마리 암컷 C57BL/6 마우스의 모는 생장 사이클중 휴지기에 있는데, 문헌[Stenn, et al., "Glucocorticoid Effect on Hair Growth Initiation: A Reconsideration," 6 Skin Pharmacol., 125-134 (1993)]에서 제시한 과정에 따라 각 동물의 등에 있는 털을 뽑아서 모 생장을 유도하였다. 마우스에서 공지된 것과 같이, 탈모하는 시기에 모든 모포에는 모발 생장기(anagen)가 동시에 시작된다.

다음의 표 1에서 설명한 바와 같이 유도 부위에서 다음과 같은 사항을 볼 수 있다.

유도 부위에서의 관찰 결과

유도후 날짜	유도부위에서 형태학적 및 조직학적 관찰
1-2일(모발생장기 초기)	새로운 포낭이 생장하기 시작함
3-4일	모 포낭이 충분히 발생되었으나, 모 경(莖)은 아직 보이지 않음
8일(모발생장기 후기)	각 마우스는 매우 짙은 피부를 가지고, 이들의 모경은 조직학적으로 볼 수 있음
11-12일	모경이 상피를 통하여 뚫고 나오기 시작함
14일	각 마우스는 짧은 모 덮히기됨
19일	조직상으로 포낭의 퇴보(경감기;catagen)가 나타남
21-25일	모 포낭이 휴지기상태로 되돌아감

표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 모 생장은 동물의 핑크색 피부가 짙어지기 시작하는 탈모후 몇 일안에 볼 수 있다. 이는 C57BL/6 마우스는 상피가 아닌 모 포낭에만 흑혈구세포를 포함하여, 모 착색으로 인한 것이다.

카터-월리스(Carter-Wallace)사에서 시판하는 "Nair" 상표의 화학 탈모제를 각 마우스 등에 충분히 젖을 정도의 양으로 도포하여 모를 제거함으로써 12마리 C57BL/6 마우스의 휴지기(telogen)로부터 모 생장을 유도하였다. 화학 탈모제를 이용할 경우에, 포낭의 하부는 고유 상태로 남아있고, 기존 과정의 모 경(莖) 하부도 새로 자란 모가 자라나올때까지 진피에 고유상태로 유지된다. 신규한 모 사이클의 생장 패턴은 표 1에 기술된 것과 동일하다.

뮤린의 모 생장 사이클은 균주마다 그리고 각 동물간에도 다양하게 변화될 수 있기 때문에, 각 마우스에서 피부 샘플 2㎝ X 1㎝를 잘라내어, 스티븐 사이언티픽(Stephen Scientific)사에서 시판하는 10% 포르말린 완충 용액(25℃에서 pH는 6.9-7.1)으로 고정시키고, 그 다음 공지의 과정에 따라 파라핀 블록으로 만든다. 블록은 잘게 자르고, H&E 착색하고, 조직학적으로 검사하여, 공지의 과정을 이용한 모발 생장 사이클의 상태를 검증한다. 이 실시예에서 얻은 조직학적 자료는 도 3A에 나타내었다.

본 실시예에서는 C57BL/6 마우스의 모 생장 사이클은 평균 약 25일이고, 탈모에 이용된 방법에 관계없이 모 포낭과 모 경의 발생 시기가 유사한 것으로 나타났다.

실시예 2 : 국소 활성 조성물의 제조

시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation)사의 냉동건조된 트립신 충분한 양을 0.05M N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄 설폰산(라이프 테크놀로지사의 "Hepes") 완충 용액에 혼합하고, 생성 용액의 pH는 약 7.4가 되고, 용액에서 트립신의 농도는 약 2%(w/v)이다. 생성된 트립신 용액을 물 부형제 중 (5%) 글리세롤 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르 리포좀(이는 Niemiec에서 설명한 방법에 따라 제조함)과 혼합하여(1:1 용적비), 생성된 국소 활성 조성물에 트립신 농도가 1%(w/v)이 되도록 한다.

실시예 3 : 모 포낭으로 트립신 운반

찰스 리버(Charles River(Kingston, NY))사에서 구한 주령이 7 내지 8주된 4마리 C57BL/6 암컷 마우스의 피부 표면(6㎝×2㎝)에 모를 뽑은 12일 후에 실시예 2의 국소 활성 조성물 약 100㎕(마우스 한 마리당)을 제공한다. 본 실시예에서 이용된 트립신은 몰리큘러 프로브즈 인코포레이티드(Molecular Probes Inc.)사의 FluoReporter 단백질 표지 키트에서 이에 첨부된 프로토콜에 따라 몰리큘러 프로브즈사에서 시판하는 플로레신 이소티오시아네이트(FITC) 형광 표지를 이용하여 형광-표지한다.

플로레신 트립신 처리후 1 및 4시간후에, 각 마우스의 피부 표면 2㎝×1㎝ 샘플을 분리하여, 파라핀 블록으로 만들고, 이를 잘게 잘라 실시예 1에서 제시한 과정에 따라 조직학적으로 검사를 한다.

도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 대부분의 형광 표지가 모 포낭에서 발견되었다. 마우스는 1시간 간격(도 1c)과 4시간 간격(도 1a)으로 검사를 하였는데, 동일한 조직학적 착색 패턴을 나타내었고, 이때 나중에 추가로 피부를 뚫고 나오는 것은 없었다. 이와 같은 관찰 결과는 프로테아제에 의한 비-특이적인 세포외 매트릭스 절단 가능성에 대해 반하는 것으로 나중에 각질층에서 형광 착색 침투가 더 많은 것으로 나타났다.

본 실시예에서는 4마리 C57BL/6 암컷 마우스(주령이 7 내지 8주됨)에서 반복하였으나, 단 마우스는 실시예 1의 1%(w/v) 트립신 처리 유도후에 12일간 매일 처리를 받았다는 것이 다른 점이다. 유도 12일 후에 형광-트립신 처리후 4시간뒤에 마우스 피부는 유사한 조직학적 방법을 이용하여 분석을 하였다. 도 1b에서 설명하는 것과 같이, 처리된 피부의 모 포낭으로 트립신의 운반 경로에 큰 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, 트립신-처리를 한 피부의 각질층 바깥부분에서 약간의 착색이 나타났는데 이는 장벽 일체성에 약간의 손실이 있음을 나타낸다.

본 실시예에서는 모발 생장기 동물의 피부 표면에 트립신을 포함하는 국소 활성 조성물을 제공하면, 단시간 및 장시간 동안 모 포낭으로 트립신이 주로 운반된다는 결론을 보여준다.

실시예 4 : 트립신은 모 생장 및 모 착색을 지연시킨다.

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후에 바로 12마리 C57BL/6 암컷 마우스(주령이 7 내지 8주)에게 실시예 2에 따라 제조된 국소 활성 조성물을 1회 국소 도포하였다.

도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 모 생장 유도후에 1회 트립신을 제공함으로써 모 생장 및 착색이 지연되었다. 짙은 피부색은 모 발생 과정이 더 진행되었음을 나타내는데 즉, 이 과정은 모 경이 보이기전을 말한다. 처리를 하지 않은 그리고 리포좀(부형제)-처리된 대조군 마우스에서는 모 생장 유도후 7-8일에 피부가 짙게 되고(도 2a: 죄측은 처리를 한 것이고, 우측은 처리를 하지 않은 것이다); 이들의 모 경은 11-13일에 볼 수 있다(도 2b에서 좌측은 처리를 하지 않은 것이고; 중간 것은 부형제 처리를 한 것이고; 우측은 트립신 처리를 한 것이다). 대조적으로, 트립신-처리된 동물은 8일까지 피부색이 핑크로 유지되고(도 2a: 좌측 마우스), 11일째에 약간 짙어지는 것을 볼 수 있고(도 2b에서 우측 마우스); 14일에는 회색 피부로 된다(도 2c에서 우측 마우스). 트립신-처리된 동물의 모 경은 15일 내지 17일째에 처음 볼 수 있지만, 이와 같은 모 경은 그 기능이 감소되고 대조군과 같이 두꺼워지지는 않았으나 약 4 내지 7일내에 이들 모 경은 길이를 제외한 모든 특징에 있어서 대조군 마우스의 것과 구별이 되지 않는다.

본 실시예에서는 트립신이 모 생장 및 모 착색을 지연시키는데 효과가 있다는 것을 보여준다.

실시예 5 : 트립신 처리된 모 포낭의 조직학

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 3마리 C57BL/6 암컷 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 제조된 단일 국소 활성 조성물을 도포한다.

처리 안된 마우스, 부형제-처리된 마우스(나타내지 않음), 트립신-처리된 마우스의 피부 샘플 1㎝×2㎝을 구하여, H&E 착색을 하고, 실시예 1에 제시된 과정을 통하여 조직을 검사한다. 도 3에서 설명하는 것과 같이, 착색된 샘플의 조직 분석에서는 트립신-처리된 마우스의 모 포낭 발생이 상당히 지연된다는 것을 증명한다. 좀더 구체적으로는 처리 안된 대조군 마우스 및 부형제 처리된 대조군 마우스에서 관찰되는 특징적인 층 구조, 연장된 포낭 유두 및 새로운 모 착색 등의 특징이 몇일후에 관찰된다. 또한, 트립신-처리된 마우스의 포낭은 팽창된 누두(infundibulum)를 나타내는데(도 3B(a-e)에서 가장 잘 나타냄), 이는 처리된 마우스 및 부형제 처리된 마우스(도 3A(a-b))에서는 나타나지 않는다. 이와 같은 것은 트립신을 포함하는 조성물로 처리하면 질이 떨어진(가령, 얇고, 성긴) 모발이 생장된다는 것을 뒷받침한다. 트립신으로 처리후 7-8일경에, 일부 처리된 포낭의 하부에서는 도 3B(d-e)에서 설명하는 것과 같이 상피 층 구조를 형성하기 시작하나 상부층에서는 비어있는 구조를 나타낸다(도 3B(d)에서 가장 잘 보임). 트립신으로 처리 11-12일 후의 경우, 처리된 포낭의 대부분이 성숙되나 여전히 모 착색이 감소되고, 경의 길이가 짧은 것을 알 수 있는데 이는 유도후 4-5일경에 나타나는 처리 안된 포낭의 특징과 유사하다(도 3A(d) 내지 3B(f)에서 비교).

본 실시예에서는 조직 분석을 통하여 모 생장이 유도된 마우스의 피부에 트립신을 국소적으로 사용하였을 경우에 모 생장 및 모 착색이 상당이 지연된다는 것을 보여준다.

실시예 6 : 포낭 유두에서 트립신은 아포프토시스를 유도한다.

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 3마리 C57BL/6 암컷 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 준비된 단일 국소 활성 조성물을 제공한다.

처리 안된 마우스, 트립신-처리된 마우스의 피부 샘플 1㎝×2㎝을 실시예 1에서 제시한 과정에 따라 수득하고, TdT-매개된 dUTP-바이오틴 니크 말단 표지("TUNEL")[Gavrieli et al., "Identification of Programmed Cell Death in situ Via Specific Labelling of Nuclear DNA Fragmentation", 119 Jl. Cell Biology 493-501 (1992)("Gavrieli")에서 설명된 것] 과정에 따라 분석한다. 이 과정동안에 준비한 피부 파라핀은 온코, 인코포레이티드(Oncor, Inc.)사의 "ApopTag^TMPlus InSitu Apoptosis Detection Kit"를 이용하여 착색하며, 이과정은 온코, 인코포레이티드사의 "ApopTag^TMPlus InSitu Apoptosis Detection Kit" 프로토콜(Feb. 1995)에 명시되었는데, 이는 Gavrieli에서 설명하는 분절된 DNA 표지에 기초한다. 도 4에서는 조직 분석을 나타낸 것으로 착색은 과산화효소 말단부(갈색)과 메틸 그린 카운터-착색을 가진다.

유사하게, TUNEL 착색에 이용할 수 있는 파라핀 부분은 처리 안된 마우스에서 준비한다. 이들 부분을 착색하고, 조직적으로 분석하여 그 결과는 도 4A(a-c)에 나타내었다.

도 4에서 설명하는 것과 같이, TUNEL-착색된 샘플은 형태학적으로(응축된 또는 분절된 핵 및 세포질 또는 아포프토시스성 몸체) 및 이의 착색 색깔(응축된 핵내에 분절된 DNA는 갈색으로 착색됨)로 아포프토시스성 세포임을 알 수 있다. 좀 더 구체적으로는 도 4B(a-e)에서는 모 생장을 유도한 첫 째주에 처리된 포낭 유두내에서 아포프토시스성 몸체를 감지하였다는 것을 설명한다. 그러나, 트립신으로 처리한 포낭, 상피 또는 진피의 다른 부분에는 영향이 없었다. 대조적으로, 도 4A(a-c)에서 TUNEL-착색된 처리 안된 샘플에서 설명하는 것과 같이 처리 안된 초기 모 생장기 포낭에서는 최저 수준의 아포프토시스가 감지되나; 포낭의 협부 및 포낭 유두 윗부분에서는 항상 아포프토시스가 있다. 처리 안된 포낭의 대부분에서는 어떠한 세포 죽음도 나타나지 않았다.

본 실시예에서는 탈모된 피부에 트립신을 제공하면, 처리 안된 또는 부형제 처리된 대조군에 비교하여 트립신 처리된 포낭의 유두내에 아포프토시스 수를 증가시킨다.

실시예 7 : 트립신은 모 생장 과정동안에 유전자 발현상에 변화를 유도한다.

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 6마리 C57BL/6 암컷 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 준비된 단일 국소 활성 조성물을 도포한다.

도 5에서 제시한 시간 간격에서, 실시예 1의 과정에 따라 처리 안된 마우스와 처리된 마우스의 피부를 얻고, Tel-Test "B"에서 이용할 수 있는 "RNA Stat-60" 시약을 이용하여 총 RNA를 추출한다[이 과정은 Chomczymski, "Single Step Method of RNA Isolation By Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction," 162 Anal. Biochem. 156-59(1987)에서 설명을 하고 있다]. "RQ1 RNase-free DNase" 상표로 시판되는 프로메가 코포레이션(Promega, Corporation)(May, 1995)에서 공급하는 "RNase-free DNase" 충분한 양의 RNase-비함유 DNase를 각 마우스에서 얻은 추출된 RNA에 첨가하고, 이때 각 생성물에는 프로토콜에서 제시한 과정을 이용하여 200ng DNased-RNA를 포함한다. 생성된 200ng DNased-RNA는 깁코-비알엘(Gibco-BRL)(현 라이프 테크놀로지즈 인코포레이티드사) (April 1992)에 의해 공고된 "Superscript II Reverse Transcriptase" 프로토콜에서 제시한 과정을 통하여 무작위 핵사머를 이용하여 역전사("RT")시키는데, 이와 같은 무작위 헥사머는 라이프 테크놀로지즈 인코포레이티드사에서 시판하는 것을 이용할 수 있다.

그 다음 생성된 RT 생성물은 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")을 이용하여 증폭시키는데, 이때 퍼킨-엘머-세투스 코포레이션(Perkin-Elmer-Cetus Corporation)사의 "Taq polymerase" 상표로 시판되는 열에 안정한 DNA 폴리머라제 0.5유니트(100㎕ 반응당)와 클론텍 라보라토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.)("Clontech")사에서 이용할 수 있는 유전자-특이적인 프라이머 약 0.1μmol(반응당)을 이용하고 또는 마우스 글리세르알데히드-3-포스페이트-디하이드로게나제(G3PDH)용 클론텍의 프라이머에 수반되는 프로토콜에 제시된 과정에 따라 표 2에서 제시한 것으로 실시한다.

표 2에서는 사용된 DNA 프라이머, PCR 반응에 필요한 MgCl₂의 양, PCR 사이클의 길이 등을 설명한다.

RT-PCR 검사에서 이용되는 DNA 프라이머

프라이머(첨부된 서열 리스트 참고)	Mg2Cl의양(mM)	사이클(분)@ ℃	사이클 수	서열번호
트랜스글루타미나제센스AACCCCAAGT TCCTGAAG	2.5	1@94;2@55;3@72	35	1
트랜스글루타미나제안티센스TTTGTGCTGG GCCACTTC	2.5	1@94;2@45;3@72	35	2
티로시나제 센스TCAGCCCAGCATCCTTCTTC	5	1@94;2@45;3@72	35	3
티로시나제 안티센스CAGCCATTGTTCAAAAATAC TGTCC	5	1@94;2@55;3@72	35	4
프로피오멜라노코르틴(POMC)센스AAAAGAAGAGAGAAGAGAGA C	2.5	1@94;2@55;3@72	35	5
POMC 안티센스AGAGCTGAGACACCCTTACC	2.5	1@94;2@55;3@72	35	6
콜라게나제 센스AAGACCCCAACCCTAAGCAC	2.5	1@94;2@53;3@72	35	7
콜라게나제 안티센스CAGCACTGACGCTTTTCACC	2.5	1@94;2@53;3@72	35	8

그 다음 PCR 생성물은 2% 아가로즈/에티디움 브로마이드 겔에서 분석을 하고, 당분야에 공지된 방법에 따라 분석하여, 트립신-처리된 마우스와 처리 안된 마우스 모두에서 모 생성과정동안에 특정 유전자의 발현 수준을 비교한다. 더 잘 보기 위해서는, 생성된 PCR 생성물은 공지의 방법에 따라 에탄올로 침전시킨다. G3PDH의 프라이머를 이용할 경우, PCR 생성물의 10%만을 이용한다. 역전사되지 않은 주령이 7 내지 8주된 암컷 C57BL/6 마우스의 피부에서 얻은 RNA 샘플을 각 PCR 증폭의 네가티브 대조군으로 이용한다. 포지티브 대조군을 이용할 수 없는 경우에, 동시성을 갖지 않은 모 과정을 가지는 6개월령의 암컷 C57BL/6 마우스의 피부에서 취한 RNA 샘플을 포지티브 대조군으로 이용한다. 겔상에 RT-PCR 생성물의 이동은 포지티브 대조군 것과 항상 동일하고, 보고된 증폭된 엠플리머 크기와 동일하다.

각 RT-PCR 반응 생성물의 상대적인 양은 각 생성물에서 G3PDH의 mRNA 수준, "housekeeping" 유전자를 분석하여 비교한다. 도 5에서 설명을 하는 것과 같이, G3PDH 유전자 발현은 검사한 모든 시점에서 유사한 것으로 발견되었고, 따라서 원하는 유전자의 상대적인 유전자 발현을 비교할 수 있다.

포낭 발생이 지연되는 것이 비-특이적인 자극 또는 염증 반응때문이 아니라는 것을 증명하기 위해, 우리는 이와 같은 상황동안에 일반적으로 상향 조절되는 유전자의 mRNA의 수준을 분석하였다. RT-PCR 생성물에서 유전자의 mRNA 수준을 비교한 후에, 우리는 IL-6, IL-10, GM-CSF의 mRNA 수준에 변화가 없고, TNFα의 약간의 상향 조절, TNFβ와 TNF-RI의 약간의 하향 조절 및 대식세포 유도성 단백질(MIP)의 중간정도의 하향 조절외에 변화가 없었다(표 3에서 설명).

유전자 발현 패턴

유전자	처리안됨	트립신-처리됨
IL-6	-	-
IL-10	+/-	+/-
GM-CSF	-	-
TNFα	+/-	+
TNFβ	+	+/-
TNF-RI	+/-	+/--
TNF-RII	-	-
MIP	+	-
IL-1α	+	++
IL-1β	+/-	+++
IL-1R	-	-
IFNγ	-	+++
c-myc	+	-
c-myb	++	+
c-fos	+	+/-
c-jun	+/-	+
콜라게나제	+	+/-
티로시나제	+++	+/-
POMC	+	+/-
트랜스글루타미나제	+	+
주의; RT-PCR은 반-정량성이다. 상이한 모 생성 과정내에 각 증폭된 서열에 대해서만 비교가 가능하고, 다른 유전자간에는 비교가 무의미하다. -; 발현이 감지되지 않음, + 강한 밴드, +/-- 매우 약한 밴드, ++ 더 강한 밴드, +/- 약한 밴드,+++ 매우 강한 밴드

표 3에서 유전자 발현 특성은 염증 반응 또는 피부 자극에 대한 반응에 반하는 것이다.

배양물에서 모 생장을 방해하는 유전자의 IL-1α mRNA 수준(도. 5b & 표 3)에서는 중간정도의 상향조절이 관찰되었다. 상피 장벽 기능의 손실로 인하여 1L-1α유도되기 때문에, 우리는 상피를 통한 수분 손실(TEWL)을 측정하여 장벽 일체성을 분석하였다. TEWL은 Servomed AB에서 구한 "Evaporimeter EPI" 증발계를 이용하여 측정하는데, 우선 증발계에 대기 습도를 표준화시키고, 테스트 개체의 복부 피부에 프로브를 위치시켜 측정을 한다. 결과에서 표 4에서 나타낸 트립신 농도와 상관관계가 없는 TEWL에서만 중간정도의 증가가 있는 것으로 나타났다.

트립신 처리된 피부에서 TEWL

처리 종류	샘플 크기	TEWL
처리안됨	6	27.01 ± 3.8
0.01% 트립신	4	36.89 ± 4.6
0.1% 트립신	4	43.2 ± 5.2
0.5% 트립신	4	34.53 ± 4.9
1% 트립신	4	37.5 ± 3.9
1% 트립신-비활성(약함)	3	33.99 ± 6.2

따라서, 표 3과 도 5에서 설명을 하고 있는 RT-PCR 생성물에서 IL-1α의 상향조절은 모 생장의 방해와 연관이 있다.

도 5a-b와 표 3에서 설명을 하는 것과 같이, 1L-1β와 IFNγ의 mRNA에서 상당한 증가가 있었고, 이는 원형 탈모증에서 상향조절되고, 모 생장 저해와 연합된 것으로 공지되어 있다. 이는 트립신에 의해 상향조절되는 염증-관련된 유전자만이 모 생장의 저해와 연관된다는 것을 제시하는 것이다.

표 3에서 설명하는 것과 같이, c-myb, c-myc, c-fos의 mRNA에서 약간의 감소가 있었고, c-jun에서는 지연 과정동안에 약간 증가된 것을 알 수 있다. AP-1 반응 인자를 통하여 조절되는 유전자인 콜라게나제 역시 약간 감소되었다. 이와 같이 몇 가지 유전자의 mRNA 수준에서 일반적인 약간의 감소는 트립신-처리된 피부에서 모 생장을 전반적으로 감소시켰다는 것을 반영하는 것이다.

도 5A와 표 3에서 설명하는 것과 같이, 모 착색에 주요 효소인 티로시나제도 모 생장 지연기간동안에 하향조절되고, 이의 mRNA 수준은 포낭이 이와같은 지연을 극복할 때 증가된다. 멜라노겐 펩티드 흑혈구 자극 호르몬(MSH)의 전구물질인, POMC는 도 5A와 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 지연 기간동안에 중간정도로 하향조절된다. 이와 같은 두 가지 유전자의 하향 조절은 트립신이 모 착색의 조절에 영향을 준다는 것을 나타낸다.

본 실시예에서는 지연 기간동안에 일련의 유전자 발현을 검사하여 모 발생 과정의 트립신 혼란을 알 수 있다는 것을 보여준다. 모 생장 기간에서 mRNA의 수준에 트립신-유도된 변화가 분명히 나타나는데 이는 모 생장 및 착색에 트립신이 조절 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 본 실시예에서는 모 생장 및 모 착색 유전자에 트립신이 국소적으로 특정하게 작용한다는 것을 반영한다.

실시예 8 : 모 생장에 영향을 주는 다른 세린 프로테아제

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 암컷 C57BL/6 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 제조된 단일 국소 활성 조성물을 제공한다.

실시예 3의 과정을 반복하나 트립신 대신에 카복시펩티다제-Y, 프로테아제 IV, 서브틸리신으로 대체하여 사용한다.

처리 8일 후에, 각 마우스의 피부는 Minolta Chromameter Model CR300 색측정계를 이용하여 검사하여, 이들 각 피부색을 비교한다.

아르기닌 및 리신의 C-측면에서 단백질을 절단하는 엔도펩티다제 족의 일원인 트립신이 모 생장을 가장 길게 지연시킨다는 것을 관찰하였다. 대조적으로 단백질의 C-말단에 있는 L-아미노산을 가수분해하는 카르복시펩티다제-Y와 중성 pH에서 펩티드 결합의 56%를 절단하는 비-특이적인 엔도펩티다제 족의 일원인 프로테아제 IV는 최소한의 지연 효과만을 가지고, 알칼리 pH에서 펩티드 결합을 절단하는 비-특이적인 펩티다제의 일원인 서브틸리신은 모 생장 속도를 상당히 지연시킨다. 본 실시예의 결과는 표 5에서 설명한다.

세린 프로테아제 처리된 피부의 색깔 측정

처리 종류	샘플 크기	L*
처리 안됨	6	49 ± 0.30
1% 트립신	6	56.1 ± 0.81
1% 서브틸리신	4	42.9 ± 2.87
1% 엔도펩티다제	4	51.8 ± 0.11
1% 카르복시펩티다제-Y	4	51.9 ± 0.47
L* 크기(0=검은색, 100=흰색)는 피부 표면에서 보았을 경우 모 착색을 측정한 것이다.

표 5에서 설명하는 것과 같이, 트립신-처리된 모 포낭은 최소한으로 발생되고 따라서, 피부에 가장 밝은 색을 부여하는 것으로 나타났다. 본 실시예에서는 피부색이 모 포낭의 모 발생과 연관이 있다는 것을 나타낸다.

트립신-처리된 피부에서 얻은 결과에서는 모 생장 및 모 착색을 지연하는데 트립신이 상대적으로 우수하다는 것을 나타내기 때문에, 본 실시예에서는 모 생장 및 모 착색에서 트립신의 효과가 비-특이적인 단백질 분해성 절단 결과에 한정하지 않으며 이는 프로그램된 세포 죽음 경로를 활성화시키는 트립신에 의해 유도되는 특이 활성의 결과인 것으로 보인다.

실시예 9 : 모 생장 유도의 초기 단계에서 트립신의 영향

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 3마리 암컷 C57BL/6 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 제조된 단일 국소 활성 조성물을 도포한다. 이 과정은 9마리 추가 마우스에서 반복하나, 처리는 각각 주당 2회, 3회 또는 7회를 한 것이 다른 점이다.

8일간 마우스의 피부색을 관찰한 후에, 처리된 마우스의 피부는 처리 안된 대조군 마우스의 피부색보다 밝다는 것을 알았다. 이는 트립신-처리된 모 포낭이 가장 적게 발생되고, 따라서, 피부에 가장 밝은 색을 부여한다는 것을 나타내는 것이다.

각 처리된 마우스의 피부 1㎝×2㎝ 샘플을 얻고, H&E 착색을 하고, 실시예 1에서 제시한 과정에 따라 조직학적으로 검사를 한다. 착색된 샘플의 조직학적 분석에서 트립신으로 동물을 추가로 매일 처리하는 경우에 모 생장이 지연되는 것을 연장하지는 못한다는 것을 나타낸다. 이로써 세린 프로테아제에 의한 세포 죽음 유도는 특이적인 그리고 시간에 따른 일련의 과정으로 인한 것임을 나타낸다.

이와 같은 특정 사건의 타이밍을 결정하기 위해서, 실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 암컷 C57BL/6 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 준비된 단일 국소 활성 조성물을 제공하는데, 단 표 6에서 제시하는 것과 같이 다양한 시간대별로 처리를 하였다.

표 6에서 설명을 하는 것과 같이, 실시예 8에 따는 방법으로 수득한 피부 색깔에서는 모 생장을 유도한 시간과 트립신을 제공한 시간사이에 시간을 늘리면 피부색이 짙어지는 것(색소는 더 많고, 지연은 더 짧고)과 관련이 있다는 것을 설명한다. 모 생장 유도후에 바로 처리된 마우스의 경우에 모 생장 및 모 착색이 가장 길게 지연되는 것으로 나타났다. 탈모후 6시간 이상 처리된 마우스에서는 모 생장이 지연되지 않았고, 이는 처리 안된 대조군과도 구별되지 않았다.

트립신 처리된 피부의 색깔 측정^**

처리 종류	샘플 크기	L*
처리안됨	6	49 ± 0.32
바로 1% 트립신으로 처리	6	56.1 ± 1.54
2시간 후에 1% 트립신으로 처리	4	54.4 ± 1.30
4시간 후에 1% 트립신으로 처리	4	53.3 ± 1.23
6시간 후에 1% 트립신으로 처리	4	48.0 ± 2.01
18시간 후에 1% 트립신으로 처리	4	49.2 ± 1.07
48시간 후에 1% 트립신으로 처리	4	50.4 ± 1.01
**피부 샘플은 탈모 8시간 후에 테스트하였다.

본 실시예에서는 피부에 트립신을 제공한 후에 모 생장 및 모 착색을 지연시키는 효과를 나타내는데, 약 4시간 이내에 제공하였을 경우에 그리고 모 생장을 유도한 직후에 효과가 있었다.

실시예 10 : 트립신 효과는 수용체-매개된 경로와 연관이 있을 수 있다.

실시예 3에서 제시한 방법에 따라 모 생장 유도후 암컷 C57BL/6 마우스(주령이 7 내지 8주)의 피부 표면에 실시예 2에 따라 제조된 단일 국소 활성 조성물을 도포하는데, 단 트립신의 농도는 1%(w/v) 내지 0.01%(w/v)(4×10^-4M - 4×10^-6M)로 다양하게 한 것이 다르다. 탈모후 9일경에, 실시예 9에서 제시한 과정을 통하여 색을 분석한다.

표 7에서 설명하는 것과 같이, 색분석 결과에서 트립신 농도를 감소시키면 밝기가 증가되고(L*에서 더 밝고, 색소가 더 적음), 모 생성 과정이 지연되는 것과 연관이 있는 것으로 나타났다.

트립신 처리된 피부에서 피부 밝기^**

처리 종류	샘플 크기	L*
처리안됨	6	45 ± 0.97
0.01% 트립신	4	48.6 ± 1.01
0.1% 트립신	4	49.5 ± 1.07
0.5% 트립신	4	47.7 ± 0.3
1% 트립신	4	47.9 ± 0.08
1% 트립신-비활성(약간)	3	52.2 ± 0.17
L* 크기; 0=검은색, 100=흰색**샘플은 탈모후 9일에 분석하였다.

본 실시예에서는 높은 투여량에서 탈감을 포함한 수용체-매개된 메카니즘이 있다는 것을 제시한다.

실시예 11 : 트립신의 단백질분해 활성이 모 생장을 지연시키는데 불필요하다.

실시예 2의 조성물을 48시간동안 배양한 후에, 이의 단백질분해 활성은 제조원 (PanVera, Corporation)으로부터 수득할 수 있는 세린 프로테아제 활성을 통하여 분석을 하고, 이는 제조물에는 감지 가능한 단백질분해 활성이 없다는 것을 나타낸다. 비활성 조성물을 실시예 10에서 제시한 방법에 따라 모 생장을 유도한 후에 주령이 7 내지 8주된 C57BL/6 암컷 마우스의 피부 표면에 도포한다. 탈모후 9일경에, 실시예 8에서 제시한 과정에 따라 색을 분석한다. 표 7에서 설명하는 것과 같이, 트립신의 단백질분해 활성 결핍이 모 생장을 지연하는데 있어서 이러한 제조물의 활성을 감소시키지 않는다는 것을 증명한다.

배양된 트립신은 100℃에서 10분간 가열한 트립신으로 대체하여 본 실시예를 반복한다. 그 결과에서 단백질 분해활성이 없는 가열한 트립신을 이용하면 모 생장에 지연 효과가 없다는 것을 알 수 있다. 트립신의 3차 구조를 변성시키는 가열을 함으로써 트립신의 단백질 분해 활성이 아닌 트립신의 3차 구조가 모 생성 과정에 기여함을 나타낸다. 트립신이 생존 신호을 차단하거나 또는 이 과정을 유도하기 위한 세포 수용체를 활성화하는 것과 관계없이, 본 실시예는 트립신 분자의 모양이 프로그램된 세포 죽음 및 포낭 유두에 있는 아포프토시스의 유도에 역할을 하는 것을 제시한다.

실시예 12 : 트립신을 함유하는 조성물의 용도

Niemiec가 제시한 과정에 따라 글리세롤 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시-10-스테아릴 에테르 리포좀을 제조하는데, 이때 리포좀의 구성 화합물은 각 비율이 약 58:15:27이 된다.

생성된 리포좀을 약 40℃로 냉각시키고, 리포좀은 세픽 인코포레이티드(Seppic, Inc.)의 상표 "SEPIGEL 305"인 폴리아크릴아미드와 C13-C14 이소파라핀 및 라우레스-7로 구성된 점증제에 정상적으로 혼합을 하는데, 이때 최종 조성물에서 점증제의 양은 약 1-3%(w/v)가 된다.

그 다음 충분한 양의 트립신을 첨가하여, 1% 트립신(w/v) 조성물을 만든다. 이와 같은 조성물은 즉시 국소적으로 이용을 할 수 있다.

수득된 생성물에는 효과적인 면도 겔의 성질 및 특징을 가진다.

Claims (49)

1. 휴지기(telogen) 모의 생장을 유도할 수 있는 충분한 시간동안 프로테아제를 포함하는 국소 활성 조성물 유효량을 포유류의 피부에 국소적으로 도포함을 포함하는, 포유류 모 생장 및 모 착색 변화에 영향을 주는 방법.
2. 제1항에 있어서, 프로테아제가 세린 프로테아제인 방법.
3. 제2항에 있어서, 프로테아제가 트립신, 카복시펩티다아제-Y, 프로테아제 IV, 서브틸리신 또는 이들의 혼합물중에서 선택되는 방법.
4. 제3항에 있어서, 프로테아제가 트립신인 방법.
5. 제4항에 있어서, 프로테아제가 국소 활성 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0%(w/v) 내지 5%(w/v)의 양으로 존재하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 프로테아제가 국소 활성 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0.01%(w/v) 내지 약 1%(w/v)의 양으로 존재하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 이와 같은 변화 중의 하나가 모 생장 및 모 착색을 지연시키는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 국소 활성 조성물이 추가로 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 리포좀 또는 이의 혼합물인 방법.
10. 제9항에 있어서, 리포좀이 비-이온성인 방법.
11. 제10항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 디스테아레이트 또는 이들의 혼합물;

    (b) 콜레스테롤에서 발견되는 스테로이드 기본구조를 가지는 화합물 또는 이의 혼합물; 및

    (c) 탄소수 약 12 내지 약 18인 지방산 에테르 또는 이의 혼합물로 구성되는 방법.
12. 제10항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트;

    (b) 콜레스테롤; 및

    (c) 폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르로 구성되는 방법.
13. 제11항에 있어서, 리포좀의 각 성분이 약 53:10:22 내지 약 63:20:32의 비율로 존재하는 방법.
14. 제8항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 국소 활성 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0㎎/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 양으로 존재하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 휴지기 모의 모 생장 유도가 면도, 전기분해, 뽑기, 화학적 탈모 또는 이의 복합적인 방법에 의해 수행되는 방법.
16. 제1항에 있어서, 유도 시기가 휴지기 모 포낭의 모 생장 유도 직전, 직후 또는 동시인 방법.
17. 제16항에 있어서, 모 생장 유도와 동시 또는 직후인 방법.
18. 제1항에 있어서, 조성물이 계면활성제, 습윤제, 보습제, 컨디셔너, 방향제, 발색제 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 조성물이 면도용 크림, 면도용 겔, 면도용 파우더, 화학 탈모 크림, 및 모를 제거하기 용이하거나 모를 실제적으로 제거하거나 이들 둘의 조합이 목적인 다른 생성물의 형태인 방법.
20. 제1항에 있어서, 이와 같은 변화에 영향을 주기에 충분한 시간동안 피부에 조성물을 잔류시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 시간이 약 15분 이상인 방법.
22. 제1항에 있어서, 프로테아제를 N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2'-에탄설폰산, (하이드록시메틸)아미노메탄 또는 이들의 혼합물로 구성된 완충액과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
23. 트립신의 3차 구조의 제2 부분과 모양이 유사한 제1 부분을 가지는 국소 활성 물질을 포유류의 피부에 국소적으로 도포함으로써 제1 부분과 제2 부분이 수용체-매개된 신호 전달을 할 수 있도록 함을 포함하는, 포유류의 모포 유두내에서 프로그램된 세포 죽음 및 아포프토시스를 유도하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 물질이 트립신, 단백질분해활성이 없는 트립신 또는 이들의 배합물인 방법.
25. (a) 트립신의 3차 구조의 제2 부분과 모양이 유사한 제1 부분을 가지는 국소활성 물질(이때, 제1 부분과 제2 부분은 수용체-매개된 신호 전달을 할 수 있다); 및

    (b) 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 국소 활성 물질이 트립신, 단백질분해활성이 없는 트립신 또는 이들의 배합물인 조성물.
27. 제25항에 있어서, 국소 활성 물질이 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 양으로 존재하는 조성물.
28. 제25항에 있어서, 국소 활성 물질이 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0.01%(w/v) 내지 약 1%(w/v)의 양으로 존재하는 조성물.
29. 제25항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 리포좀인 조성물.
30. 제29항에 있어서, 리포좀이 비-이온성인 조성물.
31. 제30항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 디스테아레이트 또는 이들의 혼합물;

    (b) 콜레스테롤에서 발견되는 스테로이드 기본구조를 가지는 화합물 또는 이의 혼합물; 및

    (c) 탄소수 약 12 내지 약 18의 지방산 에테르 또는 이의 혼합물로 구성되는 조성물.
32. 제30항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트;

    (b) 콜레스테롤; 및

    (c) 폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르로 구성되는 조성물.
33. 제31항에 있어서, 리포좀의 각 성분이 약 53:10:22 내지 약 63:20:32의 비율로 존재하는 조성물.
34. 제25항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 국소 활성 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0㎎/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 양으로 존재하는 조성물.
35. 제25항에 있어서, 계면활성제, 습윤제, 보습제, 발포제, 화장용 보조제, 완충제, 보존제, 산화 방지제, 컨디셔너, 방향제, 발색제 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 조성물.
36. 제35항에 있어서, 면도용 크림, 면도용 겔, 면도용 파우더, 화학 탈모 크림, 및 모를 제거하기 용이하거나 모를 실제적으로 제거하거나 이들 둘의 조합이 목적인 다른 생성물의 형태인 조성물.
37. (a) 모포 유두에서 아포프토시스를 유도할 수 있는 프로테아제를 포함하는 국소 활성 물질; 및

    (b) 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
38. 제37항에 있어서, 계면활성제, 습윤제, 보습제, 발포제, 화장용 보조제, 완충제, 보존제, 산화 방지제, 컨디셔너, 방향제, 발색제 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 성분을 추가로 포함하는 조성물.
39. 제37항에 있어서, 프로테아제가 세린 프로테아제인 조성물.
40. 제39항에 있어서, 프로테아제가 트립신, 카복시펩티다제-Y, 프로테아제 IV, 서브틸리신 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 조성물.
41. 제37항에 있어서, 국소 활성 물질이 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 양으로 존재하는 조성물.
42. 제37항에 있어서, 국소 활성 물질이 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.01%(w/v) 내지 약 1%(w/v)의 양으로 존재하는 조성물.
43. 제37항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 리포좀인 조성물.
44. 제43항에 있어서, 리포좀이 비-이온성인 조성물.
45. 제43항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 디스테아레이트 또는 이들의 혼합물;

    (b) 콜레스테롤에서 발견되는 스테로이드 기본구조를 가지는 화합물 또는 이의 혼합물; 및

    (c) 탄소수 약 12 내지 약 18의 지방산 에테르 또는 이의 혼합물로 구성되는 조성물.
46. 제43항에 있어서, 리포좀이

    (a) 글리세롤 디라우레이트;

    (b) 콜레스테롤; 및

    (c) 폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르로 구성되는 조성물.
47. 제45항에 있어서, 리포좀의 각 성분이 각 약 53:10:22 내지 약 63:20:32의 비율로 존재하는 조성물.
48. 제37항에 있어서, 약제학적 또는 화장용으로 허용되는 부형제가 조성물의 총 용적을 기준으로, 약 0㎎/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 양으로 존재하는 조성물.
49. 제37항에 있어서, 면도용 크림, 면도용 겔, 면도용 파우더, 화학 탈모 크림, 및 모를 제거하기 용이하거나 모를 실제적으로 제거하거나 이들 둘의 조합이 목적인 다른 생성물의 형태인 조성물.