DE102010015120B4

DE102010015120B4 - Verwendung eines proteasehaltigen Haarwuchsreduktionsmittels

Info

Publication number: DE102010015120B4
Application number: DE201010015120
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-04-17
Also published as: WO2011128029A3; WO2011128029A2; DE102010015120A1; EP2558054A2; RU2012148553A; DE102010015120A8

Abstract

Verwendung eines mindestens eine Protease ausgewählt aus Trypsin oder einer Mischung von Trypsin und Chymotrypsin beinhaltenden wasserhaltigen einkomponentigen Mittels, das proteasestabilisierende Kationen in Form von Calcium-Kationen beinhaltet, zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers, wobei das Mittel auf die zu behandelnden Hautpartien aufgebracht wird und dort einwirken gelassen und belassen oder entfernt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftragen auf die zu behandelnden Hautpartien nach vorheriger Enthaarung unter Entfernung der Haare mitsamt der Wurzel durchgeführt wird und die Protease oder die Proteasen in der einkomponentigen Zusammensetzung mit mindestens einem reduzierenden Zucker mindestens teilweise in Lösung bei 30 bis 90°C oder in Abwesenheit von Solventien bei 40 bis 95°C glykosyliert und/oder glykiert sind und das Mittel einen pH-Wert von 4,5 bis 7 aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines mindestens eine Protease beinhaltenden wasserhaltigen einkomponentigen Mittels zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers. Beschrieben werden entsprechende Mittel und Verfahren zu deren Herstellung.
Haare wachsen bei Menschen, aber auch Tieren, oft in Bereichen, an denen dies aus kosmetischen und/oder hygienischen Gründen unerwünscht ist, beispielsweise in den Achselhöhlen, an Fingern, der Handoberfläche, Armen, Beinen, dem Fußrücken oder in der Schamgegend oder auf Brust, Bauch und/oder Rücken und/oder im Gesichtsbereich. Daher sind eine ganze Reihe von Präparaten bekannt, durch chemische oder enzymatische Methoden direkt die Haare abzubauen. In neuerer Zeit kamen Methoden hinzu, das Wachstum von Haaren durch Beeinträchtigung direkt am Haarfollikel zu schwächen oder zu beseitigen und so für eine längerfristige Freiheit von Haaren in den behandelten Bereichen zu sorgen. Die DE 693 15 059 T2 beschreibt beispielsweise eine Kombination von Papain und Dithiothreitol, zusammen mit iontophoretischer Behandlung, um direkt die Fortpflanzungszellen des Haarfollikels zu beeinträchtigen. In der DE 697 21 329 T2 werden Proteasen, wie Trypsin, als Liposomenpräparat zum selben Zwecke beschrieben. In der DE 298 24 973 U1 werden Protease-Präparate mit Zitronensäure und Filmbildnern beschrieben, die Glycerin oder Propylenglykol enthalten können. Ein Problem bei Protease-Präparaten ist dabei stets eine Instabilität der entsprechenden Enzyme (zeitlich begrenzte Aktivität), die teils durch Autodigestion, teils durch andere Faktoren keine ausreichende Stabilität aufweisen. In der WO 2005/034892 A1 werden daher Zwei-Komponenten-Systeme beschrieben, bei denen eine erste Komponente das Enzym in Lösung mit 50 oder mehr % eines die Wasseraktivität vermindernden und somit die Protease stabilisierenden Mittels, wie Glycerin, Ethylenglykol, Sorbitol, Saline oder das nicht-reduzierende Disaccharid Saccharose beinhaltet, während eine andere Komponente, die bei der Anwendung mit der genannten ersten Komponente gemischt wird, in erster Linie Wasser beinhaltet, um bei der Anwendung die Aktivierung des in der ersten Komponente gehemmten Enzyms durch Verdünnung ermöglichen soll. Nachteilig ist hier, dass die zwei Komponenten gemischt werden müssen und so die Anwendung etwas umständlich ist. Andere Versuche zur Enzymstabilisierung, neben den bereits genannten Liposomen, beinhalten auch die Immobilisierung der Enzyme auf Polymeren, wie beispielsweise in der DE 103 12 259 A1 . FR 1 397 399 A und EP 0 968 707 A2 nennen keine die Haare beeinflussenden Mittel, sondern andere Kosmetika mit Proteasen. DE 1 940 105 A nennt ein Enthaarungsmittel mit direkt auf die Haare einwirkenden Proteasen, jedoch keine das Haarwachstum beeinflussenden Mittel. US 2004/0161483 A1 nennt thioglykolathaltige Mittel mit stark basischem pH-Wert, die auch Proteasen enthalten.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass es möglich ist, Präparate für kosmetische oder auch (beispielsweise im hygienischen Bereich oder vor Operationen, die eine Enthaarung erfordern) therapeutische Zwecke herzustellen, die nur eine Komponente beinhalten und ohne umständliche Systeme wie Liposomen, Wasseraktivitätsverminderung oder Immobilisierung der Enzyme auskommen und so einfache Anwendung bei guter Haltbarkeit ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt daher die Verwendung eines mindestens eine Protease beinhaltenden wasserhaltigen einkomponentigen Mittels gemäß Anspruch 1 zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers, das proteasestabilisierende Calcium-Kationen beinhaltet. Die mindestens eine Protease ist erfindungsgemäß mit einem reduzierenden Zucker mindestens teilsweise durch Glykosylierung und/oder Glykation weiter stabilisiert.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines in Anspruch 1 genannten wasserhaltigen einkomponentigen Mittels zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel auf die zu behandelnden Hautpartien aufgebracht wird und dort einwirken gelassen und gewünschtenfalls anschließend wieder entfernt werden kann, jedoch nicht muss.
Wo Angaben in Gew.-%/Gewichtsprozent) gemacht werden, beziehen sich diese immer auf die gesamte Zusammensetzung (Mittel) ohne Verpackung.
„Mindestens eine Protease beinhaltend” bedeutet, dass das Mittel eine Protease oder eine Mischung von zwei Proteasen beinhaltet. Als Proteasen kommen dabei Trypsin oder eine Mischung von Trypsin und Chymotrypsin in Frage. Die entsprechenden Enzyme können aus natürlichen Quellen isoliert oder mittels rekombinanter Methoden der Gentechnologie gewonnen sein.
Die Protease ist oder die Proteasen sind, bezogen auf das vollständige Mittel, vorzugsweise in einem Anteil von 0,01 bis 5, besonders bevorzugt von 0,1 bis 4, wie insbesondere in einem Anteil von 0,5 bis 3 Gewichtsprozent beinhaltet.
„Einkomponentig” bedeutet, dass das erfindungsgemäß verwendete Mittel für die Anwendung als eine fertige Mischung bereit gestellt ist, so dass keine weiteren räumlich (z. B. als Kit mit mehreren Kammern in einer Folie oder einem anderen Behältnis oder mit mehreren separaten Behältern mit Komponenten unterschiedlicher Zusammensetzung) getrennten Zusätze (Komponenten) mehr zugegeben werden müssen. Dagegen kann eine Verpackungseinheit durchaus mehrere Behältnisse (z. B. Dosiseinheiten für jeweils eine Anwendung) mit jeweils identischen oder leicht abweichenden erfindungsgemäß verwendeten Mitteln, die jedoch zur Entfaltung ihrer Wirkung nicht gemischt werden müssen, aufweisen.
„Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers” bedeutet, dass es nicht um Mittel geht, die zur dauerhaften Haarwuchsreduktion beispielsweise von Tierfellen toter Tiere verwendet werden.
Als „proteasestabilisierenden Kationen” sind Calcium-Kationen (Ca² ⁺) zu nennen. Diese können als Salze, beispielsweise mit üblichen kosmetisch verträglichen Anionen, wie den Anionen organischer, wie Methansulfon-, Essig- oder Zitronensäure, oder anorganischer Säuren, z. B. Sulfat-, Phosphat-, Fluorid-, Chlorid-, Bromid- oder Iodid-Anionen, insbesondere Chloridionen, zugesetzt sein oder auf andere Weise, beispielsweise als neutralisierende Ionen in Bestandteilen von Verdickungs- oder Filmbildungsmitteln mit anionischen Gruppen, wobei die Zugabe von Salzen bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist ein Zusatz von Calciumchlorid (CaCl₂).
Das oder die proteasestabilisierenden Kationen liegen vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 2 Mol/l, wie 0,001 bis 1,2 Mol/l des fertigen Mittels, insbesondere von 0,005 bis 0,5 mol/l vor, beispielsweise von 0,01 bis 0,05 Mol/l. Werden Salze, wie Calciumchlorid, verwendet, liegt deren Menge (bezogen auf die Masse der Anionen- und Kationen ohne andere Bestandteile, wie Wasser oder Solventien bei Hydraten oder Solvaten) beispielsweise bei 0,1 bis 120 Gew.-%, beispielsweise bei 0,55 bis 56 Gew.-%, wie bei 1,1 bis 7 Gew.-%.
„Wasserhaltig” bedeutet, dass das Mittel auf wässriger Basis beruht, vorzugsweise mehr als 50 Gewichts-%, insbesondere mehr als 60, 70 oder 80 Gewichts-Prozent, beinhaltet. Der maximale Wasseranteil kann bei 98, insbesondere bei bis zu 95, bis zu 93 oder vor allem bis zu 90 Gew.-%, liegen.
Unter durch „mindestens teilsweise Glykosylierung weiter stabilisiert” ist insbesondere zu verstehen, dass durch enzymatische oder chemische Glykosylierung und/oder durch nichtenzymatische Umsetzung von vorzugsweise Aminogruppen (auch „Glykation” genannt, die nicht zu Glykosiden führt, sondern zu α-Aminoketonverbindungen) oder ferner Hydroxygruppen (beispielsweise von Serin-, Threonin-, Hydroxylysin, Hydroxyprolin, oder Tyrosinresten in den Proteasen) in der oder den Proteasen mit reduzierenden Zuckern entsprechende Zuckeraddukte gebildet werden, oder durch entsprechende enzymatische oder chemische Glykosylierung.
Unter einem „reduzierenden Zucker” sind solche Kohlenhydrate zu verstehen, die in Lösung mindestens einen Gleichgewichtsanteil an einer Aldehyd- oder α-Hydroxyketon-Gruppe tragen. Beispielsweise liegen fast alle Monosaccharid-Aldosen in Losung zwar vorwiegend als zyklische Halbacetalform vor, die keine freie Aldehyd- oder α-Hydroxyketongruppe aufweist. Da die Ringbildung eine Gleichgewichtsreaktion ist, kommt jedoch in Lösung auch ein geringer Prozentsatz der offenkettigen Aldehyd-Form oder α-Hydroxyketon-Form vor, die beispielsweise mit Aminogruppen in den Proteasen, wie in Lysin oder Arginin, reagieren können. Beispiele für reduzierende Zucker sind alle Monosaccharide, wie insbesondere Glycerinaldehyd, Dihydroxyaceton, Erythrose, Threose, Erythrulose, Aldopentose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Ribulose, Xylulose, Allose, Altrose, Gulose, Talose, Fucose, Rhamnose, Fructose, Sedoheptulose oder insbesondere Glukose, Mannose oder Galaktose, oder reduzierende Disaccharide, wie Maltose und Laktose, oder reduzierende Oligosaccharide.
Saccharose ist dagegen ein Beispiel für einen nicht-reduzierenden Zucker, da hier beide Oxogruppen für die Verbindung der Zuckermonomere miteinander verbraucht werden.
Die Glykosylierung und/oder Glykation wird entweder in Lösungen vorgenommen, welche die Protease(n) und die reduzierenden Zucker beinhalten (beispielsweise, bezogen auf die jeweilige Lösung von Zucker und Enzym und weiteren Zusätzen in Wasser, 1 bis 60 Gew.-% Enzym, 1 bis 60 Gew.-% Zucker und 50 bis 99 Gew.-% Wasser, ggf. in Gegenwart von Puffern oder weiteren Zusätzen von insgesamt bis zu 10 Gew.-%), bei erhöhten Temperaturen im Bereich von 30 bis 90°C, z. B. von 35 bis 60°C; oder in Abwesenheit von Solventien, beispielsweise durch Erwärmen einer zur Trockene lyophilisierten Mischung des oder der Enzyme und des oder der Zucker, vorzugsweise unter Luftabschluss, beispielsweise im Vakuum, wie unter von Pham et al., beispielsweise in Biotechnology and Bioengineering 101(3), 2008, Seiten 452–459, (hier durch Bezugnahme bezüglich der Reaktionsbedingungen inkorporiert) beschriebenen Bedingungen, bei 40 bis 95°C, insbesondere bei 60 bis 85°C, wobei die relativen Gewichtsanteile beispielsweise wie gerade für die Umsetzung in Lösung beschrieben sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von glykosylierten und/oder glykierten Proteasen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Mittels zur dauerhaften Haarwuchsreduktion.
Die Menge des verwendeten reduzierenden Zuckers, bezogen nun wieder auf das Gesamtgewicht eines erfindungsgemäßen Mittels, liegt vorzugsweise bei 0,1 bis 10 Gew.-%, wie z. B. bei 0,1 bis 5 Gew.-%. Mindestens ein Teil des Zuckers kann auch in freier Form im fertigen Mittel vorhanden sein.
Das erfindungsgemäß verwendete Mittel kann zusätzlich mindestens einen (also einen oder mehrere) reduzierende(n) Zucker beinhalten, vorzugsweise in den im vorstehenden Absatz genannten Gewichtsprozentanteilen.
Neben den bisher genannten Komponenten können weitere Zusätze im erfindungsgemäß verwendeten Mittel zur dauerhaften Haarwuchsreduktion beinhaltet sein.
Hier sind insbesondere zwei oder mehrere der folgenden Zusätze denkbar: weitere Salze, wie Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, z. B. Natriumchlorid, Öle für Emulsionen, wie Olivenöle oder Ricinusöl; Emulgatoren (weniger bevorzugt), wie Cetylalkohol oder Polysorbat oder ethoxyliertes Docosanol, z. B. mit durchschnittlich 10 mol Ethylenoxid ethoxyliert (z. B. Beheneth-10), vorzugsweise solche, die keine Liposomen bilden; Farbstoffe, Pigmente, Schaummittel, Co-Solventien, wie Ethanol, Propanol oder Isopropanol; Duft- oder Parfümstoffe; antiinflammatorische und/oder die Hautdurchlässigkeit erhöhende Mittel, wie Salicylsäure oder Derivate davon, wie Diethylaminosalicylat; beispielsweise jeweils in einem Anteil von 0,01 bis 10 Gew.-%; oder Antioxidantien, wie Ascorbinsäure und Ascorbate, z. B. Natriumascorbat, oder Propylgallat, beispielsweise jeweils in einem Anteil von 0 bis 2 Gew.-%. Insgesamt liegt der Anteil der bisher genannten weiteren Zusätze vorzugsweise bei 0 bis 40 Gew.-%, z. B. bei 0 bis 15 Gew.-%.
Einige weitere Zusätze sind bevorzugt.
Zu diesen bevorzugten weiteren Zusätzen zählen Säuren, insbesondere organische Säuren, wie Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure oder Essigsäure, insbesondere zur Einstellung eines geeigneten pH-Wertes in dem erfindungsgemäß verwendeten Mittel, vorzugsweise in einem Anteil von 0,001 bis 4 Gew.-%, wie z. B. von 0,05 bis 1 Gew.-%.
Der pH-Wert des erfindungsgemäß verwendeten Mittels wird zwischen pH 4.5 und pH 7,00 eingestellt, beispielsweise durch Zugabe entsprechender Mengen der organischen Säure(n).
Zu den bevorzugten weiteren Zusätzen zählen auch Feuchthaltemittel, wie ein oder mehrere ausgewählt aus Glycerin, Ethylenglykol, oder Zuckeralkohole, wie Sorbit (Sorbitol oder Glucitol), Mannit (Mannitol), Isomalt, Lactit, Xylit (Xylitol), Threit, Erythrit oder Arabit, oder Polydextrose (vorzugsweise in einem Anteil von 0,2 bis 40 Gew.-%, z. B. von 1 bis 30 Gew.-%, wie von 2 bis 10 Gew.-% oder von 10 bis 30 Gew.-% für eines oder mehrere der genannten Mittel zusammen genommen); Aloe-Vera-Gel (vorzugsweise in einem Anteil von 0 bis 7 Gew.-%, z. B. von 0,01 bis 3 Gew.-%).
Ebenfalls zu den bevorzugten Zusätzen, insbesondere für Lösungen oder Gele, zählen ein oder mehrere Verdickungsmittel, gel- und/oder filmbildende Mittel, wie z. B. Sklerotium-Gummi (z. B. Amigel^®, siehe bei den Beispielen); Acaciae Gummi; Gummi arabicum; Guar Gummi, Propylenglycoalginat, Xanthangummi, Gelatine; Natriumalginat; Stärke; Tragant, Dextrine, Hydroxyethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Methylzellulose, Na-Carboxymethylzellulose, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Ethylzellulose, Polyacrylat/methacylate, Polyvinylacetat, Polylactid/glucolid, oder dergleichen, oder Mischungen von zwei oder mehr davon, vorzugsweise (insgesamt) in einem Anteil von 0,05 bis 20, z. B. von 0,1 bis 10, wie von 0,2 bis 5 Gew.-%.
Ebenfalls zu den bevorzugten weiteren Zusätzen zählen Konservierungsmittel, wie z. B. Benzalkoniumchlorid, Benzoesäure, Benzylalkohol, Butylparaben, Cetrimid, Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumchlorid, Chlorhexidindiacetat, Chlorhexidingluconat, Chlorhexidindihydrochlorid, Chlorbutanol, Chlorocresol, Ethylparaben, Methylparaben, Phenoxyethanol, Phenylethanol, oder insbesondere Sorbinsäure, Kalium- oder Natriumsorbat oder Natriumbenzoat, oder Mischungen von zwei oder mehr davon, vorzugsweise (bei zwei oder mehr insgesamt) in einem Anteil von 0,005 bis 7, wie von 0,2 bis 2 Gew.-%.
Das erfindungsgemäß zu verwendende Mittel kann vorzugsweise in Form einer Dispersion, inbesondere einer Suspension oder insbesondere Emulsion, eines Schaums, eines Sprays oder – für besonders einfache Verwendung – eine Lösung oder eines Gels vorliegen.
Das erfindungsgemäß zu verwendende Mittel zur dauerhaften Haarwuchsreduktion kann entsprechend in unterschiedlichsten geeigneten Behältern, wie in Flaschen, Tuben, Spraydosen, Sprühfläschchen, Röhrchen, Folienbeuteln oder dergleichen mehr, abgefüllt werden/sein.
Die Verwendung eines der vor- oder nachstehend genannten wasserhaltigen einkomponentigen Mittel zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers, erfolgt erfindungsgemäß nach vorheriger Enthaarung unter Entfernung der Haare mitsamt der Wurzel (Epilation), z. B. durch elektrische Epilierer, Wachs, Halawa, Pinzette.
Die Dosierung erfolgt dabei derart, dass die entsprechende Hautstelle mit dem erfindungsgemäß verwendeten Mittel in Kontakt gebracht wird, beispielsweise beschichtet wird, wie z. B. durch Bestreichen, Einmassieren oder Besprühen oder Kombinationen davon, und einen gewissen Zeitraum lang einwirken gelassen wird, z. B. 5 Minuten bis 10 Stunden, wie beispielsweise 1 bis 6 Stunden. Dann wird der Rückstand wenn vom Anwender erwünscht entfernt, beispielsweise durch Abwaschen oder Abreiben, was jedoch nicht getan werden muss. Die Behandlung kann für ein besonders dauerhaftes Ergebnis noch ein- oder mehrmals wiederholt werden, beispielsweise im Abstand von 3 Wochen bis 10 Wochen.
Das offenbarungsgemäße Verfahren zur Herstellung besteht in erster Linie im Mischen der Komponenten, wobei vorzugsweise gleichzeitig oder in einem separaten Ansatz (dann mit anschließender Mischung mit noch fehlenden Bestandteilen) eine Behandlung der Protease durch Glykosylierung und/oder Glykation, wie oben beschrieben, durchgeführt wird. Beispielsweise kann die Mischung bei Temperaturen zwischen 0°C und 85°C, wie zwischen 0°C und 40°C, erfolgen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken. Soweit keine Temperaturen angegeben werden, werden die vorgenommenen Schritte bei 23°C durchgeführt.
Die Gewichtsprozent-Angaben beziehen sich in allen Beispielen auf die jeweilige vollständige Zusammensetzung (100%).
Beispiel 1: Referenz-Zusammensetzung mit Trypsin
Ein enzymhaltiges Gel wird hergestellt wie folgt:
80,75 Gew.-% vollentsalztes Wasser, 6 Gew.-% einer wässrigen 86-prozentigen Glyzerinlösung reinst nach Pharm. Eur. 900237, 0,3 Gew.-% Kaliumsorbat in Granulatform nach Pharm. Eur. 105119, 0,3 Gew.-% Natriumbenzoat nach Pharm. Eur. und 1,25 Gew.-% Amigel Granula 5553515 (granuliertes Amigel, Worleé E. H. & Co., Hamburg, Deutschland; Amigel ist ein Sklerotium-Gummi, erhältlich durch Fermentierung von Sklerotium rolfsii), werden gemischt zu einer ersten Lösung (Lösung 1). Parallel werden 1 Gew.-% Wasser und 0,05 Gew.-% Aloe-Vera-Pulver 200:1 (gefriergetrocknet) gemischt (Lösung 2). In einem weiteren Ansatz werden 6 Gew.-% Calciumchlorid (Pharm, Eur. USP, E 509) in 20 Gew.-% vollentsalztem Wasser angerührt und 2 Gew.-% Trypsin aus Rinderpankreas (mit 2.530 USP-Einheiten/mg, mit Sorbitol als Träger) in der erhaltenen Lösung (Lösung 3) verrührt. Die drei Lösungen werden gemischt, mit 10%iger Zitronensäure in Wasser auf pH ~ 5,3 gebracht und mit Wasser auf 100 Gew.-% aufgefüllt und bis zum Entstehen eines klaren Gels gerührt und abgefüllt.
Beispiel 2: Referenz-Zusammensetzung mit Trypsin und Chymotrypsin
Anstelle von Lösung 3 in Beispiel 1 wird eine entsprechende Lösung (Lösung 4) mit 2 Gew.-% von einem Gemisch von Trypsin/Chymotrypsin aus Schweinepankreas (mit 2.446 USP-Einheiten/mg Trypsin und 437 USP-Einheiten/mg Chymotrypsin) in einer Mischung von 20 Gew.-% vollentsalztem Wasser und 6 Gew.-% Calciumchlorid hergestellt und mit Lösung 1 und Lösung 2 aus Beispiel 1 gemischt, mit 10% Zitronensäure in Wasser auf pH ~ 5,3 gebracht, mit Wasser auf 100 Gew.-% aufgefüllt und bis zum Entstehen eines klaren Gels gerührt und abgefüllt.
Beispiel 3: Erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung mit glykosyliertem Trypsin
Anstelle von Lösung 3 aus Beispiel 1 wird folgende Lösung 5 hergestellt:
In 20 Gew.-% vollentsalztem Wasser werden 6 Gew.-% Calciumchlorid sowie 1 Gew.-% Glucose angerührt und 2 Gew.-% Trypsin (siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 48 Stunden bei 40°C bei 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Es resultiert Lösung 6.
Dann wird Lösung 6 zu Lösung 1 und Lösung 2 aus Beispiel 1 gegeben, die resultierende Lösung mit 10%iger Zitronensäure in Wasser auf pH ~ 5,3 gebracht und mit Wasser auf 100 Gew.-% aufgefüllt und bis zum Entstehen eines klaren Gels gerührt und abgefüllt.
Beispiel 4: Erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung mit glykosyliertem Trypsin/Chymotrypsingemisch
Anstelle von Lösung 3 aus Beispiel 1 wird folgende Lösung 5 hergestellt:
In 20 Gew.-% vollentsalztem Wasser werden 6 Gew.-% Calciumchlorid sowie 1 Gew.-% Glucose angerührt und 2 Gew.-% von einem Gemisch von Trypsin/Chymotrypsin (siehe Beispiel 1) zugegeben. Die resultierende Mischung wird 48 Stunden bei 40°C inkubiert. Dies ergibt Lösung 7.
Dann wird Lösung 7 zu Lösung 1 und Lösung 2 aus Beispiel 1 gegeben, die resultierende Lösung mit 10%iger Zitronensäure in Wasser auf pH ~ 5,3 gebracht und mit Wasser auf 100 Gew.-% aufgefüllt und bis zum Entstehen eines klaren Gels gerührt und abgefüllt.
Beispiel 5: Aktivitäts- und Stabilitätstest
Die aus den Beispielen 1 bis 4 ersichtlichen Zusammensetzungen werden zu Beginn, nach 2 Wochen, nach 3 Monaten und nach 6 Monaten auf ihre Protease-Aktivität geprüft mit dem nachfolgend beschriebenen Testsystem.
Parallel wird jeweils eine Mischung ohne Zugabe von Calciumchlorid bzw. ohne Glykosylierung und Zugabe von Calciumchlorid mit dem selben Testsystem geprüft.
Das Testsystem für basiert auf der Spaltung von N-Benzyolargininethylester (BASE) für Trypsin bzw. auf der Spaltung von N-Acetyl-L-tyrosinethylester (ATEE) für Chymotrypsin.
Bestimmung der Trypsinaktivität:
Ausrüstung: Ein Reaktionsgefäß von 30 ml, temperierbar auf 25.0°C und mit einem Magnetrührer und mit einem Deckel mit Löchern zur Einführung von Elektroden, der Spitze einer Bürette, sowie einem Röhrchen zum Einführen von Stickstoff und Reagentien.
Eine manuelle Titrationsvorrichtung wird genutzt, wobei die Bürette in 0.005 ml-Einheiten gradiert ist und ein pH-Meter mit einer großen Skala und Glas-Kalomel-Elektroden verwendet wird.
Reagentien:

(1) BASE-Lösung (0,02 M):0,686% (m/V):0,1714 g BAEE × HCl werden in destilliertem Wasser gelöst und mit demselben Lösungsmittel auf 25,0 ml verdünnt.
(2) Boratpuffer-Lösung pH 8,0 (0,0015 M):0,572 g Natriumtetraborat (Na₂B₄O₇ × 10H₂O) und 2.94 g Calciumchlorid (CaCl₂ × 2H₂O) werden in 800 ml Wasser gelöst. es wird mit 1 N HCl auf pH 8,0 eingestellt und mit Wasser auf 1000 ml verdünnt.
(3) 0,1 N Natriumhydroxid
(4) 0,001 N Salzsäure
(5) Testlösung: Eine Probe wird so mit 0,001 N Salzsäure (4)) so auf 25,0 ml verdünnt, dass eine Lösung mit ca. 700 Nanokatalen/ml entsteht.
(6) Referenzlösung: 25,0 mg Trypsin BRP werden in 0,001 N Salzsäure gelöst und damit auf 25,0 ml aufgefüllt.

Trypsin BRP stammt vom Technischen Sekretariat, European Pharmacopeia Commission, Council of Europe, P. O. Bos 907 R6, 67029 Strassburg CEDEX 1, Frankreich.
Vorgehen: Testlösung (5) und Referenzlösung (6) werden bei 0 bis 5°C aufbewahrt. 1 ml jeder Lösung wird über 15 Minuten auf 25°C aufgewärmt und 50 μl jeder Lösung werden zur Titration verwendet, die unter Strickstoff stattfindet.
In das Reaktionsgefäß werden 10,0 ml Boratpuffer (2) und unter Rühren 1,0 ml BASE-Lösung (1) zugegeben. Sobald die Temperatur bei 25,0 ± 0,1°C liegt, werden 50 μl der Testlösung (5) zugegeben, eine Stoppuhr gestartet und der pH durch Zufügen von 0,1 N Natriumhydroxid (3) bei 8,0 gehalten, wobei die Spitze der Bürette in die Lösung eingetaucht ist. Alle 30 Sekunden wir das Volumen notiert.
Die Reaktion wird während 8 Minuten verfolgt. Das pro Sekunde benötigte Volumen an 0,1 N Natriumhydroxidlösung wird berechnet. Auf dieselbe Weise wird der entsprechende Wert für die Referenzlösung (6) ermittelt und ausgerechnet.
Die Aktivität in Mikrokatal pro mg wird mittels der Formel m' × V × A / m × V' errechnet, worin m = Masse in mg des untersuchten Enzyms, m' Masse in mg an Trypsin BRP, V = Volumen der verbrauchten 0,1 N Natriumhydroxidlösung pro Sekunde für die Testlösung, V' = Volumen der verbrauchten 0,1 N Natriumhydroxidlösung pro Sekunde für die Referenzlösung, A = Aktivität des Trypsin BRP in Mikrokatal/mg.
Alternativ können andere bekannte Methoden (insbesondere die nach der USP-Monographie) verwendet werden.
Bestimmung der Chymotrypsinaktivität:
Nach der USP-Monographie entspricht 1 Einheit Chymotrypsin der Menge an Enzym, die unter den Testbedingungen 1 μmol ATEE hydrolysiert (was einer Änderung der Absorbanz von 0,0075 pro Minute bei 237 nm entspricht).
Lösungen:

(7) Temperaturangleichung: Chymotrypsin-Standard USP, die Proben und ATEE werden von 4°C auf Raumtemperatur gebracht.
(8) 1 mM HCl-Lösung: 1,0 ml 1 N HCl-Lösung + reines Wasser ad 1000 ml.
(9) ATEE-Lösung: 61,0 mg ATEE × H₂O + 96% Ethanol ad 1,0 ml.
(10) 0,067 M KH₂PO₄-Lösung: 4,56 g KH₂PO₄ (MERCK 4873; Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland) und reines Wasser ad 500 ml.
(11) 0,067 M Na₂HPO₄-Lösung: 4,73 g Na₂HPO₄ (MERCK 6586) und reines Wasser ad 500 ml.
(12) 0,067 M Phosphatpuffer, pH 7,00: Zu 200 ml KH₂PO₄-Lösung (10) wird soviel Na₂HPO₄-Lösung (11) gegeben, bis der pH-Wert bei 7,00 liegt.
(13) Enzymlösung: Die Aktivität der Probe wird mit zwei initialen Mengen bestimmt, wobei für die Trypsin- und Chymotrypsin-Mischung eine initiale Menge der Probe derart gewählt wird, dass die Trypsin- und die Chymotrypsin-Aktivität aus derselben Lösung nach USP bestimmt werden können (50 ml) mit einem Volumen in ml beim Test von 0,08 bis 0,200 ml. Die Menge der Enzymlösung und der Standard werden in 1 mM HCl-Lösung (8) gelöst. Die Verdünnung des Enzyms in 1,2 mM HCl-Lösung sollte eine Änderung der Absorbanz (ΔA/min) von maximal 0.02 bei einem Volumen von 0,200 ml beim Test ergeben.

Formel: mg Anfangsmenge = [(1.9 USP-U/0,200 ml beim Test) × Verdünnungsfaktor Enzymlösung]/angegebene Enzymaktivität
Vorgehen: in 100 ml Phosphatpuffer (12) werden 0,42 ml ethanolische ATEE-Lösung (9) gegeben. Die Phosphatpuffer-Lösung wird in einem Bad-Thermostaten auf 25°C äquilibriert. Kurz vor Beginn des Tests wird die ATEE-Lösung in den Puffer gegeben (für 1,5 Stunden bei 25°C stabil). Um eine homogene Temperatur einzustellen, wird die Lösung vor der Verwendung jedes mal gemischt.

a) Das UV-Spektralphotometer wird bei 237 nm mit reinem Wasser kalibriert.
b) Für jeden Test wird ein Leerwert (200 μl 1,2 mM Salzsäurelösung) ermittelt und das Spektralphotometer damit kalibriert.
c) zum Testen der Enzymlösung werden z. B. in einer Küvette 80 μl der Enzymlösung (13) und 120 μl 1,2 M HCl-Lösung verwendet.
d) Die Puffer-ATEE-Lösung wird jedes mal separat vor dem Testen gemischt. In die entsprechende Küvette werden 3 ml der ATEE-Puffer-Lösung gegeben, gemischt, unmittelbar in das Spektralphotometer gegeben und gemessen.
e) Die Absorbanz wird alle 30 Sekunden während 5 Minuten gemessen. Falls die Änderungsrate der Absorbanz (größer als 0,02 oder kleiner als 0,009 ist, auf die nächste Lösung der 0,080–0,200 ml im Test gehen.
f) Die Raten der Absorbanzänderung (ΔA/min) bestimmen und tabellieren.
g) Nach Herstellervorschrift das UV-Spektralphotometer ggf. für eine neue Messung vorbereiten.
h) Jede Enzymverdünnung 4 mal messen.
i) Die Küvette nach jeder Nutzung mit reinem Wasser spülen.

Berechnung:
Das durchschnittliche ΔA/min für jede Enzymlösung berechnen, Faktor: 1 / {[(Anfangsgew. mg/Enzymlsg. ml)/(Verd.-Faktor)] × (ml im Test)} × 0,0075 USP-Einheiten (USP-u)/mg = ΔA/min × Faktor
Standard: USP-u/mg (rel.) = r = USP-u/mg (abs.)/angegebene Aktivität des Referenzstandards.
Probe: USP-u/mg (rel.) = USP u/mg (abs.)/r.
Es kann gezeigt werden, dass die Zusammensetzungen mit Calciumchlorid und Glykosylierung eine höhere Langzeitstabilität (höhere Proteaseaktivität) aufweisen als das Vergleichsbeispiel ohne Calciumchlorid und Glykosylierung.
Beispiel 6: Anwendung erfindungsgemäß zu verwendender Zusammensetzungen
Eine Zusammensetzung nach jeweils einem der Beispiele 3 bis 4 wird auf jeweils ein zuvor epiliertes Schienbein von vier Probanden (jedem eine andere der vier Zusammensetzungen) aufgetragen und dort 5 Stunden einwirken gelassen. Dann wird, falls der Proband es wünscht (was jedoch nicht sein muss) mit Wasser gewaschen und abgetrocknet. Das andere Schienbein wird nur epiliert und nach 5 Stunden, falls der Proband es wünscht (was jedoch nicht sein muss) mit Wasser gewaschen, ohne Auftragen einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Nach drei Wochen zeigt sich auf den mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung behandelten Schienbeinen noch praktisch kein Haarwachstum, während auf den anderen, unbehandelten Schienbeinen (Kontrollen) wieder Haare sichtbar werden.

Claims

Verwendung eines mindestens eine Protease ausgewählt aus Trypsin oder einer Mischung von Trypsin und Chymotrypsin beinhaltenden wasserhaltigen einkomponentigen Mittels, das proteasestabilisierende Kationen in Form von Calcium-Kationen beinhaltet, zur dauerhaften Haarwuchsreduktion von Haut des lebenden, menschlichen oder tierischen Körpers, wobei das Mittel auf die zu behandelnden Hautpartien aufgebracht wird und dort einwirken gelassen und belassen oder entfernt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftragen auf die zu behandelnden Hautpartien nach vorheriger Enthaarung unter Entfernung der Haare mitsamt der Wurzel durchgeführt wird und die Protease oder die Proteasen in der einkomponentigen Zusammensetzung mit mindestens einem reduzierenden Zucker mindestens teilweise in Lösung bei 30 bis 90°C oder in Abwesenheit von Solventien bei 40 bis 95°C glykosyliert und/oder glykiert sind und das Mittel einen pH-Wert von 4,5 bis 7 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einkomponentige Zusammensetzung die Protease(n) in einem Gesamtanteil von 0,01 bis 5 Gew.-%, die proteasestabilisierenden Kationen in einer Menge von insgesamt 0,001 bis 2 Mol/l, ein oder mehrere organische Säuren in einem Anteil von insgesamt 0,001 bis 4 Gew.-%, einen pH-Wert von 4,5 bis 7,00, ein oder mehrere Feuchthaltemittel in einem Anteil von insgesamt 0,2 bis 40 Gew.-%, Aloe-Vera-Gel in einem Anteil von insgesamt 0 bis 7 Gew.-%, ein oder mehrere Verdickungs-, gel- oder filmbildende Mittel in einem Anteil von insgesamt 0,05 bis 20 Gew.-%, ein oder mehrere Konservierungsmittel in einem Anteil von insgesamt 0,005 bis 7 Gew.-%, und optional weitere Zusätze in einem Anteil von insgesamt 0 bis 40 Gew.-% ausgewählt aus weiteren Salzen, Ölen, Emulgatoren, Farbstoffen, Pigmenten, Schaummitteln, Co-Solventien, antiinflammatorischen und/oder die Hautdurchlässigkeit erhöhenden Mitteln, und Wasser in einem Anteil von mehr als 50 Gew.-% beinhaltet, wobei sich die Angaben in Gew.-% immer auf die gesamte Zusammensetzung ohne Verpackung beziehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der einkomponentigen Zusammensetzung ein reduzierender Zucker beinhaltet ist, der in einem Anteil von 0,1 bis 10 Gew.-% vorliegt.