CN1225467C

CN1225467C - 一种新型二氮芳辛类化合物及其利用粘细菌发酵并提取的方法

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Publication number: CN1225467C
Application number: CN 200410023472
Authority: CN
Inventors: 李越中; 胡玮
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2004-02-11
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2024-02-11
Also published as: CN1557955A

Abstract

本发明涉及一种新型的二氮芳辛类化合物，它是由粘细菌堆囊菌的发酵液中分离制得，分子式为C₂₈H₂₀N₄O₂S₂，名称为2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。本发明还涉及利用粘细菌纤维堆囊菌发酵并分离提取该化合物的方法。本发明涉及的化合物可用于制备抗肿瘤和抗真菌药物。

Description

一种新型二氮芳辛类化合物及其利用粘细菌发酵并提取的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种二氮芳辛类化合物及其利用粘细菌发酵并提取的方法，尤其涉及一种新型的二氮芳辛类化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，以及利用粘细菌堆囊菌发酵并分离提取该化合物的方法。

(二)背景技术

粘细菌是最高等的原核生物类群，具有复杂的多细胞行为和形态发生，在细胞分化、发育和生物进化研究中占有重要地位。近年来，粘细菌作为一类可产生丰富次级代谢物的微生物类群日趋受到重视。在原核生物中按已发现生物活性物质的数量，粘细菌仅排在放线菌和芽孢杆菌之后。目前从粘细菌中已发现大约600多种生物活性物质，约占微生物来源的总数的3.5％。需要特别指出的是，目前从放线菌等微生物中筛选新生物活性物质的重复几率越来越高，而粘细菌在这方面具有独特的优势。就目前情况看，在溶细菌群粘细菌中55％的菌株可产生生物活性物质，而溶纤维素群粘细菌主要是纤维堆囊菌甚至高达95％。这为新结构或新作用机制物质的筛选提供了很好的一类微生物资源。

粘细菌产生的生物活性物质种类繁多，作用水平在多个层次上，作用机理也多种多样。根据作用机理的不同，主要分为以下几类：呼吸抑制，核酸合成抑制，蛋白质合成抑制，干扰蛋白质磷酸化系统，干扰金属离子运输，作用于脂类代谢，干扰糖类利用和作用于细胞壁。堆囊菌的代谢产物，主要的作用对象是真核生物，不但对各种真菌，而且对肿瘤细胞也有普遍的活性。其中，1993年赫弗勒等报道从纤维堆囊菌中分离出新的16元大环内酯类化合物埃博霉素，被认为是目前最为成功的抗癌药物紫杉醇的替代品而进入临床试验阶段，引起了人们的广泛关注。

近来有研究表明，二氮芳辛及其衍生物可以对Bcl-2的抗凋亡功能起抑制作用，从而引发肿瘤细胞的凋亡，达到杀死肿瘤细胞的作用[Istvan J Enyedy et al.，J Med Chem2001(44)，4313-4324.]。因此，新型二氮芳辛及其衍生物的研制、开发、利用，对临床药物的研发与应用具有重要的意义。

本发明涉及的二氮芳辛类化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛不但在结构上是全新的，而且该类化合物在生物体中研究很少，通过粘细菌发酵得到该类化合物，以及利用粘细菌堆囊菌发酵并由发酵液分离提取该化合物的方法未见报道。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种全新的二氮芳辛类化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，并且提供一种利用粘细菌堆囊菌发酵并由发酵液分离提取该化合物的方法。

本发明的技术方案是通过如下方法实现的：

一种新型的二氮芳辛类化合物，其特征是，它是由粘细菌堆囊菌的发酵液中分离制得，分子式为C₂₈H₂₀N₄O₂S₂，化学名称为2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，

英文名称为2，6-bis-(6-mercapto-pyridin-3-yl)-4，8-bis-(phenol-4-yl)-[1，5]-diazocine。

化学结构如下所示：

上述化合物为白色针状晶体，可溶于甲醇，难溶于水。利用傅里叶变换离子回旋共振高分辨率质谱(FT-ICRMS)测定，使用电喷雾源(ESI)源获得531.1011[M+Na]⁺的质谱峰，校正分子式为C₂₈H₂₀N₄O₂S₂Na。利用甲醇作为溶剂测定了化合物的紫外谱图，使用KBr压片法测定了化合物的红外谱图，结果见附表1。以CD₃OD为溶剂，使用600MHz NMR仪分别测定了化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR谱图，结果见附表2，结合测定的无畸变极化转移增强谱(DEPT，图2.)，异核单量子相干谱(HSQC，图3.)和异核多键相关谱(HMBC，图4.)等谱图鉴定了该化合物的结构。

表1.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的

紫外和红外光谱数据表

光谱项目	吸收峰
光谱项目	吸收峰	紫外光谱	248nm(ε_max1117)，304nm(ε_max458)
红外光谱	1243^cm-1，1268^cm-1，1451^cm-1，1459^cm-1，1517^cm-1，1601^cm-1，1631^cm-1，2404^cm-1，3219^cm-1.	紫外光谱	248nm(ε_max1117)，304nm(ε_max458)

表2.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛

的¹H-NMR和¹³C-NMR数据表

No. ¹H-NMR ¹³C-NMR

2 158.5

3 6.84(1H，t) 102.0

4 163.6

6 158.5

7 6.84(1H，t) 102.0

8 163.6

9 124.6

10 8.12(1H，s) 153.3

12 176.8

13 6.93(1H，dd) 115.3

14 8.05(1H，d) 127.2

16 124.6

17 8.12(1H，s) 153.3

19 176.8

20 6.93(1H，dd) 115.3

21 8.05(1H，d) 127.2

23 123.0

24 7.36(1H，tt) 130.1

25 6.84(1H，tt) 114.9

26 157.4

27 6.84(1H，tt) 114.9

28 7.36(1H，tt) 130.1

30 123.0

31 7.36(1H，tt) 130.1

32 6.84(1H，tt) 114.9

33 157.4

34 6.84(1H，tt) 114.9

35 7.36(1H，tt) 130.1

本发明利用粘细菌堆囊菌发酵获得2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其基本步骤是：

(1)发酵种子的制备：将产生菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC 25569接种在固体斜面培养基上，28-32℃培养3-7天后，接种于液体种子培养基，28-32℃培养3-7天，得到1-8×10⁹/ml的菌体细胞。

(2)液体发酵：将步骤(1)制备好的菌体细胞，按与发酵液体积比为0.5~1.5∶10的接种量接种于自动发酵罐中，培养温度为30℃，搅拌转速为30-60转/分，培养5-9天。

(3)上述步骤(1)使用的固体斜面培养基配方为：

KNO₃ 0.5-1.5g/L；K₂HPO₄·2H₂O 0.5-1.0g/L；MgSO₄·7H₂O 1.0-2.0g/L；CaCl₂·H₂O1.0-2.0g/L；FeCl₃·6HO 0.1-0.5g/L；pH 6.5-7.5；琼脂15g/L。

上述步骤(1)使用的液体种子培养基配方为：

1.0-2.0％葡萄糖，0.2-1.0％大豆蛋白胨，0.1-0.5％MgSO₄·H₂O，0.1-0.5％CaCl₂·H₂O，pH 7-7.5。

上述步骤(2)使用的液体发酵培养基配方为：

0.5-2.5％马铃薯淀粉，0.1-1.5％酵母粉，0.1-0.5％MgSO₄·H₂O，0.1-0.5％CaCl₂·H₂O，0.001-0.01％FeCl₃，1-5％大孔吸附树脂，pH为6.5-8。

在上述的利用粘细菌发酵获得2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法的液体发酵培养基配方中，添加的大孔吸附树脂是指Amberlite XAD-16大孔吸附树脂。

本发明还涉及从粘细菌堆囊菌发酵液中分离提取2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其步骤是：

(1)采用过滤或者离心的方法，从发酵液中收集并且分离大孔吸附树脂。

(2)分步萃取：分别使用甲醇，二氯甲烷和正己烷进行三步萃取处理。

(3)硅胶柱层析：将第三步萃取物进行硅胶柱低压层析，利用甲醇-二氯甲烷进行梯度洗脱，洗脱时间为130-155min，得到硅胶柱层析纯化的组分。

(4)分子筛层析：将硅胶柱层析纯化的组分重溶于2-4倍体积甲醇，进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离，流动相为甲醇或二氯甲烷。

(5)高效液相分离：利用高效液相分离该化合物时，使用反相柱，流动相为甲醇和水，收集后即可获得纯化的2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

其中，上述步骤(2)分步萃取的具体方法为：

(1)使用10-20倍体积的甲醇对树脂混合物进行萃取，保温30-50℃，24-48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物。

(2)将第一部分萃取物的甲醇40℃真空蒸干，粉碎，使用10-20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物。

(3)将第二部分萃取物的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎，使用10-20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心收集沉淀，使用正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物。

其中，上述步骤(3)硅胶柱层析中梯度过程是：维持100％CH₂Cl₂30min，然后经过60min改变为80％CH₂Cl₂和20％CH₃OH，保持120min；检测波长为254nm，，灵敏度为0.2A。

其中，上述步骤(4)分子筛层析中流动相为甲醇，流速为0.8ml/min，检测波长254nm，洗脱时间为170-190min。

其中，上述步骤(5)高效液相分离中使用C18，10μm，250×20mm Shim-packPREP-ODS反相制备柱。

本发明的创造性在于，发现并鉴别了一种新型的二氮芳辛类化合物，并提供了该化合物的发酵制备方法和分离纯化方法，为该化合物的应用和粘细菌资源的开发打下了坚实的基础。

利用本发明的方法，2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛在发酵液中可以达到2mg/L的产量，最终纯化得到的化合物纯度在99％以上。

本发明涉及的二氮芳辛类化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，可用于制备抗肿瘤和抗真菌药物。对于开发用于制备治疗肝癌，宫颈癌，肾癌和白血病的药物，以及制备治疗人、动物和植物真菌感染药物具有重要意义。

(四)附图说明

图1.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的化学结构及原子序数

图2.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的DEPT谱

图3.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的HSQC谱

图4.2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的远程C-H相关示意图(由HMBC谱得出)

(五)具体实施方式

实施例1

下面通过实施例1说明如何实现利用粘细菌发酵获得2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)发酵种子的制备：将一接种铲纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC 25569接种在固体斜面培养基上(KNO₃ 1.0g/L；K₂HPO₄·2H₂O 0.5g/L；MgSO₄·7H₂O2.0g/L；CaCl₂·H₂O 2.0g/L；FeCl₃·6HO 0.5g/L；pH7.5；琼脂15g/L)，32℃培养3天后，接种于100ml液体种子培养基(2.0％葡萄糖，0.2％大豆蛋白胨，0.5％MgSO₄·H₂O，0.5％CaCl₂·H₂O，pH7.2，)，30℃培养5天，得到5×10⁹/ml的菌体细胞。

(2)液体发酵：使用的液体发酵培养基组成为：1.5％马铃薯淀粉，0.8％酵母粉，0.5％MgSO₄·H₂O，0.5％CaCl₂·H₂O，0.005％FeCl₃，3％Amberlite XAD-16，pH为7.5。发酵操作方法为：将制备好的菌体细胞按4L的接种量接种含有40L发酵培养基中，发酵容器为50L自动发酵罐，培养温度为30℃，搅拌转速为45转/min，培养7天。

(3)代谢物的提取和分析：将发酵液中的Amberlite XAD-16树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，从而获得含有2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的发酵产物。

实施例2

下面通过实施例2说明如何实现从粘细菌发酵液中分离纯化获得2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)从发酵液中收集并且分离大孔吸附树脂，可以采用过滤或者离心的方法。

(2)分步萃取：

①使用20倍体积的甲醇对树脂混合物进行萃取，保温45℃，48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物。

②将第一部分萃取物的甲醇40℃真空蒸干，粉碎，使用20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温25℃，48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物。

③将第二部分萃取物的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎，使用20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温20℃，48小时，离心收集沉淀，使用正己烷冲洗沉淀，沉淀作为第三部分萃取物。

(3)硅胶柱层析：将第三部分萃取物进行硅胶柱低压层析，利用甲醇-二氯甲烷进行梯度洗脱，得到部分纯化的硅胶柱层析组分。梯度过程是：维持100％CH₂Cl₂30min，然后经过60min改变为80％CH₂Cl₂和20％CH₃OH，保持120min。检测波长为254nm，，灵敏度为0.2A。

(4)分子筛层析：将硅胶柱层析组分重溶于2倍体积甲醇，按照柱床体积3.5％的体积作为硅胶柱层析加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离。流动相为甲醇或二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm。

(5)高效液相分离：利用高效液相分离该化合物时，使用反相制备柱(C18，10μm，250×20mm)，流动相为甲醇和水。收集后即可获得纯化的2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛化合物。

实施例3

下面通过实施例3说明如何实现利用分步萃取初步分离2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)将1L树脂混合物用5L蒸馏水清洗3次，然后放置于45℃完全干燥，除去水分。

(2)将干燥后的1L树脂混合物转移到50L磨口瓶中，轻轻捣碎大块颗粒，加入20L分析纯甲醇，并缓慢搅拌，使树脂能够较为均匀的悬浮于甲醇中，对进行萃取，保温40℃，48小时。在过程中进场进行振荡，摇匀树脂。过滤去掉树脂，获得约19L第一部分萃取物。

(3)将19L第一部分萃取物分20次转移到3L圆底烧瓶中，放置到旋转蒸发仪上，加热至40℃，将甲醇真空蒸干。将获得的0.2L固体物质用研钵粉碎，转移至10L磨口瓶中，加入4L分析纯二氯甲烷，并缓慢搅拌，使固体颗粒能够较为均匀的悬浮于二氯甲烷中，对进行萃取，保温27℃，48小时。在过程中进场进行振荡，摇匀溶液。1000rpm，20min离心除去沉淀，获得第二部分萃取物。获得约3.5L第二部分萃取物。

(4)将3.5L第二部分萃取物分4次转移到3L圆底烧瓶中，放置到旋转蒸发仪上，加热至30℃，将二氯甲烷真空蒸干。将获得的0.1L固体物质用研钵粉碎，转移至5L磨口瓶中，加入2L分析纯正己烷，并缓慢搅拌，使固体颗粒能够较为均匀的悬浮于正己烷中，对进行萃取，保温20℃，48小时。2000rpm，20min离心收集沉淀。然后，将沉淀转移到漏斗上，缓慢加入0.2L分析纯正己烷冲洗沉淀，干燥沉淀，获得第三部分萃取物。

实施例4

下面通过实施例4说明如何实现利用硅胶柱层析初步纯化2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)硅胶柱色谱属于吸附柱色谱法，是利用各组分吸附剂在与洗脱剂之间的吸附和解吸能力的差异而达到分离的目的。所使用的吸附剂可以是硅胶或者三氧化二铝等物质，所使用的洗脱剂可以是甲醇，二氯甲烷，正己烷，乙酸乙酯，丙酮和正丁烷等溶剂。

(2)色谱柱的准备：柱子的直径为10cm，长度为150cm，比值为1∶15。

(3)吸附剂的准备：选择颗粒直径为70μm的吸附剂硅胶，硅胶使用前应先用甲醇浸泡48小时，再用110℃活化两小时。

(4)湿法装柱：将吸附剂放入小烧杯中，加入二氯甲烷并搅拌，柱中预先加入1/2体积洗脱剂二氯甲烷。打开活塞，缓慢加入硅胶，直到装满整支柱子。

(5)加样：由于进行柱色谱分离的样品在洗脱剂中的溶解度不佳，所以采用固态上样法。

首先将样品溶在适当的溶剂(二氯甲烷)，然后加入约5倍的吸附剂硅胶。将混合物在30~40℃下用旋转蒸发仪蒸干，然后把所得的粉末加到色谱柱的上部。

(6)洗脱：利用甲醇-二氯甲烷依靠重力进行梯度洗脱，得到部分纯化的组分。梯度过程是：维持100％CH₂Cl₂30min，然后经过60min改变为80％CH₂Cl₂和20％CH₃OH，保持120min。

(7)检测与记录：检测波长为254nm，检测仪灵敏度为0.2A，记录仪灵敏度为200mV，走纸速度为6cm/hr。

(8)分离组分的收集：使用自动部分收集器进行分离样品的收集，化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的洗脱时间为130-155min。

实施例5

下面通过实施例5说明如何实现利用分子筛层析进一步纯化2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)Sephadex LH-20的基本参数：颗粒直径为25~100微米；分离的分子量范围：100~4000(乙醇)，100~2000(氯仿)；得水值：4ml/mg干胶。

(2)加热法溶胀Sephadex LH-20凝胶：将悬浮于水中的凝胶逐渐升温至沸腾，经1~2小时可完成溶胀。冷却后，用甲醇反复洗涤，除去水分，减压抽气，除去气泡。

(3)装柱：先在柱中加入三分之一体积的甲醇，仔细检查柱底板，振荡除去气泡，在搅拌下，将烧杯中的凝胶悬浮液倒入，接近倒满。当底板上沉降有1~2cm的凝胶后，打开柱的出口，以中等流速抽出甲醇。不断加入凝胶，使甲醇自然流出，当沉积面距离顶部3~5cm时，停止装柱。

(4)加样量：样品体积等于柱床体积的2~5％。

(5)洗脱：流动相为甲醇，流速为0.8ml/min。

(6)检测与记录：检测波长为254nm，检测仪灵敏度为0.1A，记录仪灵敏度为200mV，走纸速度为3cm/hr。

(7)分离组分的收集：使用自动部分收集器进行分离样品的收集，化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的洗脱时间为170-190min。

实施例6

下面通过实施例6说明如何实现利用高效液相层析获得完全纯化的2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

(1)制备HPLC使用的仪器为Shimadzu LC-6A系统，UV SPD-6AV检测仪和C-R6A进样器。

(2)使用的制备HPLC柱的固定香味C18(10μm)，柱型为250×20mm Shim-pack PREP-ODS柱。

(3)洗脱速度为10ml/min，流动相组成为流动相A(水-0.2％醋酸)和B(甲醇)，进样量为100μl。

洗脱过程为：从100％流动相A经过40min线性梯度转换为40％流动相A和60％流动相B，然后经过10min，线性梯度转换为100％流动相B，维持10min。

(4)检测波长为249nm，使用FRC-10A自动收集器进行收集。

(5)纯化的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的滞留时间为34.67min。

Claims

1.一种新型的二氮芳辛类化合物，其特征是，它是由粘细菌堆囊菌的发酵液中分离制得，分子式为C₂₈H₂₀N₄O₂S₂，名称为2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛，化学结构如下所示：

2.一种利用粘细菌发酵获得权利要求1所述化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其基本步骤是：

(1)发酵种子的制备：将产生菌接种在固体斜面培养基上，28-32℃培养3-7天后，接种子液体种子培养基，28-32℃培养3-7天，得到1-8×10⁹/ml的菌体细胞；

(2)液体发酵：将步骤(1)制备好的菌体细胞，按与发酵液体积比为0.5~1.5∶10的接种量接种于自动发酵罐中，培养温度为30℃，搅拌转速为30-60转/分，培养5-9天；

上述步骤(1)使用的产生菌为粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC25569；

上述步骤(1)使用的固体斜面培养基配方为：

KNO₃ 0.5-1.5g/L；K₂HPO₄·2H₂O 0.5-1.0g/L；MgSO₄·7H₂O 1.0-2.0g/L；CaCl₂·H₂O1.0-2.0g/L；FeCl₃·6HO 0.1-0.5g/L；pH6.5-7.5；琼脂15g/L；

上述步骤(1)使用的液体种子培养基配方为：

1.0-2.0％葡萄糖，0.2-1.0％大豆蛋白胨，0.1-0.5％MgSO₄·H₂O，0.1-0.5％CaCl₂·H₂O，pH7-7.5；

上述步骤(2)使用的液体发酵培养基配方为：

3.如权利要求2所述的利用粘细菌发酵获得2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其特征是，液体发酵培养基配方中添加的大孔吸附树脂是指Amberlite XAD-16大孔吸附树脂。

4.一种从粘细菌发酵液中分离提取权利要求1所述的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其步骤是：

(1)采用过滤或者离心的方法，从发酵液中收集并且分离大孔吸附树脂；

(2)分步萃取：分别使用甲醇，二氯甲烷和正己烷进行三步萃取处理；

(3)硅胶柱层析：将第三步萃取物进行硅胶柱低压层析，利用甲醇-二氯甲烷进行梯度洗脱，洗脱时间为130-155分钟，得到硅胶柱层析纯化的组分；

(4)分子筛层析：将硅胶柱层析纯化的组分重溶于2-4倍体积甲醇，进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20分子筛柱层析分离，流动相为甲醇或二氯甲烷；

(5)高效液相分离：利用高效液相分离该化合物时，使用反相柱，流动相为甲醇和水，收集后即可获得纯化的权利要求1所述化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛。

5.如权利要求4所述的一种从粘细菌发酵液中分离提取权利要求1所述的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其特征在于，步骤(2)分步萃取的具体方法为：

(1)使用10-20倍体积的甲醇对树脂混合物进行萃取，保温30-50℃，24-48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；

(2)将第一部分萃取物的甲醇40℃真空蒸干，粉碎，使用10-20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物；

6.如权利要求4所述的一种从粘细菌发酵液中分离提取权利要求1所述的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其特征在于，步骤(3)硅胶柱层析中梯度过程是：维持100％CH₂Cl₂ 30min，然后经过60min改变为80％CH₂Cl₂和20％CH₃OH，保持120min；检测波长为254nm，，灵敏度为0.2A。

7.如权利要求4所述的一种从粘细菌发酵液中分离提取权利要求1所述的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其特征在于，步骤(4)分子筛层析中流动相为甲醇，检测波长254nm，流速为0.8ml/min，洗脱时间为170-190min。

8.如权利要求4所述的一种从粘细菌发酵液中分离提取权利要求1所述的化合物2，6-二-(6-巯基-3-吡啶)-4，8-二-(4-苯酚)-[1，5]-二氮芳辛的方法，其特征在于，步骤(5)高效液相分离中使用C18，10μm，250×20mm Shim-pack PREP-ODS反相制备柱。