CN1222190A - 在发酵中增加细胞产量的营养培养基 - Google Patents
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Abstract
提供了一种发酵中使用的营养培养基来提高细胞或有机体的产量。提供的配方与已知培养基相比使真菌大链壶菌(Lagenidium giganteum)的产量增加了2到3倍。
Description
本发明所属领域
本发明涉及在发酵中使用的新的培养基，与已知培养基相比，它提供了增加的细胞产量。更特别地，与用已知培养基得到的产量相比，本发明引起真菌大链壶菌(Lagenidium giganteum)的产量至少2到3倍的增加。除了增加细胞的产量，在含卵磷脂的新培养基中生长的大链壶菌表现出提高了抵抗蚊的效力。
发明背景
发酵是在专门容器中培养微生物或细胞的工序。细胞或微生物可以被纯化并用于一系列的目的。举例来说，在发酵罐中生长的真菌大链壶菌用来作为蚊的生物控制剂。
在发酵过程中微生物的最佳生长依赖于几个因素，包括可用的营养物，氧气浓度，pH，温度，和混合度。在发酵过程中使用的培养基提供了细胞生长的必须营养。因此，从发酵中得到的产量部分地依赖于培养基的组成。
现在有几种发表的通常用于大链壶菌发酵的营养培养基。所有培养基用去离子水加至终浓度为1L，并灭菌。一种配方包括2.0g Ardamine,2.0g葡萄糖，1ml玉米油，0.5g胆固醇和2mMCa2+(Kerwin,James L，和Washino,Robert k.(1986)“大链壶菌(卵菌纲：壶菌目)有性和无性阶段在地下和地上控制蚊虫的应用。”J.Am.Mos.Control Assoc.2(2):182-189]。
另一种配方包括2.0g自溶酵母抽提物，1.0gProFlo,0.5g鱼粉，2mM CaCl2·2H2O,1mM MgCl2·6H2O,0.05g胆固醇和2ml棉籽油〔Kerwin,James L.和Washino,Robert K.(1988)“大链壶菌(卵菌纲：壶菌目)的田间评估和涉及一种新的真菌分离物的天然动物流行病的描述。”J.Med.Entomol.25(6):452-460]。而另一种发酵培养基包括1.25g葡萄糖，1.25g蛋白胨，1.25g自溶酵母提取物，2g玉米油，1g亚麻籽油，和0.075g CaCl2·2H2O(美国专利号：4,687,744)。第四种公开的培养基包括1.25g酵母抽提物，1.2g葡萄糖，3.2g小麦胚粉末，大麻种子抽提物来提供每L 250mg可溶的蛋白，1.25细菌蛋白胨，3g葡萄糖和1.5g玉米油〔Lord,Jeffrey C.和Roberts,Donald W.(1986)“培养基品质和宿主传代对大链壶菌(卵菌纲：壶菌目)的游动菌丝发生和感染性的影响”，无脊椎动物病理学杂志48:35-361〕。
当在发酵中使用时，上面引述的公开的培养基配方都产出大约相同数量的细胞并且以大约相同速率感染敏感的蚊虫。因此为了提高生物控制剂如大链壶菌的产量和感染性，需要一种改进的发酵培养基。
发明概述
在发酵时使用的培养基每升必须含有3.6g蛋白胨；3.0g自溶酵母抽提物；3.6g蛋白胨；1.5到3.0g自溶酵母抽提物；1.6g棉籽粉，如ProFlo(Traders Protein,Memphis,TN)；2.0到7.75g葡萄糖(右旋糖)；2.5g棕榈油；0.2g胆固醇；0.6g CaCl2·2H2O,0.2gMgCl2·6H2O和可选择地0.0到2.0g卵磷脂。此培养基与现有技术的培养基相比，提供了更高的大链壶菌的产量，并且当培养基中包含了卵磷脂时，有机体的产量和感染性进一步增加。优选实施方案的描述
本发明涉及发酵用的改进的培养基。此培养基增加的产量至少超过已知培养基大约2到3倍。本发明在大量生产大链壶菌(对蚊虫的生物控制剂)中有用。
定义
如在此使用的，术语“发酵”是指在专门容器中培养细胞或微生物的工序。“营养培养基”(“培养基”)是指支持有机体生长的固体或液体物质。
在本发明优选实施方案中，营养培养基按如下制备：
每升3.6g蛋白胨；
每升1.5至3g自溶酵母抽提物；
每升1.6g棉籽粉；
每升2.0至7.75g葡萄糖(右旋糖)；
每升2.5g棕榈油；
每升0.2g胆固醇；
每升0.6g CaCl2·2H2O；和
每升0.2g MgCl2·6H2O。
加入去离子水至终体积为1升，并且调节pH到6.5。加热这些成分直到溶解，然后培养基在121℃,15p.s.i.高压消毒灭菌30分钟。当用于大链壶菌的发酵时，此培养基增加的产量至少超过已知培养基2到3倍。
在另一个优选的实施方案中，营养培养基通过加入每升2.0g卵磷脂到上述配方中制备。
以下的实施例仅仅用来作为说明的目的，不能用来在任何方面限制本发明。实施例1大链壶菌在不同培养基中摇瓶生长率的比较
在并列的摇瓶实验中在新营养培养基中的生长率与两种其它培养基的比较。
培养基#1：
1.25g葡萄糖(右旋糖)
1.25g蛋白胨
1.25g自溶酵母抽提物
2.0g玉米油
1.0g棕榈油
0.03g胆固醇
0.4g CaCl2·2H2O
0.2g MgCl2·6H2O
培养基#2：
1.2g蛋白胨
1.2g自溶酵母抽提物
3.0g葡萄糖(右旋糖)
0.5g胆固醇
新营养培养基：
3.6g蛋白胨
3.0g自溶酵母抽提物
1.6g Proflo棉籽抽提物
2.0g葡萄糖(右旋糖)
2.5g棕榈油
0.2g胆固醇
0.6g CaCl2·2H2O
0.2g MgCl2·6H2O
当制备每一种培养基时，所有的成分混合并加入去离子水至终浓度为1L。调节pH值到6.5。内容物在微波炉中加热直到溶解，在121℃，15psi灭菌30分钟。对于每一种培养基，9个250ml培养瓶中每个加入50ml培养基。从培养皿中取出的一盘大链壶菌(加利福尼亚菌株)用来接种每一个培养瓶。培养瓶在轨道温度控制摇床中于120rpm,29℃震荡培养7天。通过在18℃,5200rpm离心真菌团20分钟收获细胞。离心的细胞团称重并且细胞计数通过血细胞计数器进行。记录平均细胞数，结果总结于表1中。
表1
| 培养基#1 | 培养基#2 | 新营养培养基 | 使用新的培养基时每ml细胞量增加的倍数 | |
| 实验#1 | 1.2-2.0×106细胞/mL | 1.2-2.0×106细胞/mL | 4.4×106细胞/mL | 2.2倍 |
| 实验#2 | 6.25×105细胞/mL | 7.5×105细胞/mL | 1.38×106细胞/mL | 1.84-2.2倍 |
| 实验#3 | 2.97×105细胞/mL | 3.3×105细胞/mL | 4.75×105细胞/mL | 1.4-1.6倍 |
| 实验#7 | 9.77×104细胞/mL | 未做 | 9.38×105细胞/mL | 9.6倍 |
| 实验#8 | 1.93×105细胞/mL | 未做 | 7.30×105细胞/mL | 3.7倍 |
培养基#1和#2在每一个实验中产生的每ml培养基中的细胞量大约相同。与或者培养基#1或者培养基#2相比较，新营养培养基始终连贯地增加每ml中的细胞量。当生长在新营养培养基中时，大链壶菌的平均产量增加大约3.5倍。实施例2：新培养基加入卵磷脂后摇瓶培养比较
实施例1中的新培养基配方的建立提高了超过已知培养基的细胞产量，在基础的新培养基上变化葡萄糖和酵母抽提物的量和加入1.0g或2.0g卵磷脂的影响得到检测。所有培养基用很大的磁转子在70％转速下混匀10-15秒，以确保所有组分溶解。用EmReagents color phast将所有培养基的pH调节到6.5，并如实施例1中灭菌。对每一种培养基，三个250ml培养瓶装入50ml培养基，如实施例1中描述的接种，培养并收获。结果总结于表2和表3中。
表2
| 葡萄糖％重量 | 酵母抽提液％重量 | 卵磷脂％重量 | 细胞产量(细胞/mL) | |
| 0.8750 | 0.1250 | 0.0000 | 2.0×105 | 没有卵磷脂的平均细胞产量(细胞/ml):3.6×105 |
| 0.8750 | 0.1250 | 0.0000 | 3.0×105 | |
| 0.6875 | 0.3125 | 0.0000 | 4.8×105 | |
| 0.5000 | 0.5000 | 0.0000 | 4.1×105 | |
| 0.5000 | 0.5000 | 0.0000 | 4.13×105 | |
| 0.5875 | 0.3125 | 0.1000 | 5.4×105 | 有卵磷脂的平均细胞产量(细胞/ml):4.63×105 |
| 0.5875 | 0.3125 | 0.1000 | 4.05×105 | |
| 0.3000 | 0.5000 | 0.2000 | 7.4×105 | |
| 0.3000 | 0.5000 | 0.2000 | 4.9×105 | |
| 0.6750 | 0.1250 | 0.2000 | 4.5×105 | |
| 0.6750 | 0.1250 | 0.2000 | 4.1×105 | |
| 0.4875 | 0.3125 | 0.2000 | 3.6×105 |
如表2中所示的，对于没有卵磷脂的培养基，每ml中平均细胞产量为3.6×105，对于有卵磷脂的培养基，每ml中细胞产量增加到4.63×105。实施例3生长在不同培养基中的大链壶菌的感染性
大链壶菌在实施例2中描述的新培养基中生长，培养基中不包括卵磷脂，包括重量比为0.1000％的卵磷脂或重量比为0.2000％的卵磷脂。培养条件如实施例1中所述。细胞浓度得到计算，并且它们杀死蚊虫的能力在浓度为5,000；2,500；1,250和675细胞/ml时测量。总结在表3中的结果是重复实验的平均值。
表3
| 死亡率(％)于5,000细胞/mL时 | 死亡率(％)于2,500细胞/mL时 | 死亡率(％)于1,250细胞/mL时 | 死亡率(％)于675细胞/mL时 | |
| 不合卵磷脂的培养基 | 66 | 67 | 61 | 51 |
| 含卵磷脂的培养基 | 87 | 87 | 89 | 74 |
这些结果说明生长在新培养基中的大链壶菌比生长在不加卵磷脂的培养基中的细胞杀死了更多的蚊子。
Claims (4)
1．一种用于发酵的培养基，必须含有以下成分：
(a)每升3.6g蛋白胨；
(b)每升1.5至3g自溶酵母抽提物；
(c)每升1.6g棉籽粉；
(d)每升2.0至7.75g葡萄糖(右旋糖)；
(e)每升2.5g棕榈油；
(f)每升0.2g胆固醇；
(g)每升0.6g CaCl2·2H2O；和
(h)每升0.2g MgCl2·6H2O。
2．根据权利要求1所述的培养基，进一步包含每升多达2.0g卵磷脂。
3．根据权利要求1所述的培养基，用于培养大链壶菌。
4．根据权利要求2所述的培养基，用于培养大链壶菌。
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|---|---|---|---|---|
| CN105101776A (zh) * | 2013-03-28 | 2015-11-25 | 诺维信生物农业公司 | 用于增强微生物稳定性的组合物和方法 |
| CN105886412A (zh) * | 2016-05-12 | 2016-08-24 | 中山大学 | 一种冬虫夏草菌的液体发酵培养基 |
| CN107711892A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-23 | 苏晓庆 | 一种真菌灭蚊剂及配制方法 |
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1997
- 1997-06-17 CN CN 97193075 patent/CN1222190A/zh active Pending
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| CN105101776B (zh) * | 2013-03-28 | 2019-04-02 | 诺维信生物农业公司 | 用于增强微生物稳定性的组合物和方法 |
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