CN1120237C - 遗传工程固氮粪产碱菌与固氮巨大芽孢杆菌共培养发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用固氮巨大芽孢杆菌和遗传工程改造的固氮粪产碱菌株共培养发酵的工艺，以及共培养发酵营养液配方，从而大幅度提高混合发酵液的IAA分泌量、耐铵能力和固氮活性，与传统的单菌株发酵工艺相比，本工艺的两大特点是采用经遗传工程改造的工程固氮菌和利用了共培养技术的混合增效作用。本工艺可望生产新一代多功能多菌株的遗传工程菌肥，在绿色农业生产上具有广泛的应用前景。

Description

遗传工程固氮粪产碱菌与固氮巨大芽孢杆菌共培养发酵工艺
本发明涉及利用工程固氮粪产碱菌株和固氮巨大芽孢杆菌一起共培养发酵的工艺，及其共培养发酵营养发酵配方，从而大幅度提高混合发酵液的IAA分泌量、耐铵能力和固氮活性。
联合固氮菌兼具固氮和促进植物生长的双重功能，能通过固定空气中的氮素(类似一个微型生物氮肥厂)、分泌植物激素(刺激根系和植株的生长发育)、对常见病虫害的广谱抑制或拮抗作用达到节肥增产的目的。但直接分离自土壤的野生固氮菌株IAA合成能力也较低，在环境中存在NH4 +时不能固氮，此外，接种土壤后的竞争能力低，接种效益不显著。上述弱点大大限制了固氮菌肥在绿色农业生产中的应用。
针对上述问题，本工艺与传统的菌株发酵工艺相比有两个显著特点：一是采用经遗传工程改造的工程固氮菌株以克服野生菌株上述固有的弱点；二是利用共培养技术的混合增效作用以增强发酵菌剂在生产应用中的增产节肥效果。现详述如下：
(1)本工艺所采用的菌株均具有独特的优良性状，如固氮巨大芽孢杆菌BM101抗逆性强，胞外分泌物丰富，芽孢存活时间长，该菌株分离自我国北方水稻土壤，经中国科学院微生物所鉴定，结果已正式发表，菌株现保存于中国农业科学院土壤肥料研究所菌种保藏中心。
固氮粪产碱菌A1501分离自我国南方水稻根际土壤，经中国科学院微生物所鉴定，结果已正式发表，参见1995年“农业生物技术学报”，第3卷，第1期，第34-41页，菌株现保存于中国农业科学院土壤肥料研究所菌种保藏中心。该菌株经遗传工程手段改造，获得以下两株工程固氮菌株AC1541(参见1995年“农业生物技术学报”，第3卷，第1期，第34-41页的论文中的菌株A1523)和和AI1581(参见“农业生物技术学报”，1998年增刊第80页的论文中的菌株AT63)。工程菌AC1541基因组中整合了组成型表达的固氮正调节基因nifA和一般氮代谢调节基因ntrC，在上述两正调节基因产物的协同作用下，消除了铵对固氮基因表达的抑制作用，工程菌在铵存在条件下保持较高的固氮活性和根表定植能力，而在相同条件下野生型则丧失了这种耐铵能力；工程固氮菌株A1581经Tn5转座子诱变获得，能高水平合成植物生长刺激素IAA，分泌量为野生型A1501的2倍。
(2)本工艺通过三株菌共培养发酵24小时，混和发酵液培养后的IAA分泌能力，耐铵能力和固氮活性均高于单菌株纯培养物，表现出明显的混合增效特性。因此，采用本工艺可望获得新一代多功能多菌株的遗传工程菌肥。
本工艺所采用的三株菌的培养成分和培养条件如下：
(1)菌种培养基(15磅、121℃灭菌30分钟，下同)
KH2PO4          0.4克  K2HPO4     0.1克     NaCl                 0.1克
MgSO4.7H2O      0.2克  MnSO4.H2O   0.01克    Fe2(SO4)3.H2O  0.01克
Na2MoO4.2H2O  0.01克 苹果酸        1.0克     (NH4)2SO4        0.4克
色氨酸            1.0克  蒸馏水        1000毫升  pH6.8
30℃培养12-24小时。工程菌AC1541和AI1581培养时添加50微克/毫升的卡那霉素。在液体培养基中加1.2-1.5％琼脂即配制固体斜面或平板
(2)种子培养基
KH2PO4     0.4克    K2HPO4 0.1克    MgSO4.7H2O  0.2克
(NH4)2SO40.4克    NaCl      5克      KCl            1.0克
蔗糖         1.0克    乳酸钠    1.0克    色氨酸         1.0克
蛋白胨       2克      酵母膏    5克
蒸馏水       1000毫升           pH6.8
置于180-200转/分恒温旋转摇床，30℃培养24小时。工程菌AC1541和AI1581培养时添加50微克/毫升的卡那霉素。
(3)共培养发酵培养基
KH2PO4     0.4克    K2HPO4   0.1克    MgSO4.7H2O  0.2克
(NH4)2SO40.4克    苯甲酸钠    1.0克    KCl            1.0克
蔗糖         1.0克    乳酸钠      1.0克    色氨酸         1.0克
蛋白胨       2克      NaCl        5克
酵母膏       5克      蒸馏水      1000毫升
pH6.8        置于180-200转/分恒温旋转摇床，30℃培养24小时。
三菌株分别在菌种培养基固体平板上30℃静置培养12-24小时，挑单菌落分别接种于3个盛90-150毫升种子培养基的500毫升摇瓶中，置于180-200转/分恒温旋转摇床，30℃单菌株纯培养24小时后，以6-15％总接种量(三株菌各接种30-50毫升)转入盛0.9-1.5升发酵培养基的5升摇瓶中，置于180-200转/分恒温旋转摇床，30℃多菌株共培养24小时。
经检测，共培养发酵液中每毫升含活菌数约1010-1011个菌；100毫升含活性物质(包括作物生长刺激物质如IAA等)＞50微克；1毫升二次培养后的固氮活性＞50nmol还原的C2H2/小时，在高铵下(15mM铵)能保持无铵条件下固氮活性的50％。中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所大鼠经口急性毒性测试，经本工艺生产的发酵液属实际无毒物质；发酵液中铅、汞、砷和镉等重金属含量低于农业部发布的《微生物肥料》(NT227-94)中所规定的指标，发酵菌剂在田间的应用不会对土壤造成重金属污染。
图1示固氮巨大芽孢杆菌BM101(I)和固氮粪产碱菌A1501(II)在菌种培养基固体平板上的生长
图2示固氮巨大芽孢杆菌BM101和2株工程固氮粪产碱菌AC1541和AI1581共培养发酵液倍比稀释和涂LB培养基平板培养后的单菌落形态。白色菌落为BM101；棕褐色小菌落为AC1541或AI1581(工程菌单菌落形态均与野生型无差异)。其中所用的LB培养基为：
蛋白胨       10克            NaCl           10克
酵母膏       5克             琼脂           1.2-1.5％
蒸馏水       1000毫升        pH6.8
30℃静置培养24小时
                           实施例1
采用固氮巨大芽孢杆菌BM101和2株工程固氮粪产碱菌AC1541和AI1581共培养发酵，其培养条件为：
(1)菌种培养基(15磅、121℃灭菌30分钟，下同)
KH2PO4         0.4克    K2HPO4     0.1克    NaCl                 0.1克
MgSO4.7H2O     0.2克    MnSO4.H2O  0.01克   Fe2(SO4)3.H2O   0.01克
Na2MoO4.2H2O 0.01克   苹果酸        1.0克    (NH4)2SO4         0.4克
色氨酸           1.0克    琼脂          1.5％
pH6.8                     蒸馏水        1000毫升
30℃培养24小时。工程菌AC1541和AI1581培养时添加50微克/毫升的卡那霉素。
(2)种子培养基
KH2PO4       0.4克    K2HPO4   0.1克   MgSO4.7H2O   0.2克
(NH4)2SO4   0.4克    NaCl        5克     KCl            1.0克
蔗糖            1.0克    乳酸钠      1.0克   色氨酸         1.0克
蛋白胨          2克      酵母膏      5克
蒸馏水          100毫升              pH6.8
置于200转/分恒温旋转摇床，30℃培养24小时。工程菌AC1541和AI1581培养时添加50微克/毫升的卡那霉素。
(3)发酵培养基
KH2PO4     0.4克    K2HPO4   0.1克    MgSO4.7H2O  0.2克
(NH4)2SO40.4克    苯甲酸钠    1.0克    KCl            1.0克
蔗糖         1.0克    乳酸钠      1.0克    色氨酸         1.0克
蛋白胨       2克      NaCl        5克
酵母膏       5克     蒸馏水        1000毫升
pH6.8        置于200转/分恒温旋转摇床，30℃培养24小时。
1株固氮巨大芽孢杆菌BM101和2株工程固氮粪产碱菌AC1541和AI1581分别在菌种培养基固体平板上30℃静置培养24小时，挑单菌落分别接种于3个盛150毫升种子培养基的500毫升摇瓶中，置于200转/分恒温旋转摇床，30℃单菌株纯培养24小时后，以10％接种量(三株菌各接种50毫升)转入盛1.5升发酵培养基的5升摇瓶中，置于200转/分恒温旋转摇床，30℃多菌株共培养24小时。
                           实施例2
表1 工程菌与野生型某些生物学特性的比较
特性 野生型A1501     耐氨工程菌AC1541     促生工程菌A1581
固氮活性(无氮条件下)nmol乙烯/毫克蛋白/分固氮活性(15mM铵)nmol乙烯/毫克蛋白/分IAA分泌能力微克/毫升 98.0±5.6％     120±9.3             111.6±4.2(100％)         (125％)*4.6±2.1        38.4±6.6            3.2±1.4(4.7％)**      (32％)**3.9±0.8        5.5±1.7             8.2±1.0(100％)                              (210％)*
*：以野生型为100％进行比较
**：以无氮条件下的固氮活性为100％进行比较
表2 共培养发酵液与单菌株纯培养液某些生物学特征的比较
特性  共培养发酵液      BM101        AC1541       AI1581
固氮活性(无氮条件下)*nmol 乙烯/毫克蛋白/分固氮活性(15mM铵)*nmol 乙烯/毫克蛋白/分IAA分泌能力微克/毫升   68.4±2.5     46.3±10.1     55.2±3.6    50.1±7.337.0±3.7     4.3±0.6       31.4±4.8    5.9±3.913.2±1.2     6.2±0.8       4.7±2.3     9.3±2.8
*1毫升菌液二次培养的固氮活性
表3  田间小区试验中共培养发酵液对水稻的促生作用及增产效益
测定项目 共培养发酵液 BM101 AC1541  AI1581  非接种对照
株高(cm)实际产量(千克/亩)增产率    93.6      93.0   92.8    93.3      90.7477.8     453.3  465.8   451.5     437.99.1       3.5    6.4     3.1       /
表4  共培养发酵液施用几种蔬菜的增产效益
                            蔬菜品种
黄瓜  西红柿  秋白菜    茄子    白萝卜  大葱    豆角  莴苣
增产率(％) 23％   19％   16.8％    10.7％  23.1％  30.2％  24％  21.2％

Claims (2)

1.一种共培养发酵工艺，其特征在于将固氮巨大芽孢杆菌BM101和经过遗传工程改造的固氮粪产碱菌AC1541、AI1581.菌株接种于共培养发酵营养液中，置于恒温旋转摇床，28℃-30℃，培养20-28小时.
2.根据权利要求1所述的共培养发酵工艺，其特征在于所述的共培养发酵营养液配方是磷酸二氢钾0.4克   磷酸氢二钾0.1克    氯化钠5.0克氯化钠1.0克       七水硫酸镁0.2克    硫酸铵0.4克色氨酸1.0克       蔗糖1.0克          乳酸钠1.0克蛋白胨2.0克       酵母膏5克          苯甲酸钠1.0克蒸馏水1000毫升    PH6.8
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