CN1217700C - 抗肿瘤的多药耐药rna干扰药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，提供了一组针对耐药基因mdr-1和P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的抗白血病和其它肿瘤的治疗药物的干扰RNA的核苷酸序列，具有靶向性抗肿瘤细胞多药耐药(mdr-1)基因和P-糖蛋白(P-gp)表达及功能，提高白血病细胞对常规化疗药的敏感性，增强化疗药物杀灭造血系统恶性肿瘤细胞的作用。

Description

抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物
技术领域
本发明涉及抗肿瘤的药物，尤其是抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物。
背景技术
多药耐药(multidrug resistance，MDR)是白血病等恶性肿瘤常规化疗难以获得长期缓解的重要障碍。研究表明，由mdr-1基因编码的p-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在肿瘤细胞表面过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药主要机制，也是逆转耐药的良好靶点。目前已经报道的能逆转MDR的药物有数十种之多，但有效药物浓度下毒性较大，产生严重不良反应，限制了其临床应用。因此针对mdr-1基因及其蛋白进行靶点治疗是国内外白血病多药耐药逆转研究的热点。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它采用与目的基因同源的21-23核苷酸长的干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体(RISC)，RISC以siRNA为模板特异地识别其同源基因mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，细胞表现特定基因的缺陷表型。该策略可以将癌症基因关闭，而仅有一个碱基突变则丧失RNA干扰作用，对正常细胞影响甚微，特异性强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，采用RNAi技术，在mRNA水平针对mdr-1基因的siRNA对多药耐药细胞系细胞耐药表型进行逆转，能有效抑制多药耐药基因mdr-1的表达。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdr-1及其表达蛋白进行靶点治疗，具有靶向性抗肿瘤细胞多药耐药mdr-1基因和P-糖蛋白表达及功能，干扰RNA序列是针对mdr-1基因mRNA不同位点选取的3段21个碱基的siRNA序列，称之为si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3，所述RNA干扰药物包含si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列为：
si-mdr1：     CUGUACUGGUCCAUACGGAUU
            UUGACAUGACCAGGUAUGCCU
si-mdr2：      CGCCGAGGCUAUGUACCAAUU
              UUGCGGCUCCGAUACAUGGUU
si-mdr3：    CCUCCGGUUGUAUGUACGGUU
          UUGGAGGCCAACAUACAUGCC
所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位点为：si-mdr1的革巴位点：5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的革巴位点：5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的革巴位点：5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)
给药途径可采用：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法中的一种。
本发明研制的siRNA能有效抑制多药耐药基因MDR-1的表达，为RNAi技术应用于白血病的治疗提供了实验证据和有效新药。
附图说明
图1是本发明siRNA处理24h后K562/A02细胞mdr-1的PCR扩增产物电泳图。
图2是本发明siRNA处理对P-gp表达的影响的结果。
图中，1：si-neg组；2：si-mdr1组；3：si-mdr2组；4：si-mdr3组；5：PCR阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物作进一步的详细说明：
本发明采用RNAi技术，在mRNA水平针对mdr-1基因的siRNA(smallinterfering RNA，siRNA)对多药耐药细胞系K562/A02细胞耐药表型进行逆转。K562细胞系是来自红白血病患者的细胞系，而K562/A02细胞系经多次筛选的耐阿霉素(ADM)的细胞系。
本发明所涉及的siRNA序列是针对mdr-1基因mRNA不同位点选取的3段21个碱基的siRNA序列，称之为si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3。另设随机序列作为阴性对照(si-neg)。siRNA序列如下：si-mdr1的靶位点：5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)
     si-mdr1：    CUGUACUGGUCCAUACGGAUU
              UUGACAUGACCAGGUAUGCCU
si-mdr2的靶位点：5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)
  si-mdr2：      CGCCGAGGCUAUGUACCAAUU
             UUGCGGCUCCGAUACAUGGUU
si-mdr3的革巴位点：5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)
si-mdr3：               CCUCCGGUUGUAUGUACGGUU
               UUGGAGGCCAACAUACAUGCC
si-neg：          5’-AATAGGATACGTGACGCTATG-3’
                  UCCUAUGCACUGCGAUACUU
               UUAGGAUACGUGACGCUAUG
本发明所用的K562/A02细胞系是耐阿霉素(ADM)红白血病的细胞系。细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司产品)培养液，置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。优化转染条件，分别将si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3、si-neg以200nmol的终浓度加入K562/A02细胞培养液，于孵育后24～48h收获细胞进行检测。
本发明从mRNA和蛋白质水平二个层次来检测si-mdr1、si-mdr2和si-mdr3抑制多药耐药基因表达以及提高耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性的作用。mRNA的检测采用RT-PCR和PCR产物定量分析。技术路线：1)RT-PCR：按TRIzol总RNA抽提试剂盒提取总RNA。电泳鉴定RNA的质量，紫外光分光光度计定量。取总RNA 2.5μg，加入50μl逆转录反应体系，用SuperScriptTMII逆转录试剂盒(购自Invitrogen公司)，按说明书操作进行逆转录。PCR反应体系按常规(试剂购自Invitrogen公司)。循环条件：94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸10分钟。
另以β-actin的扩增产物为内参对照。扩增引物序列及扩增片段如下：
mdr-1    上游引物：5‘-TTACACGTGGTTGGAAGC-3’
         下游引物：5‘-CATAGATCAGCAGGAAAG-3’，扩增片段300bp。
β-actin 上游引物：5-’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’
         下游引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3’，扩增片
段548bp。
PCR产物定量：取10μl的扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，以PCR mark(华美公司)作为分子质量标准，电压100V，20分钟。溴化乙锭染色，紫外反射仪上显像、照相。用扫描分析进行目的基因的半定量(以mdr-1/β-actin cDNA的比值反映mdr-1 mRNA的表达水平)。
多药耐药基因mdr-1表达水平的检测采用流式细胞术，检测P-gp的表达。收集48h的各组K562/A02细胞，PBS洗涤2次，加入P-gp单抗10μ1(Neomarkers公司产品)，4℃，30分钟；PBS洗涤，加FITC标记的二抗，4℃，30分钟。PBS洗涤，上机检测。
本发明采用MTT检测阿霉素对药物处理白血病细胞和对照K562细胞的半数抑制剂量IC50，用相对逆转效率为评价指标，相对逆转效率＝(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)。IC50A是K562/A02的IC50，IC50B是siRNA作用后的IC50，IC50C是K562的IC50；抵抗因子RF＝K562/A02的IC50/K562的IC50。
本发明还用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素积累的测定，将经RNAi处理的细胞调成1×106/ml与1g/ml的柔红霉素共同孵育于37℃，1小时后取出，冰浴以终止柔红霉素的作用。用流式细胞仪检测细胞内柔红霉素激发的荧光强度，来反映DNR在细胞内的浓度，激发波长488nm，发射波长550nm。用未经处理的K562/A02细胞为空白对照。
针对mdr-1基因及其蛋白进行靶点治疗是国内外白血病多药耐药逆转研究的热点，现在常用的逆转剂维拉帕米、环胞菌素A等在有效逆转耐药时的浓度对人体产生严重不良反应，限制了其临床应用。由于本发明使用的RNAi有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤的基因治疗方面均具有广阔的应用前景。
本发明根据Elbashir等的siRNA user guide设计原则，针对mdr-1基因不同靶位点设计了3条干扰siRNA序列，用以逆转白血病多药耐药细胞株的MDR。K562/A02是具有典型多药耐药特征的慢性粒细胞白血病急变细胞系，高表达mdr-1基因。IC50、细胞内药物浓度、p170表达及mRNA相对量检测证实3条序列能不同程度的封闭mdr-1基因，逆转细胞耐药表型。这些发明证实siRNA可望成为逆转肿瘤耐药的有效手段。发明的siRNA可以单独使用或几条siRNA联合，还可以与其它逆转剂如反义核酸联合制成药物组合物，用于白血病和其它肿瘤的治疗。
上述基因序列的给药途径，可使用的方法有以下几种：
1、直接裸DNA注射法
(1)新喷气注射系统释放裸DNA治疗序列，可以采用一种新的喷气注射系统，将裸DNA释放到体内的肺肿瘤中。沃尔瑟(W.Walther)博士和同事开发了一种便携的“高速喷气注射器”系统，在病毒媒介和脂质体基因释放系统之外提供了又一选择。研究者使用这种系统注射3段裸DNA到小鼠的Lewis肺肿瘤中，第一个质粒表达β-半乳糖激酶基因(LacZ)，第二个表达绿荧光(GFP)基因，第三个表达人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。每个小鼠都接受5次注射，压力为3Pa，释放3～5微升质粒DNA。沃尔瑟博士等在《基因治疗》(Gene Therapy)报告说，注射后肿瘤上的基因呈广泛表达。LacZ和GFP基因表达在注射后48小时变得明显，在72～96小时达到峰值；LacZ表达和TNF-α分泌在24～120小时出现。他们认为，“这些发现证明了喷气注射的适用性，即在体内传送基因到肿瘤时使用最小剂量的裸DNA进行癌症基因治疗。”
(2)裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。
2、脂质体包裹DNA直接注射法：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。
3、金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。
4、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。即：可口服的减毒沙门氏菌。
实施例1.RNAi对耐药基因mdr-1 mRNA表达的情况
K562/A02细胞经siRNA处理24h后检测，与阴性对照相比，si-mdr1组mRNA表达下调(17.23±2.47)％(p＞0.05)，si-mdr2和si-mdr3处理24小时后检测mdr-1的mRNA表达明显减少，分别为(38±1.23)％和(58±1.54)％(p＜0.05)，见图1。
实施例2.P-gp表达检测
siRNA作用48h后流式细胞仪检测表明，三组不同程度上抑制p170的表达，si-mdr1作用组p170表达的阳性率由处理前的(76.0±1.03)％，降至处理后的(56.72±1.41)％，si-mdr2作用组降至(42.70±1.17)％(p＜0.05)；而si-mdr3作用组p170表达的阳性率显著降低，为(19.57±1.94)％(p＜0.01)。si-neg实验组处理前后p170表达阳性率无明显改变：处理前(76.0±1.03)％，处理后(74.6±0.75)％(p＞0.05)，见图2。
RNAi处理后K562/A02细胞药物敏感性变化：IC50指细胞抑制率为50％时化疗药物的浓度，由表1可知si-mdr2和si-mdr3作用后，K562/A02对化疗药物ADM的敏感性增加，提示RNAi可以恢复K562/A02对化疗药物的敏感性。
实施例3.siRNA对K562/A02细胞耐药的逆转作用
表1为siRNA对K562/A02细胞耐药的逆转作用的结果比较。每个实验重复3次，每次设3个平行孔，取均值。si-mdr1，si-mdr2和si-mdr3均有多药耐药逆转作用，si-mdr3的作用最为显著。
表1
            IC50(μg/ml)      相对逆转效率
                                   (％)
K562           0.05                /
K562/A02       4.47                /
si-neg         4.28                4.29
si-mdr1        3.67                18.10
si-mdr2        2.53*               43.89
si-mdr3        1.36**              70.36
注：与K562/A02细胞组相比较，p值：*＜0.05，**＜0.01。
实施例4.RNAi处理后细胞内DNR积累的变化
用si-mdr处理K562/A02和K562细胞，发现K562/A02细胞内DNR较处理前其荧光强度和阳性率均有增加的趋势，且有显著性差异。但与亲代细胞K562相比，荧光强度和阳性率仍较低，见表2。
表2：si-RNA处理后细胞内ADM积累变化
            平均荧光强度        阳性率(％)
K562           86.35              97.18
Si-neg         37.66              27.76
si-mdr1        41.05              34.57
si-mdr2        57.88*             61.40
si-mdr3        64.48**            78.07**
注：1.与K562/A02细胞组相比较，p值：*＜0.05，**＜0.01；2.每个实验重复3次，取均值。

Claims (3)

1、一种抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，针对多药耐药基因mdr-1及其表达蛋白进行靶点治疗，具有靶向性抗肿瘤细胞多药耐药mdr-1基因和P-糖蛋白表达及功能，其特征是RNA干扰药物包含si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列，si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3三条核苷酸序列为：
     si-mdr1：     CUGUACUGGUCCAUACGGAUU
                   UUGACAUGACCAGGUAUGCCU
     si-mdr2：     CGCCGAGGCUAUGUACCAAUU
                   UUGCGGCUCCGAUACAUGGUU
     si-mdr3：     CCUCCGGUUGUAUGUACGGUU
                   UUGGAGGCCAACAUACAUGCC
2、根据权利要求1所述的抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，其特征是所述的si-mdr1、si-mdr2、si-mdr3的靶位点为：si-mdr1的靶位点：5’-AAGACAUGACCAGGUAUGCCU-3’----(865-885)si-mdr2的靶位点：5’-AAGCGGCTCCGATACATGGTT-3’----(2472-2492)si-mdr3的靶位点：5’-AAGGAGGCCAACATACATGCC-3’----(3564-3584)
3、根据权利要求1所述的抗肿瘤的多药耐药RNA干扰药物，其特征是给药途径可采用：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法中的一种。
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