CN1704123B - 用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰rna制剂及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的siRNA制剂及其筛选方法，将siRNA制剂高效导入到非人灵长类的呼吸道，抑制SARS冠状病毒的复制和表达，筛选到有预防或治疗SARS疾病作用的siRNA。提供了siRNA制剂的组成和有效抑制SARS病毒感染和复制的方法，适用于呼吸道感染性疾病防治药物的筛选以及其他呼吸道的疾病药物的筛选，如哮喘，COPD，RSV和ARS等。也适用于其他疾病的防治药物筛选，如代谢疾病、自免疫疾病和癌症。为siRNA药物的毒性和药效性实验提供了一个最接近人类的方法。

Description

用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂及其筛选方法。

背景技术

SARS是二十一世纪出现的第一个严重和易于流行的新的传染病。尽管目前全球SARS流行得到控制，但因迅猛流行而曾给全球健康保障、医疗卫生系统、人民生计、经济稳定和增长等造成严重影响。人们至今对这一疾病的认识还有限。2003年2月26日，在越南河内的一位香港居民因原因不明的发热和呼吸道症状而住进医院，在随后的2周内，香港、加拿大多伦多、新加坡的相继发生了类似的传染病爆发。通过流行病学调查，发现这些国家和地区的指示病例都曾到过香港并与广东已患有SARS的客人同住一层楼。该患者曾经在广东治疗SARS病人。SARS病毒随着人员流动散播到香港、越南、新加坡的医院系统，以及随着航空旅行路线扩散到多伦多和其他地区，导致了SARS在世界其他国家的蔓延。SARS在极短时间内，迅速传播到众多国家和地区、引发众多感染，其传播速度之快，是人们始料不及的。至2003年6月12日止，累计报告病例8445例，死亡790例。在报告病例的国家和地区中，亚洲共14个国家报告8087例，死亡757例。报告病例较多的国家和地区是：中国大陆为5328例，死亡343例；香港为1755例，死亡291例；台湾为688例，死亡81例；加拿大为238例，死亡32例；新加坡为206例，死亡31例。

有28个国家和地区出现了SARS病人。SARS的传染性极强，发展迅速，以飞沫传播为主，近距离接触便可感染；无性别区别，任何年龄层次皆可出现，但以轻壮年发病为主(19-55岁)；且潜伏期短，最短2天，最长不超过2周，平均6天。由于医护、保健人员与病人接触较多而成为该病的高危易感人群，占发病人数的40％。SARS的临床病程和症状可大致分为三个阶段：病毒体内增殖阶段：有高烧、肌肉疼痛、干咳等症状，外周血白细胞计数下降，淋巴细胞亚群CD3[+]、CD4[+]和CD8[+]细胞绝对数目显著下降，机体免疫功能受到严重损害；免疫风暴或免疫过激阶段：肺部游移阴影，一般在发病一周后体内可检测到IgG抗体产生，鼻咽分泌物、粪便和尿中病毒排出量大约发病后10天左右达到高峰；严重呼吸窘迫综合征和多脏器功能衰竭。

从世界卫生组织今年3月12日发出“SARS″警报后，通过全球科研人员的共同努力，排除了支原体、衣原体、鼠疫杆菌、军团菌、流感病毒A型和B型、副粘病毒、呼吸道合胞病毒、Hendra病毒、汉坦病毒、哺乳动物腺病毒等20余种病原体，通过病原体分离、血清学诊断、基因学分析和动物试验模型的建立等四方面的研究后，WHO于2003年4月16日正式宣布，目前在世界各地广泛流行的SARS病原体是一种以前从未在人类中发现的新型冠状病毒，称为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。

SARS-CoV属巢状病毒目(Order：Nidovirus)，冠状病毒科(Family：Coronavirus)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正链RNA病毒。冠状病毒是一类宿主范围广泛的RNA病毒。病毒体为六角形状。组成病毒体衣壳的结构蛋白总共有4～5种。包括S蛋白(Spikeprotein)，M蛋白(Membrane protein)，E蛋白(envelop protein)，N蛋白(nucleoprotein)，在某些冠状病毒中还有HE蛋白(hemagglutinin esterase)。SARS-CoV中的S、E、M和N蛋白在病毒颗粒进入宿主细胞、形态发生及释放过程中起到重要作用。其中S蛋白即伸出包膜的棒一球形的糖蛋白，它在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导膜融合进人细胞的过程中，起关键性作用，也是冠状病毒主要的抗原蛋白。M蛋白则是一种跨膜蛋白，在病毒的包膜形成与出芽过程中起重要作用。E蛋白是一种相对较小的蛋白质，主要散在分布于病毒包膜上。位于病毒颗粒中央的不规则核酸部分即病毒基因组，其上结合有核壳体蛋白N蛋白。冠状病毒基因组RNA是一个无分段的，正链RNA，长度一般在27-31kb。具有正链RNA病毒特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化帽，3’端有PolyA尾，和真核细胞的mRNA非常相近。

有来自不同国家和地区的10多个SARS-CoV分离株基因组全序列已经完成。其Gene Bank号分别为：NC004718/AY274119(加拿大TOR 2，29751bp)、AY278488(中国BJ01，29725bp)、AY278554(香港CUHK-W1，29736bp)、AY278491(香港HKU-39849，29742bp)、AY278741(美国Urbani，29727bp)、AY283794(新加坡SIN2500，29711bp)、AY283794(新加坡SIN2677，29705bp)、AY283794(新加坡SIN2679，29711bp)、AY283794(新加坡SIN2748，29706bp)、AY283794(新加坡SIN2774，29711bp)等。

SARS-CoV基因组有27～31kb、11个开放阅读框组成。SARS-CoV RNA聚合酶的编码区占用了5’端21.2kb，约全基因组的三分之二；后三分之一的区域，编码病毒结构蛋白，按基因组上的排列顺序依次为S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白；未发现HE蛋白编码序列。SARS冠状病毒基因组不编码HE蛋白。在结构蛋白编码区可能的开放阅读框中，存在已有蛋白质序列数据库中未找到任何同源序列的未知蛋白(predicted unknown protein，PUP)，称为非结构蛋白(X1～X5)。这些蛋白位于S和E，M和N之间，及N蛋白的下游，在冠状病毒各株中差异很大，且不受冠状病毒复制的依赖，其功能尚不清楚。Gene Bank数据经BLAST和Fast显示，这些非结构蛋白与目前已知的任何蛋白无明显的序列相似性。而其他蛋白在其他病毒基因组中都能找到同源性很高的序列，说明这些蛋白可能是决定SARS冠状病毒具有病毒行为的物质基础。

从整体突变率来看，不同地区流行的SARS冠状病毒的基因组，至少在病毒株采样期间，保持了相对稳定。来源于世界不同地区的11个SARS冠状病毒具有99％以上相似性，病毒株之间变异不足1％，全序列比较的相似性评分达到5.7×10⁴。虽然变异是存在的，仍然可以推断，近期世界范围流行的SARS是同一个来源的。从绝对数量上看，突变部位主要集中在RNA聚合酶区域，但是由于突变RNA聚合酶ORF的长度占基因组三分之二，从突变率来说，结构蛋白编码区的突变率要大大高于聚合酶编码区，未知蛋白质区域的突变率高于结构蛋白。这一结构上的突变分布规律，与病毒功能上的稳定性具有一定的一致性。RNA聚合酶的保守性为抗SARS药物的设计提供了重要的思路。

自1998年2月《Nature》发表了双链RNA(dsRNA)注射入一种线虫后诱导了基因靶向专一性的基因表达静寂(gene silencing)，随后许多研究者先后用RNAi技术，在线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞中进行了大量研究，采用不同长度的dsRNA可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低，甚至有时用专一性抗体都检测不到靶向基因所表达的蛋白质或肽类。因此，又将RNAi技术称作基因敲低(knockdown)或使基因静寂(gene silencing)。21个核苷酸(21nts)的双链RNA(siRNA)应用于培养的哺乳动物细胞，使基因表达明显降低，这种RNAi技术比基因敲除(gene knockout)技术更方便快捷地显示出基因的功能，有希望用于治疗某些由于特定基因表达过度引起的疾病，或者可抑制病毒或寄生病原性蛋白表达引起的疾病。

在AIDS的治疗上，RNA干扰可能成为对抗HIV病毒感染、复制的最有利方式。人们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA，针对HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒复制，针对宿主细胞的表面HIV受体基因的siRNA可用以控制病毒进入宿主细胞内，抑制病毒的感染过程。RNAi技术除用于抗HIV研究以外，还用于抗其他多种病毒的探索。它们包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(influenzavirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)等。以上研究均取得了另人欣喜的体外病毒抑制作用，但体内清除病毒的效果尚须在动物实验模型中进一步验证。RNAi技术可能会给病毒治疗带来一场革命。本发明从大型灵长类动物模型上验证了siRNA药物对SARS病毒感染和复制的抑制能力。

呼吸道给药能使药物直接进入肺内，针对肺部病变进行治疗，在肺部聚集较高的药物浓度，可减少用药量，快速起效，减少药物对全身的影响。与口服和静脉给药相比，有独特的优点。同时由于这些优点，也可作为肺外疾病治疗的一个系统给药方式，如雾化吸入吗啡达到迅速的镇痛作用，气道内滴注肾上腺素进行心功能抢救。呼吸道给药方式作为非损伤的给药技术，在小分子化合物、蛋白、核酸药物的导入方面也具有很好的应用前景。人肺泡的总表面积大于100m2，肺泡表面至毛细血管间的距离仅约1μm，是药物吸收的良好场所。巨大的吸收面积、丰富的毛细血管和极小的转运距离，决定了肺部给药的迅速吸收，而且吸收后的药物直接进入血液循环，无肝脏首过效应，酶活性较低，上皮屏障较薄及膜通透性高。正是由于肺泡的这种特点，有利于提高质粒DNA、siRNA等核酸药物对肺部的转染效率。

气道给药可经雾化吸入(Aerosolization)和气道滴注(instillation)。雾化吸入常用的雾化装置有定量定压式气雾器，干粉吸入器和雾化器，产生的雾粒通过惯性沉积、重力性沉积和弥散沉积三种方式在气道沉积。惯性沉积多发生于上呼吸道；重力性沉积则是直径较小的雾粒在重力作用下沉积于外周气道；弥散沉积发生在末梢气道，直径＜1μm的雾粒进行弥散运动，弥散沉积不是雾粒沉积的主要方式。潮气量、气流速度和呼吸频率都会影响到雾粒在气道的沉积。另外，雾粒的直径、形状、质量、体积、携带电荷和吸湿性都会影响到雾粒在气道的沉积。直径过大易沉积于口咽部，过小会发生弥散运动，都不利于雾粒在气道内沉积。直径2～3μm的雾粒较为理想。经雾化吸入的药物有抗哮喘药物，如激素、β2激动剂等；改善改善肺循环药物，如前列腺素E1(PGE1)；抗生素药物等。

气道滴注的方法可使药物一次性大剂量进入肺内，疗效迅速。气道滴注过程中变换体位，可通过重力作用，使药物在肺内分布较为均匀。机械通气中，滴注肺表面活性剂(PS)后短时间内提高气道峰压(PIP)，可促进PS分布于远端肺泡，有助于PS功能的发挥。在治疗肺部病变时，气道开放和肺泡扩张的程度会影响气体在肺内的分布，严重的肺实质病变会限制气体的弥散，降低疗效。气道滴注的药物有PS、抗生素和氟化碳(perflurocarbon，PFC，尚未成为正式药物)。siRNA是小分子易于制备成便于吸入的制剂形式，可使用雾化吸入和气道滴注两种方式。

呼吸道给药要解决的问题是如何有效地将核酸药物释放到靶细胞而又较少地产生副作用，即载体效率、靶向性和安全性的问题，是核酸药物研究必须解决的问题。目前用于核酸药物导入或基因治疗载体的主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。

病毒载体主要来源于鼠和人类的DNA、RNA病毒，包括逆转录病毒、腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛痘病毒、杆状病毒、EB病毒(EBV)、水疱性口炎病毒(VSV)和人巨细胞病毒(CMV)等，并且其中一些已经进入了临床试验阶段。其他载体，如细菌载体和人工载体则还处于研究阶段。

逆转录病毒载体这类载体主要来源于莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，其优点是导入的核酸稳定整合入宿主细胞，并持久表达，感染细胞范围广，基因容量较大(＜8kb)，机体对载体产生的免疫反应较低。缺点是载体的整合是随机的，插入基因的表达受两侧宿主DNA序列影响，并可导致插入突变，而且只感染分裂细胞。体内有效的基因治疗需要有足够高的感染率，大部分逆转录病毒载体都很难达到，临床上用逆转录病毒载体转移基因的研究正在逐渐减少。腺病毒载体腺病毒2型和5型对人类没有大的致病性，常用作基因治疗载体。腺病毒载体的优点是导入效率明显高于逆转录病毒，可制备的病毒滴度高，对分裂和非分裂细胞都有感染性。缺点是无靶向性，而且能引起机体较强的免疫反应，外源基因不能在体内长期表达。腺相关病毒载体(AAV载体)无致病性，免疫原性低，不存在插入突变或致癌的危险，能感染分裂和不分裂细胞。AAV的基因组结构简单，仅包含两端的LTR序列和2个编码基因(rep和cap)，易于操作，缺点是仅能携带4.0kb左右的外源基因。由慢病毒改造而来的慢病毒载体能用于感染不分裂细胞如神经细胞、造血细胞、肌纤维细胞等。慢病毒能稳定整合入宿主染色体，因此能持久稳定表达外源基因。研究发现慢病毒载体在基因治疗卵巢癌的体内实验中转染效率比逆转录病毒载体高10倍，表达效率高近100多倍。慢病毒用作基因治疗载体有毒力恢复、垂直感染等安全问题，而安全性是基因治疗载体的首要条件，因此慢病毒载体要应用于临床还有待于更多的深入研究。单纯疱疹病毒载体HSV载体能携带30kb～50kb的外源基因，可在多种细胞中复制，能感染分裂和不分裂细胞。近年来出现了更多的基因治疗病毒载体，如杆状病毒、EBV、牛痘病毒、VSV和CMV等。庚型肝炎病毒(HGV)对人没有明显的致病性，对肝细胞、淋巴细胞有亲嗜性，复制机制与HCV相似，也有研究尝试将其改造成肝细胞和(或)淋巴细胞靶向基因治疗的载体。

经过改造的病毒载体，转染效率较高，但在于制备复杂，有免疫原性，体内不能反复应用，安全性存在隐患以及非导向性，在临床应用上存在一些困难。非病毒载体是核酸药物，尤其是反义核酸、质粒DNA以及siRNA核酸药物的重要途径。通常利用亲水或疏水的多价阳离子聚合物来凝聚重组质粒或反义寡核苷酸，形成微粒，被细胞内吞。尽管非病毒载体转染效率仍低于病毒性载体，但非病毒载体由于具有低毒、低免疫反应、靶向性和易于组装等优点。

将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中，以及一些核酸片断直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞、肺泡细胞及免疫细胞等对裸DNA较为敏感。直接给药后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到DNA的明显表达以及对基因的抑制效果。常用的有电穿孔和基因枪法等。目前使用的DNA疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸DNA或RNA直接用于病变组织是可行的基因转移策略，但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然给予裸核酸是无效的。

脂质体是将药物包封于类脂双分子层形成的单层或多层球形微粒，类似细胞结构，有生物膜的特性和功能。它可以包裹水溶性和脂溶性两种类型的药物。应用于转基因脂质体DNA复合物分为阳性、中性脂质体、阴性脂质体以及pH-敏感的脂质体。还不断有新型的脂质体被推出，如双四铵化合物等。脂质体经聚乙二醇(PEG)修饰后，可降低脂质体-DNA复合物颗粒之间的相互聚集，降低了与血液成分的相互作用，使脂质体DNA复合物颗粒由大颗粒变成小颗粒，同时不影响脂质体与细胞的亲和力。RNA/DNA寡核苷链嵌合分子曾被用于修复DNA基因中的单个碱基突变。

阳离子多聚物可浓缩富含阴离子的DNA，然后粘附到细胞表面的硫酸粘多糖上，被细胞内吞进入细胞内，从而使质粒表达。阳离子多聚物种类很多，如聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)，聚丙烯亚胺树突状物(polypropyleniminedendrimers)，聚酰胺树突状物(polyamidoamine dendrimer)，多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚精氨酸、鱼精蛋白、聚氨基葡萄糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇修饰物。其中研究较早的是多聚赖氨酸，后来发现聚乙烯亚胺性能更佳。PEI可抑制溶酶体，在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加，对DNA提供更大的保护作用，有利于核酸逃离吞噬泡。由于DNA与阳离子多聚物形成的转移复合物是通过内吞进入细胞，易被溶酶体降解，因此加入吞噬泡释放剂有利于提高转染效率。最常用的吞噬泡释放剂是氯喹和两性分子肽。

多肽基因释放系统中最早使用的是二油酰蜂毒肽(dioleoylmelittin)，与质粒DNA形成环形颗粒，可有效地转染真核细胞，建立了多肽转基因载体的方法。碱性氨基酸多肽长度16～18氨基酸足以转移DNA至细胞内。阳离子多聚赖氨酸或精氨酸肽链压缩DNA分子，最少需6到8个阳离子氨基酸残基；添加半胱氨酸和组氨酸后可以增加转染效率，如Cys-His-(Lys)(6)-His-Cys寡肽等。多肽载体是配体区、结合DNA的阳离子区、核定位信号区、两性分子功能区，是四位一体的合成短肽。如THALWHT寡肽可特异结合气道上皮，共聚焦显微镜发现标记的THALWHT寡肽与细胞结合后，被吞入细胞内；包含CTHALWHTC序列和DNA结合部分的合成多肽，能有效地将基因转移到气道上皮细胞内。添加吞噬泡释放剂、阳离子聚合物以及病毒的表面蛋白颗粒有助于提高转染效率。多肽载体的优势在于可用多肽合成仪合成，便于体内应用和基因工程法生产，克服了配体寡肽与多聚赖氨酸或PEI偶联制备的复杂性、不均一性以及系统误差大的缺陷。多肽载体是非病毒载体小型化的趋势。不足之处在于阳离子负荷相对偏少。

SiRNA可通过以下几种方法合成。可以通过化学合成法能够获得高纯度、高质量、序列特定的siRNA，不会污染长的dsRNA，避免了可能的非特异性干扰。此外，也可以通过以下方法合成siRNA，这些方法具有经济、快速的特点，但获得的siRNA质量不高，纯度不够，会受到不同长度的dsRNA的干扰，有时会导致非特异性免疫和干扰：a.体外转录，以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs；b.选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNase III(or Dicer)在体外消化，得到一种混合的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。C.通过siRNA表达载体或者病毒载体制备。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。d.PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。siRNA表达框架(siRNA expressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，使用体外细胞水平筛选到的siRNA，通过裸siRNA、病毒载体(如腺病毒等)或非病毒载体(如多肽、阳离子聚合物)等方式，以气道吸入和滴注的途径将siRNA导入呼吸道细胞内，并通过非人灵长类的动物模型，验证了siRNA制剂对动物模型呼吸道细胞的转染效率和siRNA对呼吸系统疾病的治疗效果。本发明还提供了用于呼吸系统疾病的药物筛选方法，尤其是核酸类药物。

本发明用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，是由小干扰RNA和小干扰RNA导入载体组成、或由小干扰RNA组成。

所述的小干扰RNA可以是化学合成的21-23碱基对的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的21-23碱基对的双链RNA。

所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成。

所述的靶序列可以是SARS冠状病毒的序列，或呼吸道合胞病毒的序列，或禽流感病毒，或其它呼吸道病毒的序列，或发病宿主自身的内源基因的序列。

作用于SARS冠状病毒靶序列的小干扰RNA的序列可以由至少一个以下的序列组成：

①5’aacgagtaactcgtccctctt 3’；②5’aattgcataccgcaatgttct 3’；

③5’aacctttggagaagatactgt 3’；④5’aatcacatttgagcttgatga 3’；

⑤5’aatgttacagggtttcatact 3’；⑥5’aaggatgaggaaggcaattta 3’；

⑦5’aagagactatttataacttgg 3’；⑧5’aaggataagtcagctcaatgc 3’；

⑨5’aactggcacactacttgtcga 3’；⑩5’aagctcctaattacactcaac 3’；

所述的载体或表达框架为：RNA聚合酶IH启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达；所述RNA聚合酶III启动子包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。

所述的小干扰RNA导入载体可以是阳离子聚合物，包括聚乙烯亚胺(PEI)，多聚赖氨酸、多聚组氨酸，及其聚乙二醇修饰物；也可以是聚丙烯亚胺树突状物，聚酰胺树突状物，及其聚乙二醇修饰物；所述的小干扰RNA导入载体也可以是脂质体，包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺，N-[1-(2，3-Dioleoyloxy)]-N，N，N-三甲铵离子与丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)/二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(W∶W，3∶1)，也可以是其聚乙二醇的修饰物；所述的小干扰RNA导入载体也可以是多肽，其序列特征为：N端-KKACLLALAHHLAHHHHLALHLACLALKKA-C端，可以是直线型或分枝型的的多肽化合物；所述的小干扰RNA导入载体也可以是核酸保护剂，包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、生理盐水、葡萄糖溶液。

本发明的筛选方法为将待筛选的小干扰RNA与小干扰RNA导入载体混合后，在病毒感染前和病毒感染后导入大型灵长类动物模型的呼吸道，通过病毒基因组拷贝数和病毒感染性颗粒滴度的降低筛选出能有效防治SARS疾病的小干扰RNA；通过大型灵长类动物模型的肺部损伤减轻筛选出能有效防治SARS疾病的小干扰RNA；通过大剂量和重复导入小干扰RNA到大型灵长类动物模型呼吸道筛选出不影响心脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结以及血液系统正常功能的小干扰RNA。

所述的导入小干扰RNA的剂量为5mg-50mg；导入的小干扰RNA可以是一次导入也可以两次或两次以上重复导入。所述的大型灵长类动物，可以是恒河猴或食蟹猴或黑猩猩。

呼吸系统疾病如哮喘、肺癌等发病率逐年提高，迫切需要新特药物。在呼吸系统疾病中，以呼吸系统病毒性传染病对生命健康和社会发展的影响最大。在2003年初爆发的SARS疾病，由于具有很强的近距离传染性和较高的致死率，在全国乃至世界迅速传播，给经济和人们的生活带来很大的损失。我国政府高度重视SARS疾病所带来的影响。需要一种有效的防治SARS疾病的特效药。SARS疾病是由冠状病毒引起的，与流感病毒和艾滋病病毒一样同属RNA病毒。哺乳动物的RNAi(RNA干涉)技术是最近两年才发展起来的，能够特异的降解目标RNA和抑制目标基因的表达，根据RNAi技术开发的siRNA(小分子双链RNA)药物具有特异地降解目的RNA的作用。siRNA药物具有以下优点：1、特异性强，安全性高，还未见有毒性和副作用的研究报道。2、用量少，具有放大效应，即少量的siRNA药物进入细胞后，降解病毒RNA或致病基因的mRNA，被降解的RNA又可以作为新的药物。3、能够引起基因水平的免疫，有效预防病毒病。4、能在分子水平有效治疗病毒病和基因表达不正常所引起的疾病。我们采用RNAi技术发明了以下在非人灵长类动物模型中筛选防治呼吸系统疾病新药的新策略，尤其使用于防治SARS等呼吸系统病毒性传染疾病药物的筛选。

附图说明

图1为本发明所设计并使用的针对SARS的siRNA的靶序列在SARS RNA基因组上的分布情况。

图2为聚乙二醇修饰的PEI。

图3为实验5组肺部染色的病理切片。

图4为实验4组肺部染色的病理切片。

图5为实验3组肺部染色的病理切片。

图6为实验2组肺部染色的病理切片。

图7为实验1组肺部染色的病理切片。

图8为荧光标记的siRNA经呼吸道给药技术成功导入呼吸系统。

图9高效导入siRNA到小鼠呼吸道成功敲低SARS靶序列。

具体实施方式

首先设计了针对SARS病毒的RNA基因组，设计了48条siRNA，其中包括靶向5’UTR、ORF1a(nsp-1、nsp-3、nsp-6)、ORF1b(nsp-12、nsp-13、nsp-14、nsp-16)、ORF2(spike)、ORF3a、ORF4(E-protein)、ORF5(M-protein)、ORF7和ORF9a(N-protein)的siRNA(见图1)。并采用化学方法和体外转录的合成了这48条siRNA。采用脂质体方法在SARS冠状病毒感染猴胚肾细胞(FRhk-4)之前和之后分别对细胞转染化学合成的siRNA双链分子。通过实时定量RT-PCR评价siRNA分子对降低细胞内病毒基因组拷贝数的抑制作用；通过以CPE为基础的病毒滴定技术来评价siRNA分子减少细胞培养基病毒滴度的作用，通过这些指标评价siRNA双链分子的抑制效果。从中发现四条siRNA双链分子能有效抑制SARS冠状病毒的感染和复制。并观察到siRNA双链分子在至少72小时内对预防SARS冠状病毒的抑制效果达到90％以上。针对冠状病毒不同区域的有明显抑制效果的siRNA双链分子联合使用可使治疗效果达到80％以上。将这四条siRNA的序列克隆进哺乳动物表达载体或表达框架，含siRNA序列的哺乳动物重组表达载体或表达框感染FRhk-4，可获得与上述类似的结果。

以上结果表明，通过合理设计siRNA分子，siRNA药物在体外预防和治疗呼吸系统疾病是切实可行。

为了在模式动物体内进一步考察siRNA的药效，需要对siRNA药物进行前处理。我们先后采用阳离子化合物、脂质体化合物、多肽核酸释放体系以及核酸保护剂对体外筛选来的siRNA进行处理，从而达到保护siRNA避免被酶降解，提高siRNA的稳定性。这些化合物富含阳离子正电荷的特点或具有两亲性(有疏水亲水两性)的特点能够结合或保护siRNA，所形成的复合物能够与细胞膜发生相互作用或有助于细胞膜对siRNA的摄取。阳离子化合物有聚乙烯亚胺(PFI)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropylenimine dendrimers)、聚酰胺树突状物(polyamidoamine dendrimer)、阳离子聚酯(PAGA)、多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚精氨酸等与一定量的siRNA制备成复合物；脂质体或经聚乙二醇修饰的脂质体分别与siRNA形成复合物；含有H1组蛋白的部分序列或富含组氨酸、赖氨酸的多肽与一定量的siRNA制备成复合物；核酸保护制剂有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)与生理盐水、葡萄糖溶液等形成的非离子两亲性高分子，其亲水性部分通过氢键、范德华力等和siRNA分子相互作用，疏水性部分覆盖在siRNA分子周围，导致siRNA表面具有一定疏水性，可以在一定程度上增加siRNA的稳定性，减少核酸酶的降解，siRNA的疏水性增加有助于细胞膜通过疏水相互作用摄取siRNA。上述制备的复合物分别经鼻喷雾和滴注的方式导入小鼠和恒和猴的呼吸系统。

首先，在小鼠体内验证了上述阳离子聚合物、脂质体化合物、多肽化合物以及核酸保护剂对siRNA的稳定、保护和提高体内转染效率的作用(见图8所示)。

研究结果表明，30ug的荧光标记的siRNA与50ul(含5％葡萄糖和12ug的核酸保护制剂)混合制备成复合物，经鼻导入呼吸道和肺部细胞中。4小时后将动物安乐死，对呼吸系统器官取样，在荧光显微镜下检测荧光标记的siRNA在体内的稳定性和分布情况。从图8中可看出，在呼吸道和肺部分布着大量的表现出荧光的siRNA，即使用磷酸缓冲液(PBS)洗去吸附在细胞表面的siRNA后，仍可检测到大量的发出荧光的siRNA。

在成功将siRNA高效导入呼吸系统后，我们设计了SARS基因序列和萤火虫荧光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并将融合基因克隆到哺乳动物表达载体pCI，够建成PCI-SC-Luc重组质粒，该质粒转录出的mRNA含有SARS的mRNA并且能够翻译出有活性的萤火虫荧光素酶，如果SARS特异的siRNA能够降解该融合基因的mRNA，就检测不到萤火虫荧光素酶。从图9中可知，SARS特异的siRNA能有效抑制萤火虫荧光素酶的表达。

在建立了siRNA药物呼吸系统给药方法后，我们将进一步在非人灵长类动物体内评价siRNA对呼吸系统疾病的防治作用，重点研究siRNA对SARS疾病的防治效果。

首先建立了SARS病毒感染的恒河猴动物模型。恒河猴SARS疾病动物模型接种来自病人的SARS病毒后能表现出与SARS疾病类似的症状和类似的血液学方面的表现。SARS病毒经鼻腔接种后，2-3天后出现发烧的症状；感染病毒7-10天内，可以通过RT-PCR检测出病毒的复制，并且在组织样本中鉴定和分离出SARS病毒；感染病毒17天左右，可以检测出SARS病毒特异的抗体；感染病毒30天左右，可以观察到肺部的损伤。

设计了一系列试验评价SARS特异siRNA在动物体内药效和安全性。将权力要求中的siRNA混合使用或取其中3条、或两条混合使用，与siRNA转染试剂配制成siRNA体内导入制剂，也可从表1所示的序列选择多条序列单独或混合使用。配制好的siRNA在病毒攻击前后不同时间把不同剂量的siRNA制剂通过鼻腔喷雾和滴注的方式导入到恒河猴的呼吸道和肺部细胞中。SiRNA处理时间为SARS病毒攻击恒河猴4-72小时前(每隔24-48小时给药一次)、SARS病毒攻击恒河猴后4-144小时(每隔24小时-48小时给药一次)。

如图3所示，实验5组(SARS病毒感染恒和猴动物模型组)病变范围广，表现为以肺泡间隔增厚，局部增厚的肺间隔相互融合实变，肺泡间隔内出现多少不等的单核样细胞浸润为特征的肺间质性炎，部分肺间隔充血出血，肺泡上皮增生，病变较单一，局部肺泡腔内有渗出，未见明显的坏死。

如图4所示，实验4组(感染SARS的恒和猴经SARS不相关的Luc-siRNA给药)表现为肺泡间隔明显增厚伴大量单核样细胞为主的炎细胞浸润，病变严重区增厚的肺间隔相互融合实变伴大量的炎细胞浸润，其中可见单核样细胞、淋巴细胞、组织细胞及少量的嗜酸性粒细胞等多种炎细胞，实变区残留肺泡腔内可见明显的蛋白性渗出，肺泡上皮增生，有的肺泡腔内还可见多个组织细胞

如图5所示，实验3组(感染SARS的恒和猴经SARS特异的siRNA给药治疗组)肺组织结构、形态大致正常。肺间隔局灶状轻度增宽伴少量单核细胞浸润。

如图6所示，实验2组(感染SARS的恒和猴经SARS特异的siRNA给药治疗组)肺间隔局灶状轻度增宽伴少量单核细胞浸润，肺间隔充血，银染色示病变肺泡壁弹力纤维有局限断裂。

如图7所示，实验1组(感染SARS的恒和猴经SARS特异的siRNA给药预防组)病变轻，呈局灶性肺间质性炎肺间隔局灶状轻度增宽伴少量单核细胞浸润，肺间隔充血。

其中在SARS病毒攻击恒河猴4小时前给药(30mg/次，预防组)，与对照组1(SARS病毒感染的恒河猴模型只给与生理盐水)和对照组2(SARS病毒感染的恒河猴模型只给予非SARS病毒相关的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因组的拷贝数检测阳性率为25％(见表2)，而且检测到的病毒拷贝数也分别比对照组1和对照组2分别减少了94.72％和98.88％，而且能明显减轻SARS病毒所引起的肺部损伤，肺部结构和形态明显好于未经siRNA药物处理的对照组(图3-图7、表1)。而对照组的阳性率为100％。

表2：上述实验各组病毒的RNA基因组的拷贝数检测

其中在SARS病毒攻击恒河猴后4小时、36小时、72小时给药三次(30mg/次，治疗组)，与对照组1(SARS病毒感染的恒河猴模型只给与生理盐水)和对照组2(SARS病毒感染的恒河猴模型只给予非SARS病毒相关的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因组的拷贝数检测阳性率为25％，而且检测到的病毒拷贝数也分别比对照组1和对照组2分别减少了85.96％和97.07％(表2)，而且能明显减轻SARS病毒所引起的肺部损伤，肺部结构和形态明显好于未经siRNA药物处理的对照组(图3-图7、表1)。而对照组的阳性率为100％。

本发明还提供了siRNA的剂量范围5-50mg，在此范围内siRNA能有效抑制细胞内的mRNA，从而有效降解外源或内源的siRNA。其中在SARS病毒攻击恒河猴后4小时、36小时、72小时给药三次(10mg/次，治疗组)，与对照组1(SARS病毒感染的恒河猴模型只给与生理盐水)和对照组2(SARS病毒感染的恒河猴模型只给予非SARS病毒相关的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因组的拷贝数检测阳性率为25％，而且检测到的病毒拷贝数也分别比对照组1和对照组2分别减少了78.86％和84.49％，而且能明显减轻SARS病毒所引起的肺部损伤，肺部结构和形态明显好于未经siRNA药物处理的对照组(图3-图7、表1)。而对照组的阳性率为100％。

在本发明所使用的siRNA制剂及其剂量范围内，尚未有毒理反应。

这类siRNA物质组成和应用方法不仅适用呼吸道的感染性疾病的治疗，而且适用于其他呼吸道的疾病的治疗，如哮喘，COPD，RSV和ARS，等。在大型灵长类动物模型中有效利用小干扰RNA来治疗传染性肺病的实践也将适用与其他类型的疾病，如代谢疾病、自免疫疾病和癌症。大型灵长类动物模型为小干扰RNA药物的毒性和有效性实验提供了一个最接近人类的检测方法。

实施例1：阳离子聚合物/siRNA制剂的制备。根据我们在细胞水平的研究结果，通过化学方法合成(由德国QIAGENE公司提供合成服务)siRNA(见序列表)。琥珀酰亚胺基PEG3400(PEG3400-N-hydroxy succinimide，购自ShearwaterPolymers公司)(图2)溶于100mM HEPES(pH8)缓冲液中，缓慢加入PEI溶液，在室温下不停搅拌5-9小时，检测PH值为9.5，在室温下放置4-6天，冻干反应产物，重新溶于5mM HEPES配制的150mM NaCl(pH 7)溶液中，经凝胶柱纯化、透析后待用。PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于5mM HEPES(pH8)缓冲液.合成的siRNA也溶于5mM HEPES(pH8)缓冲液。两者按2∶1的比例混合，振荡混匀30秒。

实施例2：阳离子多肽/siRNA制剂的制备。

适量的siRNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为体积有限，可采用高浓度的siRNA，一般siRNA为8-15μg/μL。

取适量的siRNA与阳离子多肽(见序列表)混合。SiRNA与阳离子多肽按1∶4-8的比例混合，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/阳离子多肽复合物。制备的siRNA/阳离子多肽复合物可用于体内(包括呼吸系统)导入siRNA。本方法也适用于DNA或DNA/siRNA复合物体内导入。

实施例3：核酸保护剂/siRNA制剂的制备。

取适量的siRNA(5-50mg)溶于无RNA酶的无菌双蒸水配制的聚乙烯吡咯烷和葡萄糖溶液中，在4℃混匀，制成siRNA/核酸保护剂的复合物，用于siRNA的呼吸道给药操作。

实施例4：脂质体/siRNA制剂的制备。

将磷脂、胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于氯仿(或其他有机溶剂中)然后将氯仿溶液在一玻璃瓶中旋转蒸发，在瓶内壁上形成一薄膜；将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中，加入烧瓶中不断搅拌，即得脂质体。制备好的脂质体按照4-8∶1的比例与siRNA混匀，室温下放置30分钟，就可制成脂质体/siRNA制剂。

实施例5：应用SARS病毒恒河猴感染模型评价siRNA抑制SARS病毒感染与复制的的药效及安全性。

(一)建立SARS疾病动物模型。

恒河猴SARS疾病动物模型接种来自病人的SARS病毒后能表现出与SARS疾病类似的症状和类似的血液学方面的表现。SARS病毒经鼻腔接种后，2-3天后出现发烧的症状；感染病毒7-10天内，可以通过RT-PCR检测出病毒的复制，并且在组织样本中鉴定和分离出SARS病毒；感染病毒17天左右，可以检测出SARS病毒特异的抗体；感染病毒30天左右，可以观察到肺部的损伤。

(二)药物剂量

通过一定的配比制成siRNA药物；实验动物的给药剂量分为5-50mg。

(三)实验动物的给药时间

尽量选择性别、年龄一致的纯种动物，对实验动物进行随机分组。实验和动物分组情况见表1。

其中SARS-siRNA由分别等剂量的针对SARS病毒的nsp12(5’-aaggatgaggaaggcaattta-3’)和spike(5’-aagctcctaattacactcaac-3’)基因的siRNA组成，这两种siRNA在细胞学实验中都表现出强的抑制SARS病毒的能力。Luc-siRNA(5’-aagctatgaaacgatatgggc-3’)作为阴性siRNA对照设置。

病理切片及肺部病变判断见表1，表2、图3-图7。

(四)病毒接种方法

一定滴度的病毒(TCID₅₀为10³-10⁵)稀释到5ml的磷酸缓冲液中其中0.5ml通过鼻腔接种，0.5ml通过气管接种。

(五)siRNA的导入方法

5-50mg的siRNA制剂溶于0.5ml体积中，通过鼻腔给药。

(六)通过以下各种相关指标客观评价siRNA新药的药效。

通过客观指标，如生理、生化的化验指标，X线检查，病理切片等来评价SARS特异siRNA药物的药效，重点观察体温、胸部影象学、鼻咽分泌物病毒复制水平、实验后期处死动物的肺及其它脏器的病理异常情况。

1、肺临床表现及功能指标。主要包括临床症状和体征的观察，经SARS-siRNA给药的实验动物的精神状态、食欲明显好于对照组。

2、病毒复制水平指标  实验动物局部麻醉后，用鼻腔和咽部拭子采样，可通过实时定量PCR技术检测SARS病毒，并从肺及鼻咽分泌物中分离病毒并盲传三代鉴定感染性病毒颗粒。经SARS-siRNA给药的实验动物中的阳性率为25％，而对照组的阳性率为100％。(表2)

3、组织形态学指标  镜下可见肺泡腔狭窄甚至不张，肺泡间隔增宽等形态变化。经SARS-siRNA给药的实验动物的肺部损伤与对照相比，明显减轻。猴肺间质性炎病变程度粗略判断标准(见表1，表2、图3-图7)：

-肺组织结构、形态正常。

±肺组织结构、形态大致正常。肺间隔局灶状轻度增宽伴少量单核细胞浸润。

+肺间隔局灶状轻度增宽伴少量单核细胞浸润，肺间隔充血，银染色示病变肺泡壁弹力纤维有局限断裂。

++肺间隔多灶状增宽伴多量单核细胞为主的炎细胞浸润，肺泡受压变形变小，并有局灶性肺泡间隔增宽后相互融合，肺间隔充血，病变肺泡壁弹力纤维有断裂。局灶肺泡腔内可出现少量渗出。

+++肺间隔广泛增宽伴大量单核细胞为主的炎细胞浸润，肺泡受压变形变小，并有局限性肺泡间隔增宽后相互融合，肺间隔充血出血明显，病变肺泡壁弹力纤维有明显断裂。局限肺泡腔内可出现少量渗出。

++++肺间隔弥漫性增宽伴大量单核细胞为主的炎细胞浸润，肺泡受压变形变小，肺泡内渗出明显并有大片状肺泡间隔增宽后相互融合，病变肺泡壁弹力纤维有明显断裂，肺间隔充血出血明显并可见灶状坏死，肺泡腔内有多量渗出并可见较多的细胞成份。

4、肝功能指标  血清丙氨酸氨基转移酶、血清胆红素、凝血酶原时间等指标的监测。重复导入大剂量的siRNA未见对肝功能指标有不良影响。

5、血液系统指标  白细胞相关项目检测结果全血白细胞(WBC)和白细胞分类计数(DC)；红细胞相关项目检测，全血红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、红细胞比积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)等。重复导入大剂量的siRNA未见对血液系统指标有不良影响。

序列表

<110>广州拓谱基因技术有限公司

<120>用于预防和治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA及其筛选方法

<160>12

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1，2)

<223>a为脱氧核糖核苷

<400>1

1 aacgagtaac tcgtccctct t 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

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<212>RNA

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<222>(1，2)

<223>a为脱氧核糖核苷

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<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

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<222>(1，2)

<223>a为脱氧核糖核苷

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1 aagctcctaa ttacactcaa c 21

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1，2)

<223>a为脱氧核糖核苷

<400>11

1 aagctatgaa acgatatggg c 21

<210>12

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>富含Lys、His和Leu的多肽序列

<400>12

Lys Lys Ala Cys Leu Leu Ala Leu Ala His His Leu Ala His His

 1        5         10         15

His His Leu Ala Leu His Leu Ala Cys Leu Ala Leu Lys Lys Ala

                20                   25                  30

Claims (9)

1.一种用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于小干扰RNA制剂由小干扰RNA和小干扰RNA导入载体组成、或由小干扰RNA组成；

所述的小干扰RNA是化学合成的21-23碱基对的双链RNA；或者是载体或表达框架表达的21-23碱基对的双链RNA；小干扰RNA的序列由至少一个以下的序列组成：

①5’aacgagtaactcgtccctctt 3’；②5’aattgcataccgcaatgttct 3’；

③5’aacctttggagaagatactgt 3’；④5’aatcacatttgagcttgatga 3’；

⑤5’aatgttacagggtttcatact 3’；⑥5’aaggatgaggaaggcaattta 3’；

⑦5’aagagactatttataacttgg 3’；⑧5’aaggataagtcagctcaatgc 3’；

⑨5’aactggcacactacttgtcga 3’；⑩5’aagctcctaattacactcaac 3’。

2.根据权利要求1所述的用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于所述的小干扰RNA是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，或者由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成。

3.根据权利要求2所述的用于体内预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂其特征在于所述的靶序列是SARS冠状病毒的序列。

4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于所述的载体或表达框架中RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达。

5.根据权利要求4所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于所述RNA聚合酶III启动子是人源或鼠源的U6启动子或人H1启动子。

6.根据权利要求1所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于：所述的小干扰RNA导入载体是聚乙烯亚胺(PEI)，多聚赖氨酸、多聚组氨酸，及其聚乙二醇修饰物；或者是聚丙烯亚胺树突状物，聚酰胺树突状物，及其聚乙二醇修饰物。

7.根据权利要求1所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于：所述的小干扰RNA导入载体是卵磷脂、磷脂酰乙醇胺，或者是其聚乙二醇的修饰物。

8.根据权利要求1所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于：所述的小干扰RNA导入载体是多肽，其序列特征为：N端-KKACLLALAHHLAHHHHLALHLACLALKKA-C端。

9.根据权利要求1所述的用于预防或治疗呼吸系统疾病的小干扰RNA制剂，其特征在于：所述的小干扰RNA导入载体是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、生理盐水、葡萄糖溶液。

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