CN1216878C - 染料木素的制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种制备染料木素的工艺，至少包括：从植物中提取纯化槐角甙；将纯化的槐角甙进行酸水解，并纯化得到染料木素。该工艺大体流程为：植物粗粉用醇回流提取；浓缩回收醇制备浸膏，加水沉淀，洗去水溶性杂质；将沉淀用有机溶剂回流脱脂，水洗涤沉淀，醇结晶后干燥，得到纯化的槐角甙；将槐角甙进行回流酸水解得到结晶；用水洗涤结晶至pH值为中性；收集沉淀物进行结晶干燥，得到染料木素。一种药物组合物，包括以该工艺制备的染料木素为活性成分及制药领域中常用的载体。还涉及该工艺制备的染料木素在制备预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤和心脑血管性疾病药物中的应用。该工艺简便、易行，产品收率高，适用于批量生产，降低了生产成本。

Description

染料木素的制备工艺

技术领域：

本发明涉及染料木素的制备工艺，特别是从豆科植物中提取纯化槐角甙再酸水解生成染料木素的提取纯化工艺，以及它在预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤和心、脑血管性疾病的应用，属于药物制造和药物治疗领域。

背景技术：

骨质疏松症(Osteoporosis)是以骨组织显微结构退化，骨矿成分和骨基质等比例地逐渐减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折发生危险度升高的一种全身骨代谢障碍性疾病。据90年代未期调查资料显示，我国约有骨质疏松症患者6～8千万；其中上海老年人骨质疏松症患病率男性为60.7％，女性为90.5％。

骨质疏松症患者，特别是绝经后女性患者，由于体内雌激素水平下降，对破骨细胞抑制作用减弱，使其活性增强，骨溶解加速，当这一作用大于骨形成作用，骨代谢处于负平衡状态，则易发生骨量减少，骨显微结构退化，导致骨脆性增加，极易造成骨折，甚至造成永久性功能丧失。女性50-60岁后，男性60-70岁后发病率升高，80岁以上达高峰，女性患病率可达100％。50-90岁妇女脊椎骨折发生率是60岁以前的20倍。骨质疏松症最常见的症症①疼痛：以腰背痛多见，占疼痛患者中的70％-80％。②身长缩短、驼背：多在疼痛后出现，脊椎椎体前部几乎多为松质骨组成，而且此部位是身体的支柱，负重量大，尤其第11、12胸椎及第3腰椎，负荷量更大，容易压缩变形，使脊椎前倾，背曲加剧，形成驼背，随着年龄增长，骨质疏松加重，驼背曲度加大，致使膝关节挛拘显著。③骨折：这是退行性骨质疏松症最常见和最严重的并发症，它不仅增加病人的痛苦，加重经济负担，并严重限制患者活动，甚至缩短寿命。据我国统计，老年人骨折发生率为6.3-24.4％，尤以高龄(80岁以上)女性老人为甚。骨质疏松症所致骨折在老年前期以桡骨远端骨折(Colles骨折)多见，老年期以后腰椎和股骨上端骨折多见。④呼吸功能下降：胸、腰椎压缩性骨折，脊椎后弯，胸廓畸形，可使肺活量和最大换气量显著减少，肺上叶前区小叶型肺气肿发生率可高达4 0％；老年人多数有不同程度肺气肿，肺功能随着年龄增长而下降，若再加骨质疏松症所致胸廓畸形，患者往往可出现胸闷、气短、呼吸困难等症状。

目前，骨质疏松症主要分为两型。第一型为原发性I型骨质疏松症，即属高代谢型，是由于绝经后雌激素减少，使骨吸收亢进引起骨量丢失；因此，多选用骨吸收抑制剂如雌激素、降钙素、钙制剂治疗，经过多年的临床应用证实长期使用是有效的，但其潜在的主要副作用是可能增加子宫内膜癌和乳腺癌的发生；另外，黄遂柱等研究亦指出雌激素缺乏和补充超生理剂量雌激素均对去势小鼠骨折早期愈合不利，补充生理剂量雌激素对小鼠骨折愈合影响较小。第二型是原发性II型骨质疏松症，其病因是由于增龄老化所致调节激素失衡使骨形成低下，通常采用骨形成促进剂，如活性维生素D、蛋白同化激素(苯丙酸诺龙)、钙制剂、氟化剂和维生素K2等治疗能获得一定疗效；然而，不少骨形成促进剂的使用受到伴发性疾患象胃酸缺乏或慢性肾衰等的限制，其氟化物因其胃肠道不良反应、外周疼痛综合征和应激性骨折等不良反应给临床治疗带来困难。

染料木素是异黄酮类物质中所占比率较高的一种，广泛存在于包括槐角在内的豆科类植物中。Adlercreutz等首次发表异黄酮和木脂体与哺乳动物雌激素结构的相似性，并阐述它们的可能防癌作用以来，人们极为关注大豆异黄酮(isoflavone)对健康的影响。大豆异黄酮是大豆及其制品中的一类黄酮类化合物，主要有黄豆甙原(7，4′-二羟基异黄酮)、染料木黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮即染料木素，genistein)、生原禅宁A(biochaninA)和芒柄花素(7-羟基-4′-甲氧异黄酮)。人们研究较多的主要是黄豆甙原和Genistein，生原禅宁A和芒柄花素是其前体物。尽管黄豆甙原和Genistein不是甾体激素，因其能够与雌激素受体结合发挥微弱的雌激素效应，故称为植物雌激素(phytoestrogen)。植物雌激素为杂环多酚类化合物，主要有异黄酮、木脂体(lignan)和香豆雌酚(coumestrol)3大类。由于异黄酮的活性是雌二醇的1/1000，与雌二醇竞争性结合雌激素受体，低水平补充时由于其占位效应所产生雌激素效应较雌二醇有害效应低得多，对雌激素表现为拮抗作用，进而对激素相关疾病具有保护作用。因此，植物雌激素与这些疾病的关系成为人们关注的热点。骨质疏松和绝经综合症为中老年人群的常见病，并在很大程度上与雌性激素的活性及其代谢有关。亚洲人因食用大豆制品较多，这些疾病发生较少，但随着饮食的西化使其发病率有增加趋势。同时，移民流行病学研究也显示移居美国的亚裔人由于大豆食用量减少发病率增加。

染料木素又叫金雀异黄素，化学名为5，7，4’-三羟基异黄酮，英文名为Genistein；Prunetol；Genisteol，4’，5，7-trihydroxyisoflavone，分子式为C15H1005；分子量为270.23，结构式为：

染料木素的基础研究证实具有良好药理作用：①动物药效学实验证实，染料木素具有明显防治骨质疏松的作用。Andersons等报道，在成骨细胞培养基中，纯化的金雀黄素即染料木素诱导酶合成的释放的最适剂量为50～100mg/d，浓度过高将导致细胞凋亡，否则无作用，而且须长期摄入效应才能巩固。Citvell等发现，将异丙氧黄酮与骨髓基质细胞共同孵育，培养基中骨钙素浓度升高，说明该药物对骨髓细胞具有显著的刺激作用。Arjmand等以切除双侧卵巢的授乳大鼠为模型，这些大鼠因哺乳幼鼠以钙的需求较大并普遍存在骨量丢失，喂养添加异黄酮饮料两周的授乳大鼠的骨密度明显高于安慰剂组和结合雌激素(生理剂量)治疗组，但所有大鼠的子宫均无变化。Blarir等分别给予两组去势大鼠含有异黄酮或酪蛋白的饲料，前组大鼠的股骨密度明显高于后组。这些实验支持异黄酮对骨质疏松的防治作用，

初步临床试验表明染料木素具有较好骨质疏松症的治疗作用：①染料木素作为异黄酮类的主要成分，具有选择性雌激素受体调节剂作用。子宫组织富含α受体，染料木素与之结合后发挥拮抗剂作用，阻止雌二醇DNA的激活和蛋白质的合成，有效避免了雌激素替代治疗潜在诱发子宫内膜癌和乳腺癌并发症危险。②染料木素对绝经后妇女发挥着多重有益的预防保健作用。异黄酮对成人骨代谢具有良好治疗作用的发现源于亚洲人食用豆制品的流行病学调查结果。亚洲人均30～40g/d，日本人200mg/d，从中可获得异黄酮25～45mg/d，西方人来自膳食的异黄酮不足5mg/d，因此，日本妇女绝经后骨质疏松、骨折发病的低风险与异黄酮的预防作用直接相关。1973年Utian等报道非甾体雌激素与结合雌激素相比，前者能显著降低双侧卵巢切除术后女性(45例)的血钙水平；Potter等认为异黄酮可有效预防绝经后骨质疏松，而且老年绝经妇女摄入阈值量异黄酮(90mg/d)6个月即获得明显疗效。Wilcox等人体试验的初步结果提示大豆蛋白可增加骨密度。但由于豆类植物中异黄酮含量随地域、品种而有所差异，不同种族膳食习惯的差异和豆类中异黄酮的消化、吸收、循环、代谢过程都会影响血液异黄酮水平；当时，因从植物中提纯异黄酮尚难以实现，从而促进了人工合成异黄酮—异丙氧黄酮的问世。意大利、比利时、匈牙利、韩国和日本已采用异丙氧黄酮治疗绝经后骨质疏松。如意大利一项针对400余名绝经后老年骨质疏松患者为期5年的研究显示：与安慰剂组相比，治疗组(异丙氧黄酮600mg/d)不仅有明显的骨储备和骨密度改善，而且在治疗几个月后部分骨生化指标也发生显著变化。Gambacciani等证实该药可改善绝经后老年骨密度降低，并可使之恢复至绝经前骨密度水平。然而，异丙氧黄酮确实具有改善骨质疏松的作用，但常引起食欲减退、恶心、呕吐、腹痛等副作用，而且服量较多。

综上所述，染料木素为异黄酮类化合物，具有重要的生理功能如雌激素样作用和抗癌活性等，被用于预防和治疗妇科肿瘤、骨质疏松症、心血管疾病，亦用于美容、减肥、减少女性的热潮红与绝经期综合症。因此，有关染料木素的研究和开发已成为倍受人们关注的新热点。染料木素的开发应用具有良好的发展前景。但是，有关提纯工艺的文献报道不多，其纯品价格特别昂贵。Sigma公司5mg包装、纯度98％的染料木素报价为30-50美元，且价格还在逐年上升，若作为药品开发使用，必然受到限制。为此，有必要寻找来源丰富的原料和提取简单、成本低廉的制备工艺，以供大量生产，为染料木素作为药品的开发提供条件。

依据参考文献(详见文献资料部分)，紫花苜蓿中含量最高而且西北地区资源丰富，但是从紫花苜蓿中提取染料木素的工艺，由于原料叶绿素含量高，脱色困难，收率不高难以工业化。从大豆中提取genistein，由于大豆含植物蛋白和油脂太多，得到纯品(纯度＞98％)相当困难，而从槐角中提取槐角甙和染料木素早在80年代就有人报道，并对结构进行分析。但至今尚未见工业生产的报道。

经过综合比较发现，从大豆、三叶草、葛根、槐花、槐角等多种豆科植物中可提取Genistein，但是所采用的工艺、原料的成本和收率差别较大；经过优化后确定从槐角中提取Genistein。槐角属2000年版药典法定药材，分布于全国各地；资源丰富易得。从槐角中提取染料木素的工艺路线容易实现产业化。

在槐属植物中，染料木素含量低于槐角甙，且染料木素水溶解性较槐角甙差，使提取较为困难。染料木素和槐角甙的差异仅在于槐角甙4’位上多了一个葡萄糖，若将该糖去掉则由槐角甙变成染料木素。现有技术中曾报道用10％HCl酸解去糖得到了苷元。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种新的制备染料木素的工艺；

本发明的目的之二在于提供一种药物组合物，其包括以该工艺制备的染料木素为活性成分及制药领域中常用的载体；

本发明的目的之三在于提供用该工艺制备的染料木素在制备预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤、心脑血管性疾病药物中的应用；本发明的目的是这样实现的：

一种制备染料木素的工艺，首先，从植物中提取纯化槐角甙；其次，将纯化的槐角甙进行酸水解，并纯化得到染料木素。将槐角甙进行酸水解并纯化得到染料木素至少包括如下步骤：

首先，将槐角甙进行回流酸水解得到结晶；

其次，用水洗涤结晶至pH值为中性；

然后，收集沉淀物进行结晶干燥，得到染料木素。

从植物中提取纯化槐角甙至少包括：首先，将植物粗粉用醇回流提取；其次，浓缩回收醇制备浸膏，加水进行沉淀，洗去沉淀中的水溶性杂质，收集沉淀；然后，将沉淀进行有机溶剂回流脱脂，并用水洗涤沉淀，用醇进行结晶，收集沉淀；最后，结晶干燥，得到纯化的槐角甙。

用于提取的植物为中药槐角。

用于回流植物粗粉的醇为甲醇或乙醇或其混合物。为甲醇时，其浓度为80-90％，提取时间为0.5-2小时，提取次数为一次或多次，优选为三次；为乙醇时，其浓度为75-90％，料液比即重量体积比为1∶1-3。

浸膏比重为1.10-1.20。

用于回流脱脂的有机溶剂为氯仿或乙醚或其混合物。

用于洗涤沉淀的水为自来水或蒸馏水。

收集沉淀的工艺为离心或滤过。

将槐角甙进行回流酸水解的条件为：

酸解液浓度为8-12％HCl-50-70％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶5-15；

温度为80-95℃；

时间为2-4小时。

将槐角甙进行回流酸水解的条件优选为：

酸解液浓度为10％HCl-60％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶10；

温度为90℃；

时间为3.5小时。

预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤、心脑血管性疾病的药物组合物，含有上述工艺制备的染料木素为活性成分，以及药学上可接受的载体。

药物组合物为胶囊剂或片剂或颗粒剂或注射剂或缓释剂或丸剂或冻干剂。

上述工艺制备的染料木素在制备预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤、心脑血管性疾病的药物中的应用。

根据本发明，通过本发明的制备工艺制备的染料木素在与抗骨质疏松有关的药理试验中显示出优良的抗骨质疏松活性。

本发明因此还涉及含有该工艺制备的染料木素作为活性成份的有效剂量的化合物以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。

药物组合物可根据本领域已知的工艺制备。用于此目的时，如果需要，可将用该工艺制备的染料木素与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明制备的染料木素的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。通常对成人患者，所给本发明制备的染料木素的日剂量为50.4mg-100.8mg。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

根据本发明，本发明制备的染料木素在抗骨质疏松中显示出优良效果。因而可作为抗骨质疏松药用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。

根据文献资料和临床研究，本发明制备的染料木素还可以用于预防和治疗妇女更年期综合症，预防和治疗肿瘤，预防和治疗心脑血管性疾病。

本发明建立了先从豆科植物中提取纯化槐角甙再酸水解生成染料木素的提取纯化工艺，该工艺简便、易行，平均产品收率达到0.636％，槐角甙纯度(HPLC归一化法)达到95％以上，染料木素纯度(HPLC归-化法)大于98％，并经过核磁、紫外、质谱、熔点测定等分析，证明其结构、理化性质与文献报道完全一致。同时该工艺适用于批量生产，并大大降低了生产成本。

附图说明：

图1为本发明的制备槐角甙的工艺流程图；

图2为本发明的从槐角甙制备染料木素的工艺流程图。

具体实施方式：

以下将结合附图和实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：

染料木素的制备工艺(以槐角为例)：

槐角(2000年版中国药典P292)系豆科植物Sophora japonica L.的干燥成熟果实；槐角的性味属苦、寒，归肝、大肠经。具有清热泻火，凉血止血之功能；主治肠热便血，痔肿出血，肝热头痛，眩晕目赤等症。槐角中提取的异黄酮单体成分即染料木素(Genistein)的中文异名为染料木因或金雀异黄素，英文异名为Prunetol或Genisteol。化学名为4H-1-Benzopyran-4-one，5，7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)。分子式为C₁₅H₁₀O₅；分子量270.23。Genistein为长方形或六边形棒状结晶(60％乙醇)；树枝状结晶(乙醚)，熔点297～298℃(略微分解)。溶于常用的有机溶剂，几乎不溶于水。溶于稀碱显黄色。

槐角甙是在染料木素的4’位上连有一个葡萄糖，形成葡萄糖甙故又叫染料木素-4-葡萄糖甙。英文名Sophoricoside。由于比染料木素多一个葡萄糖，其水溶性较染料木素大。槐角甙的结构式如下图。

在槐角甙的提取中，为了防止大量植物蛋白提取出来而影响以后分离，故采取用高醇提取，使蛋白变性的工艺，又根据槐角甙和染料木素水溶性差的特点，以水作为溶剂去除水溶性物质，对其进行纯化。利用槐角甙在氯仿、乙醚中几乎不溶的特性，选用氯仿、乙醚脱脂，考虑到以后工业生产，因乙醚沸点太低，不适宜大规模生产中使用而选用氯仿。

该工艺的大体流程如下：

槐角筛选处理→粗粉→甲醇(或乙醇)回流提取→浓缩回收醇→浸膏→加水沉淀槐角甙→洗去水溶杂质→收集沉淀→有机溶剂回流脱脂→水洗沉淀→醇结晶槐角甙→收集结晶体(该结晶体即为槐角甙)→加HCl酸解→酸解液→回收酸醇→沉淀→水洗涤→收集沉淀→醇溶解→结晶→收集结晶(该结晶即为染料木素)

该工艺的详细步骤为：

步骤一：槐角甙的制备：

1、筛选槐角并进行处理，得到槐角粗粉；

槐角筛选：槐角(Fructus sophorae)为豆科植物槐Sophora japoniaL.的干燥成熟果实。按中华人民共和国药典2000年版第292～293页要求鉴别和收集。

槐角洗涤与干燥：将收集来的槐角过筛，拣去树枝等杂物后快速用水冲洗去泥沙，烘干(80℃～90℃)。

槐角粉碎：将烘干的槐角用粉碎机粉碎，最大颗粒不超过0.8×1cm。

2、槐角粗粉用醇进行回流提取后，浓缩所回收的醇得到浸膏；

用于回流植物粗粉的醇为甲醇或乙醇或其混合物。为甲醇时，其浓度为80-90％，提取时间为0.5-2小时，提取次数为一次或多次，优选为三次；为乙醇时，其浓度为75-90％，料液比即重量体积比为1∶1-3。浸膏比重为1.10-1.20。

3、向浸膏中加水，产生沉淀，用水洗去水溶性杂质后，收集沉淀；用于洗涤沉淀的水为自来水或蒸馏水。

收集沉淀的工艺为离心或滤过。

4、将沉淀用有机溶剂回流脱脂后，收集沉淀；

用于回流脱脂的有机溶剂为氯仿或乙醚或其混合物，优选为氯仿。

收集沉淀的工艺为离心或滤过。

5、将沉淀用醇进行再结晶，所收集的结晶体即为槐角甙。

步骤二：酸解槐角甙制备染料木素：

1、将槐角甙在酸性条件下回流水解；

回流酸水解的条件为：

酸解液浓度为8-12％HCl-50-70％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶5-15；

温度为80-95℃；

时间为2-4小时。

特别优选为：

酸解液浓度为10％HCl-60％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶10；

温度为90℃；

时间为3.5小时。

2、回流后的酸醇溶液回收后用水进行沉淀，将沉淀用水洗涤至pH值为中性后收集；

用于洗涤沉淀的水为自来水或蒸馏水。

收集沉淀的工艺为离心或滤过。

3、将沉淀用醇进行再结晶，所收集的结晶体即为染料木素。

药物组合物的制备：

本发明制备的染料木素或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等，可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分的本发明化合物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

该工艺制备的染料木素及其制剂的药理学试验结果：

1、染料木素的主要药效学试验结论：①染料木素可抑制去势模型大鼠的体重增加，增加维甲酸模型大鼠的体重，并明显增加维甲酸大鼠的左股骨重量、左胫左胫骨重量和(P＜0.05或P＜0.01)。②模型大鼠的血清Ca、P、Mg、CT水平明显降低，BGP、ALP水平升高，与正常对照组有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)；4.5mg/kg、9mg/kg染料木素治疗后，上述各指标均显著改善，与模型组比较相差显著(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可显著改善模型大鼠股骨最大载荷、最大桡度、弹性载荷、弹性桡度；其作用明显优于骨疏康(阳性对照药)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明显增强模型大鼠的股骨、胫骨和腰椎L2-4的骨密度(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明显升高维甲酸和去势模型大鼠血清中微量元素含量(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明显增加模型大鼠的骨小梁面积百分比(BV/TV％)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数目(Tb.N)，降低骨小梁间隔(Tb.Sp)。13mg/kg、26mg/kg染料木素具有显著抗炎和镇痛作用(P＜0.05或P＜0.01)。对小鼠单核巨噬系统有明显抑制作用(P＜0.01)。⑨拟推荐临床用药采用口服法；成人日用剂量为50.4～100.8mg[计算工艺：4.5mg/kg(9.0/中剂量)用药剂量×(200/1000)kg大鼠体重×56体重指数＝50.4(100.8)mg]。⑩推荐用药3个月为一疗程。

2、染料木素一般药理研究的试验结论：染料木素给药后对小鼠自主活动次数，大鼠的呼吸频率，ECG(心电图)，BP(血压)变化不明显；故染料木素对神经系统，呼吸系统，心血管系统无明显影响，提示临床用药具有安全性。

3、染料木素的小鼠急性毒性试验结论：按最大耐受量(MTD)测定法，给30只小鼠一日内分两次(间隔6h)灌胃染料木素24g/kg，观察一周无动物死亡，表明该试药MTD＞24g/kg，该剂量是临床成人用药剂量的21818倍[24g/kg×1000mg÷1.1mg/kg(平均76mg÷70kg体重)成人日用剂量]。

4、染料木素大鼠长期毒性实验结论：8、160和320mg/kg(相当于临床成人拟用剂量7、146、291倍)染料木素连续灌胃给药6个月，对动物的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、膀胱、淋巴结、脑、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、股骨、腰(胸)椎骨、视神经及垂体等脏器，经病理组织学检查，未见由药物所致的病理性改变。

5、染料木素Beagle犬长期毒性试验结论：试验结果表明，Beagle犬连续口服6mg/kg d^-1，250mg/kg d^-1，500mg/kg d^-1(相当于临床成人拟用剂量的6、227、455倍)染料木素36周，对Beagle犬的生长、发育、饮食、精神状态、大小便无明显影响。对消化道、血液常规指标及肝、肾功能无明显毒性。对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无损害。

6、染料木素致突变试验结论：染料木素诱发鼠伤寒沙门氏菌TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀、TA₁₀₂的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍。根据《中药新药研究指南》结果评定标准，受检样品——染料木素的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果为阴性。

染料木素小鼠骨髓微核试验，试验溶剂对照雌、雄性小鼠的微核率分别为5.0‰、3.0‰；阳性对照雌、雄性小鼠的微核率分别为65.8‰、64.8‰，符合试验工艺的要求。受检样品——染料木素各剂量组的微核率与溶剂对照组进行统计学处理，未见有显著性差异。根据《中药新药研究指南》结果评定标准，受检样品染料木素的小鼠骨髓微核试验结果为阴性。

7、染料木素致畸变试验结论：染料木素小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验，本试验溶剂对照和阳性对照组的染色体畸变率分别为1.0％和2.8％，两组的染色体畸变率用X²检验进行统计学处理，有显著性差异(P＜0.05)，符合试验工艺的要求。受检样品各剂量组的染色体畸变率为0.8％～1.2％，与溶剂对照组的染色体畸变率用X²检验进行统计学处理，均未见有显著性差异。根据《中药新药研究指南》结果评定标准判定，受检样品染料木素的小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验结果为阴性。

8、染料木素生殖毒理试验结论：染料木素的一般生殖毒性试验，雌、雄性大鼠试验组给予受检样品染料木素剂量分别为：16、160、480mg/kg·bw；溶剂对照给予0.5ml/kg·bw蒸馏水。雄性大鼠连续给药60天后与给药14天的雌性大鼠合笼，雄性大鼠给药至交配结束，雌性大鼠给药至妊娠第17天。各组孕鼠1/2于妊娠第14天剖检，另1/2孕鼠使其自然分娩哺乳；仔鼠于第28、35天分别处死1/2剖检，观察有无畸形。试验结果表明：受检样品染料木素480mg/kg·bw剂量引起亲代雄性大鼠精子活动度下降，但未发现睾丸病变，也未影响雄鼠生殖能力；同时使雌鼠妊娠期体重增长明显低于其他组，但未影响胚胎形成、仔鼠的生长发育。160mg/kg·bw剂量对亲代和仔代未引起明显的异常。因此，根据本试验结果认为受检样品染料木素对大鼠不具有一般生殖毒性。

9、染料木素药代动力学结论：采用高效液相色谱(HPLC)法研究染料木素在大鼠体内的药代动力学。本研究所建立的HPLC法经标准曲线制备、特异性、回收率及精密度考察，符合新药药代动力学研究技术的基本要求。大鼠灌胃(ig)给予6.25、12.5和50mg/kg的染料木素(分别为人推荐用量的2.5、5、20倍)，发现染料木素ig后能迅速吸收入血，血浆中药物的消除与给药剂量有关，50mg/kg呈现异常动力学过程。6.25和12.5mg/kg两剂量的药-时数据经3P97药代动力学软件分析，体内过程符合一室模型，平均消除t_1/2Ke为6.006h。与大鼠尾静脉注射9mg/kg染料木素的AUC相比，该药胶囊剂ig给药的绝对生物利用度为66.28％。大鼠ig给予12.5mg/kg染料木素，测定不同时间原型药物的组织分布，发现除胃肠组织外，其他组织在给药后80min药物分布达最高，其中以肝脏、肾、子宫和卵巢组织分布较多，以后随时间延长而逐渐降低，在同一时间以胃肠组织药物含量最高。染料木素吸收入血后，迅速与葡萄糖醛酸结合，且结合量与给药剂量呈正相关(吸收相)。大鼠ig给予9mg/kg染料木素，24h内药物经尿的排谢率为9.63％(原型药物及葡萄糖醛酸结合形式)，经粪便的排谢率为20.06％(原型药物及葡萄糖醛酸结合形式)。

染料木素的临床应用：

1、抗肿瘤作用

大豆异黄酮有明显的抗肿瘤作用，特别是对激素依赖性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、子宫内膜癌和卵巢癌，植物雌激素(主要为染料木素)与雌二醇竞争性地结合雌激素受体，从而抑制雌二醇对肿瘤细胞的促有丝裂作用，抑制肿瘤的生长。

另外，抑制与癌症相关的酶合性，特别是酪氨酸激酶、染料木素还能抑制一些与DNA切断有关酶后性的作用。

动物实验表明，给染料木素200mmol/kg，可抑制β/6F-10黑色素细胞诱导的肺转移癌小结形成，抑制率53.6％，小鼠寿命延长47.7％。

2、预防和治疗妇女更年期综合症

研究发现，妇女更年期综合症亚洲比西方低，这与动物中大豆制品含量有关，日本妇女比加拿大妇女面颈红热的次数低，原因是食物中植物雌激素含量高，特别是染料木素含量高，现已用于雌激素替代治疗的I期临床和志愿者试验。采用植物雌激素治疗绝经期妇女老年性痴呆症发生的危险下降40％，在植物雌激素中，染料木素因来源丰富而受重视。

3、预防和治疗骨质疏松症

染料木素能有效缓解因切除卵巢后大鼠的骨质减少能使大鼠骨密度回复到与未切除卵巢大鼠相近水平。98年有人研究确认投与90mg异黄酮人群的脊椎骨密度明显长高，更年期妇女服异黄酮5～10周，血管弹性增强26％(P＜0.001)，去卵巢大鼠喂染料木素0.5mg/d，14d后骨密度升高17％。

4、预防和治疗心、脑血管疾病

人群服用56～90mg/日异黄酮6个月，血中非HDL胆固醇明显下降，而HDL胆固酮含量相对升高，另外，抑制血小板凝集，以及抑制血管内皮细胞增生等作用而用于预防动脉硬化及冠状动脉疾患。

另外，异黄酮对其它动脉粥样硬化相关因子也有影响，从而抑制动脉

另外，异黄酮对其它动脉粥样硬化相关因子也有影响，从而抑制动脉粥样硬化形成。

Claims (12)

1、一种制备染料木素的工艺，其特征在于：

首先，从植物中提取纯化槐角甙；

其次，将纯化的槐角甙进行酸水解，并纯化得到染料木素；所述的将槐角甙进行酸水解并纯化得到染料木素至少包括如下步骤：

首先，将槐角甙进行回流酸水解得到结晶；

其次，用水洗涤结晶至pH值为中性；

然后，收集沉淀物进行结晶干燥，得到染料木素。

2、根据权利要求1所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：从植物中提取纯化槐角甙至少包括：

首先，将植物粗粉用醇回流提取；

其次，浓缩回收醇制备浸膏，加水进行沉淀，洗去沉淀中的水溶性杂质，收集沉淀；

然后，将沉淀进行有机溶剂回流脱脂，并用水洗涤沉淀，用醇进行结晶，收集沉淀；

最后，结晶干燥，得到纯化的槐角甙。

3、根据权利要求1或2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的植物为中药槐角。

4、根据权利要求2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的用于回流植物粗粉的醇为甲醇或乙醇或其混合物。

5、根据权利要求4所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的用于回流植物粗粉的醇为甲醇时，其浓度为80-90％，提取时间为0.5-2小时，提取次数为三次。

6、根据权利要求4所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的用于回流植物粗粉的醇为乙醇时，其浓度为75-90％，料液比即重量体积比为1∶1-3。

7、根据权利要求2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的浸膏比重为1.10-1.20。

8、根据权利要求2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的用于回流脱脂的有机溶剂为氯仿或乙醚或其混合物。

9、根据权利要求2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的用于洗涤沉淀的水为自来水或蒸馏水。

10、根据权利要求2所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的收集沉淀的工艺为离心或滤过。

11、根据权利要求1所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的将槐角甙进行回流酸水解的条件为：

酸解液浓度为8-12％HCl-50-70％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶5-15；

温度为80-95℃；

时间为2-4小时。

12、根据权利要求11所述的制备染料木素的工艺，其特征在于：所述的将槐角甙进行回流酸水解的条件优选为：

酸解液浓度为10％HCl-60％乙醇液；

料液比即重量体积比为1∶10；

温度为90℃；

时间为3.5小时。

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