CN109438407B - 一种制备染料木素的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备染料木素的工艺,其特别处是从豆科植物中直接用无机溶剂提取染料木甙(槐角甙)沉淀纯化后再酸水解生成染料木素或用无机溶剂提取槐角甙混合物后直接酸水解生成染料木素再纯化的制备工艺。上述两项改良工艺关键是省略醇提、三氯甲烷(氯仿)、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂脱脂步骤，利于环保，简化了步骤，节省了成本，提高了收率，适用于批量生产。按照本发明所述工艺制得的染料木素在预防和治疗骨质疏松症、妇女更年期综合症、肿瘤和心、脑血管性疾病、抗辐射的应用,属于药物制造和药物治疗领城。

Description

一种制备染料木素的工艺

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种制备染料木素的工艺。

背景技术

研究文献显示染料木素具有双向调节机体雌激素水平和有选择的与雌激素受体结合作用，临床药理应用研究主要有：

1、染料木素与心血管疾病

染料木素对降低心血管疾病的发病率有着十分重要的作用。血液中低密度脂蛋白胆固醇高，易被氧化，会引起动脉粥样硬化，染料木素通过抗氧化作用可以有效地降低胆固醇，抑制低密度脂蛋白胆固醇(LDL)氧化，并使血中的LDL保持较低水平，改善高脂所致体内过氧化状态异常，缓解对机体的过氧化损伤。染料木素可使LDL受体发生上调，增加LDL受体活性，从而促使胆固醇清除。染料木素通过对酪氨酸激酶的抑制作用阻断PDGF生成，从而抑制凝血酶诱导的血小板激活和凝聚，可以减少全身与动脉粥样硬化有关的血栓的形成。染料木素有清除自由基的功能，因此对缺血再灌注引起的损伤有保护作用，并可增加心肌肌浆网钙离子的摄取率和钙ATP酶的活性。染料木素还具有抑制平滑肌细胞的增殖和血管的生成以及抑制细胞粘附的作用，而降低心血管疾病的发病率。

2.染料木素与脑神经的作用

最新文献报道，染料木素具有促进脑神经再生和脑昏迷的促醒作用。现代医学理论认为中风(脑出血)、脑卒中(脑梗)发生时，脑组织细胞缺血缺氧、变性、坏死等一系列病理生理变化过程与脑组织细胞外大量钙离子内流有着密切的关系；脑细胞内钙离子的超负荷是引起脑细胞变性、坏死的主要原因之一。最新研究发现，改变给药途径后，染料木素可以通过血脑屏障，通过影响脑细胞膜Ca++受体，当中风(脑出血)、脑卒中(脑梗)发生时，可以保护脑细胞。

3、染料木素与癌症

染料木素通过①抗氧化作用②抑制酪氨酸激酶活性③抑制拓扑异构酶活性④雌激素与抗雌激素样作用⑤减少肿瘤血管生成作用而对多种癌症具有抑制和治疗作用。

4、染料木素与抗辐射

染料木黄酮(染料木素)是一种蛋白质酪氨酸激酶活性的有效抑制剂,还拥有抗氧化和雌激素样作用，在隶属于美国武装部队放射生物学研究所(AFRRI)实验室工作的landauer等人证实它是放射保护剂，无论照射前24小时皮下注射或辐照前4天灌胃或辐照后4天灌胃，染料木黄酮能显著提高受到致命创伤性脑损伤的全身照射剂量(9.5Gy)时小鼠的30天的生存率。

美国有人利用染料木素具有抗辐射作用将其用于肿瘤放射治疗产生副作用的预防和治疗用品(Bio 300)，文献报道，染料木素在创伤性脑损伤(7.75Gy)照射前服用染料木素也可以减少长期生存动物的肺损伤。

5、染料木素与妇女更年期综合症

染料木素具有弱雌激素活性，具有雌激素的作用，研究表明妇女更年期，由于卵巢退化，体内雌激素减少，妇女就会出现一系列的更年期综合症症状，而在更年期摄入定量的染料木素可补充体内雌激素不足，起到预防和减少妇女更年期综合症的作用。实验提示雌激素样作用可能是染料木素防止骨质疏松的主要机制。

6、另外，染料木素可抑制小肠对糖的吸收，更好地调整体内糖代谢平衡，对糖尿病患者的代谢紊乱也有一定的调节功能；染料木素通过降低肾病引起高脂血症(LDL)、有利尿作用防治肾病。

目前，染料木素开发成预防和治疗骨质疏松症的国家中药一类新药正在进行中，已完成一期临床试验(批件号2004L01547)，人用安全性符合预期，使染料木素开发新药品的前期风险大为降低。于2016年进行二期临床试验，病例观察已完成，结果正在统计分析中，预计2018年下半年揭盲。

考虑到染料木素具有极高的临床应用价值，其制备工艺成为本领域的热点研究方向，如中国专利ZL02123450.7公开了一种染料木素的制备工艺，该工艺解决了大量制备高纯度染料木素的难题，使染料木素的广泛应用成为可能；但其存在着以下技术缺陷：(1)该工艺“首先，将植物粗粉用醇回流提取”，醇在提取槐角甙时也提取了脂肪，增加了脱脂和回收醇的步骤，另外，醇提相对成本要高；(2)该工艺“其次，浓缩回收醇制备浸膏，加水进行沉淀，洗去沉淀中的水溶性杂质，收集沉淀”，浸膏较难溶解，需加热水溶解，若处理不好会影响纯度或收率；(3)该工艺“然后，将沉淀进行有机溶剂回流脱脂，并用水洗涤沉淀，用醇进行结晶，收集沉淀”，“回流脱脂的有机溶剂为氯仿或乙醚或其混合物，优选氯仿”。依据人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)常用有机溶剂分类及残留限度标准，氯仿为第二类溶剂(指无基因毒性但有动物致癌性的溶剂)，不宜在制药中使用，虽然可用乙酸乙酯代替，但须测染料木素原料药中残留。氯仿大量使用也影响环保(建药厂时有环保要求)，有机溶剂回流脱脂技术影响了染料木素原料药的应用。另外，醇提和有机溶剂脱脂也增加了生产成本。有鉴于此，克服以上缺陷，改良工艺，省略醇提、有机溶剂脱脂(三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯等)步骤，利于环保，简化步骤，节省成本，提高收率，适用于批量生产，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的制备染科木素的工艺；

本发明的目的是这样实现的:

一种制备染料木素的工艺，包括如下步骤：

(1)用无机溶剂从植物或其粗粉中提取得染料木甙(槐角甙)液体；

将所述染料木甙(槐角甙)液体进行稀释、沉淀，弃上清，酸解，收集沉淀，得到染料木素粗品；

或将所述染料木甙(槐角甙)液体直接或进行浓缩后进行酸解，收集沉淀，得到染料木素粗品；

(2)对所述染料木素粗品进行纯化,得到高纯度染料木素。

本发明所述的工艺共涉及两种不同的方案，且仅在步骤(1)中所涉及的酸水解的对象不同。

作为技术方案之一(下文也可成为方案一)，是用无机溶剂从植物中提取得染料木甙(槐角甙)液体，将所述染料木甙(槐角甙)液体进行稀释、沉淀，弃上清后所得沉淀物再进行酸水解；

作为另一技术方案(下文也可成为方案二)，将所述染料木甙(槐角甙)液体直接酸水解或浓缩后进行酸水解。

就方案一而言，步骤(1)至少包括：

首先,用无机溶剂对植物或其粗粉进行回流提取，收集提取液；

其次,用水稀释所述提取液至原体积的3-7倍，加酸调pH值至3-6；静置沉淀，收集沉淀物；

再次，酸解所述沉淀物，得酸解物；

最后,将所述酸解物调整pH至3-6，稀释，放置，收集结晶沉淀物即为染料木素粗品。

其中，所述无机溶剂为pH为6-9.5的碱的水溶液；优选所述碱的水溶液可由氢氧化钠、氨水、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸氢钾或石灰水配置而成(即以水为溶剂，加碱调pH值至6-9.5所得的溶液)。

本发明所述的回流提取，优选无机溶液与植物或植物粗粉的料液比即重量体积比为1:2-5；提取时间为0.5-2.5小时,提取次数为2～4次(优选3次)。

优选地，提取结束后“用水稀释所述提取液至原体积的3-7倍，加酸调pH值至3-6”，此处的酸优选自草酸、醋酸、盐酸、硫酸、磷酸、碳酸中的一种或几种，优选以稀释所述提取液至原体积的3-7倍为宜，采用该步骤，可利于染料木苷等成分沉淀。

优选地，所述酸解的条件为：

酸解液浓度为8-12％HCl-50-70％乙醇液；

料液比即重量体积比为1:5-15；

温度为80-95℃；

时间为2-4小时；

更优选为:

酸解液浓度为10％HC1-60％乙醇液；

料液比即重量体积比为l:l0；

温度为90℃；

时间为3小时。

就方案二而言，步骤(1)至少包括：

首先,将植物或植物粗粉用无机溶剂回流提取，收集提取液；优选所述无机溶剂为pH为6-9.5的碱的水溶液；(该步骤具体同方案一)

其次,将所述提取液直接加酸酸解或浓缩所述提取液至比重为1.03-1.06；再对所述浓缩液进行酸解；

然后,将酸解物稀释并调整pH至3-6后放置，使染料木素充分结晶沉淀，或直接将所述酸解物放置使染料木素充分结晶沉淀。此时，若酸解物悬浮不沉或有糖胶物悬浮时加水稀释1-5倍，调整pH至3-6，放置过夜沉降，去上清，留沉淀，用pH为3-6的水洗涤沉淀,洗去沉淀中的水溶性杂质。

优选地，所述酸解可使用盐酸、硫酸、醋酸、磷酸或草酸中的一种或几种；优选酸的加入量以酸解液中酸的终浓度为4-12％。

优选地，所述酸解的条件为：

酸解液酸的终浓度为4-12％；

温度为80-95℃；

时间为2-4小时。

优选地，将酸解物放置，使染料木素充分结晶沉淀，收集结晶沉淀物，用水洗涤结晶至pH值为中性，然后收集沉淀物即为染料木素粗品。

对上述粗品进行醇溶解，加入脱色剂脱色，过滤去渣，重结晶，干燥，得到染料木素。

本发明所述的工艺，所述步骤(2)至少包括：

首先，用醇或醇水液将所述染料木素粗品溶解，过滤(除去水提取时带入的颗粒杂物和酸解碳化杂质)，收集过滤液；或在溶解所述染料木素粗品的同时加入脱色剂脱色，完成后过滤除去脱色剂(及其上述杂质，提高样品纯度，降低色素，改变样品外观色泽)；

其次，回收醇使染料木素结晶，收集结晶并使其干燥，得到染料木素。

优选地，所述“醇或醇水液”中，所述醇水液为醇浓度大于50％的水溶液；所述醇为甲醇或乙醇。

优选地，所述脱色剂可选自活性炭、氧化铝、白土或吸附树脂；所述脱色优选以加热回流的形式进行脱色，具体为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。

优选地，所述的植物选自中药槐角、三叶草或苜蓿，特别优选为槐角。

本发明改良的先从豆科植物中提取纯化染料木甙(槐角甙)再酸水解生成染料木素的提取纯化工艺(方案一),平均产品收率达到1.02％，比原工艺收率(0.636％)增加0.384％，增加比率为60.38％,染料木素纯度(HPLC归一化法)大于98％；

本发明改良的先从豆科植物中提取纯化染料木甙(槐角甙)混合液再加酸水解生成染料木素的提取纯化工艺(方案二),平均产品收率达到0.88％，比原工艺收率(0.636％)增加0.244％，增加比率为38.36％,染料木素纯度(HPLC归一化法)大于98％；

上述两项改良工艺关键是省略醇提、三氯甲烷(氯仿)、乙醚等有机溶剂脱脂步骤，利于环保，简化步骤,节省成本，适用于批量生产，同时收率也得到了明显提升,本发明提供的两方案收率0.88％-1.02％，比原工艺(中国专利ZL02123450.7公开的工艺)最高可高出60.38％。

附图说明

图1为染料木素制备的工艺流程图

图2为染料木素制备的工艺流程图

图3为槐角甙HPLC分析图谱(编号3011)

图4为染料木素HPLC分析图谱(编号5661)

图5为槐角甙HPLC分析图谱(编号4441)

图6为染料木素HPLC分析图谱(编号5801)

图7为染料木素HPLC分析图谱(编号5805)

图8为染料木素HPLC分析图谱(编号5777)

图9为染料木素HPLC分析图谱(编号4424)

图10为染料木素HPLC分析图谱(编号5765)

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

以实施实例对本发明进行进一步的说明。

染料木素的制备工艺(以槐角为例):

槐角甙是在染料木素的4'位上连有一个葡萄糖,形成葡萄糖甙故又叫染料木素一4一葡萄糖甙。英文名Sophoricoside.由于比染科木素多一个葡萄糖,其水溶性较染料木素大。

在槐角甙的提取中,原工艺中为了防止大量植物蛋白提取出来而影响以后分离,故采取用高醇提取,使蛋白变性,但高醇提取中会有大量的脂类物质，需脱脂，影响环保，现在我们利用染料木苷易溶于碱性热水的特点用pH6-9.5的碱水热回流提取染料木甙，又根据槐角甙和染料木素水溶性差的特点,以水作为溶剂去除水溶性物质,对其进行纯化。

方案一提取槐角甙并纯化后酸解制备染料木素的改良工艺

大体流程如下:

槐角筛选处理→碱水浸泡→碱水提取→提取液→稀释→沉淀→槐角甙→酸水解→水洗酸解沉淀至中性→醇溶酸解沉淀→过滤→旋蒸回收醇→结晶→收集结晶(该结晶即为染科木素)

其中，以下实施例中槐角筛选如下:槐角(Fructus sophorae)为豆科植物槐Sophora japoniaL.的干燥成熟果实。按中华人民共和国药典2015年版一部第355页要求鉴别和收集。

实施例一、提取槐角甙并纯化后酸解制备染料木素的改良工艺(流程图见图1)

一、槐角甙的制备:

1、筛选槐角并进行处理,得到槐角及豆；

槐角洗涤与干燥:将收集来的槐角过筛,拣去树枝等杂物后快速用水冲洗去泥沙,烘干(80℃～90℃)。

2、称取槐角200g按料液比(重量体积比)1:4加入蒸馏水，用3mol氢氧化钠调pH为9，进行回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间为2.5小时，终体积195ml,用密度计测比重1.04g/ml。

按料液比1:3进行第二次回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间2小时终体积250ml,比重1.02g/ml。

按料液比1:2进行第三次回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间为1.5小时终体积260ml,比重1.02g/ml。

3、取提取液按体积比1:5加水稀释，调溶液pH为4.32放置自然沉淀≥24h，6700rpm离心10min收集沉淀，烘干，称重15.26g，即为染料木甙粗品。

用高效液相色谱(HPLC)进行分析检测，纯度48.18％，分析条件和图谱(编号3011)见图3。

高压液相色谱仪：Waters2695，美国Waters公司产品。色谱条件：流动相甲醇：水(45：55)；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；色谱柱Dubhe-C18。

二、酸解槐角甙制备染料木素粗品:

1、向上述染料木甙粗品14.85g中加10％盐酸60％乙醇水溶液150ml，搅拌溶解，90℃加热恒温回流4h，放置冷却，12000rpm离心15min,上清120ml、沉淀6.23g；水洗沉淀至中性，收集沉淀，称重湿重为4.9g。

2、将上述离心上清液加入旋蒸瓶，加热回收酸醇，旋蒸所得物加水按1:1稀释，调pH至4.26，放置过夜，12000rpm离心15min，收集沉淀，称重湿重为5.02g。

3、合并上述两步湿重沉淀，烘干，称重2.98g；将其用乙醇溶解，过滤，蒸发醇，即为染料木素2.38g。

经计算染料木素收率为1.19％，用高效液相色谱(HPLC)进行分析检测，纯度＞98％，分析条件和图谱(编号5661)见图4。

高压液相色谱仪：Waters2695，美国Waters公司产品。色谱条件：流动相甲醇：水(45：55)；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；色谱柱Dubhe-C18。

实施例二、提取槐角甙并纯化后酸解制备染料木素的改良工艺工厂级试验研究

一、槐角甙的制备:

1、收购已处理好槐角500公斤，投料200公斤，在工厂用植物提取罐3T(陕西省三原县宏达植提厂制造)，提取方案按实施例1的方案进行。

2、合并三次提取液约1.5吨，测比重1.02g/ml。

3、取上述提取液100公斤按体积比1:5稀释，调pH至4.5左右，放置自然沉降后倾倒上清，工厂离心收集沉淀700g，烘干357g，经HPLC检测为染料木素和槐角苷混合物，其中槐角苷为9.83％，染料木素为86.63％。HPLC分析图谱(编号4441)见图5。

二、酸解槐角甙制备染料木素粗品:

1、按料液比1:10向上述染料木甙粗品中加10％盐酸60％乙醇水溶液，搅拌溶解，90℃加热恒温回流3h，待冷却，加水稀释(此处也可旋蒸回收酸醇，然后稀释沉降),调pH为4.0，放置过夜，6700rpm离心25min，水洗沉淀至中性，收集沉淀，称重252.25g。将其用乙醇溶解，过滤，回收醇，烘干，称重136g。

经计算收率为1.02％，用高效液相色谱检测纯度为98.37％，HPLC分析图谱(编号5801)见图6。

方案二提取槐角苷并直接(或浓缩后)酸解制备染料木素的改良工艺

简述流程如下:

槐角筛选处理→碱水浸泡→碱水提取→(提取液浓缩)→酸水解→水洗酸解沉淀至中性→醇溶酸解沉淀→脱色→过滤→旋蒸回收醇→结晶→收集结晶(该结晶即为染科木素)

实施例三、提取槐角甙并直接(或浓缩后)酸解制备染料木素的实验室研究(流程图见图2)

一、槐角甙的提取:

1、筛选槐角

同实施例一中槐角筛选。

2、称取槐角370g按料液比(重量体积比)1:4加入pH8.5的水进行回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间为2.5小时，终体积970ml,用密度计测比重1.04g/ml。

按料液比1:3进行第二次回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间为2小时，终体积1050ml,比重1.02g/ml。

按料液比1:2进行第三次回流提取；温度为96℃-99℃,提取时间为1.5小时，终体积600ml,比重1.02g/ml。

3、合并提取液2620ml，用电热套加热保温浓缩，浓缩温度保持在94℃-98℃，不宜给持续高温，浓缩液终体积1400ml,比重1.055g/ml。

二、酸解槐角甙制备染料木素粗品:

1、向上述浓缩液中加入浓盐酸110ml，95℃回流水解2.5小时。

2、向回流后的酸水溶液加水稀释，水洗涤沉至pH值为中性，6000rpm离心25min收集沉淀，即为染料木素粗品，烘干13.7g、收率3.7％。

用高效液相色谱(HPLC)进行分析检测，染料木素纯度为95.97％，图谱(编号5805)见图7。

三、染料木素脱色、结晶:

1、将染料木素粗品用乙醇溶解，过滤出去未溶解杂质，加入活性炭10g，水浴回流脱色，温度90℃，回流3小时后趁热用纸浆抽滤，收集抽滤液。

2、将收集的抽滤液旋蒸回收醇，离心或抽滤旋蒸所得物为染料木素结晶，干燥，称重3.51g。

经计算收率为0.95％，用高效液相色谱(HPLC)进行分析检测，染料木素纯度为99.61％，图谱(编号5777)见图8。

实施例四提取槐角苷并直接酸解制备染料木素的工厂级试验研究

一、槐角甙的制备:

1、收购已处理好槐角500公斤，投料200公斤，在工厂用植物提取罐3T(陕西省三原县宏达植提厂)，提取方案按实施例二的方案进行。

2、合并三次提取液约1.5吨，测比重1.02g/ml。

二、直接加酸水解槐角甙提取液制备染料木素粗品:

取上述提取液1.4吨投入酸解反应釜，加入工业盐酸60公斤，加热搅拌，98℃恒温酸解约2.5h。放出酸解液入缸，加水稀释，放置过夜，去上清，水洗沉淀至中性，离心收集沉淀，烘干3309g，即为染料木素粗品，其中染料木素占91.74％，槐角甙占0.53％，分析图谱(编号4424)见图9。

三、染料木素脱色结晶:

1、将染料木素粗品用乙醇溶解，过滤出去未溶解杂质，加入活性炭165.4g水浴回流脱色，温度90℃，回流3小时后趁热用纸浆抽滤，收集抽滤液。

2、将收集的抽滤液回收醇，离心所得物为染料木素结晶，干燥，称重1651g.

经计算收率为0.88％。

用高效液相色谱(HPLC)进行分析检测，染料木素纯度为99.54％，图谱(编号5765)见图10。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (1)

1.一种制备染料木素的工艺，其特征在于：包括如下步骤：

槐角甙的制备：

（1）筛选槐角并进行处理,得到槐角豆；

槐角洗涤与干燥：将收集来的槐角过筛，拣去树枝杂物后快速用水冲洗去泥沙，80℃~90℃烘干；

（2）称取槐角200g按料液比1:4加入蒸馏水，用3 mol/L 氢氧化钠调pH为9，进行回流提取;温度为96℃-99℃，提取时间为2.5小时，终体积195 mL，用密度计测比重1.04 g/mL；

按料液比1：3进行第二次回流提取；温度为96℃-99℃，提取时间2小时终体积250 mL，比重1.02 g/mL；

按料液比1：2进行第三次回流提取；温度为96℃-99℃，提取时间为1.5小时，终体积260mL，比重1.02 g/mL；

（3）取提取液按体积比1：5加水稀释，调溶液pH为4.32放置自然沉淀≥24h，6700 rpm离心10 min收集沉淀，烘干，称重15.26 g，即为染料木甙粗品；

酸解槐角甙制备染料木素粗品：

（4）向上述染料木甙粗品14.85g中加10%盐酸60%乙醇水溶液150 mL，搅拌溶解，90℃加热恒温回流4 h，放置冷却，12000 rpm离心15 min，上清液120 mL、沉淀6.23 g；水洗沉淀至中性，收集沉淀，称重湿重为4.9 g；

（5）将上述离心上清液加入旋蒸瓶，加热回收酸醇，旋蒸所得物加水按1:1稀释，调pH至4.26，放置过夜，12000 rpm离心15 min，收集沉淀，称重湿重为5.02 g；

（6）合并上述两步湿重沉淀，烘干，称重2.98 g；将其用乙醇溶解，过滤，蒸发醇，即为染料木素2.38 g。

Images