CN1214737A - 生产n－乙酰－d－氨基葡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种直接从几丁质生产N－乙酰－D－氨基葡糖的新方法。更具体地说,本发明涉及利用酶中的几丁质酶家族的酶集团水解甲壳纲外壳的几丁质生产N－乙酰－D－氨基葡糖的方法。本发明包括利用几丁质分解酶集团,包括几丁质酶和壳二糖酶酶水解几丁质生产N－乙酰－D－氨基葡糖的方法。

Description

生产N-乙酰-D-氨基葡糖的方法
发明领域
本发明涉及直接从几丁质生产N-乙酰-D氨基葡糖的新方法。更具体地说，本发明涉及利用几丁质酶族的酶集团酶促水解在甲壳纲的外壳中发现的几丁质以生产N-乙酰-D-氨基葡糖的新的，经济的，高效的方法。
发明背景
在最近几年，已经发现N-乙酰-D-氨基葡糖在许多种类的疾病的治疗中是一种有价值的药理学试剂。N-乙酰-D-氨基葡糖没有任何已认定的不良副作用。而且，它对组织再生具有正面作用。N-乙酰-D-氨基葡糖在许多种类的疾病包括胃炎，食物变态反应，肠炎疾病(IBD)和憩室炎的治疗中具有治疗潜力。
目前，N-乙酰-D-氨基葡糖在市场上不可多得并且昂贵。迄今，商品量的N-乙酰-D-氨基葡糖是由某个美国公司利用基于酸水解粗几丁质的方法制备的。这导致了N-乙酰-D-氨基葡糖单位的脱乙酰化形成氨基葡糖。分离氨基葡糖并利用有机乙酰化试剂如乙酸酐再乙酰化。
几丁质是昆虫和甲壳类的外骨骼的主要成份，它是差不多完全由氨基糖，具体地说是N-乙酰-D-氨基葡糖组成的由β1,4键连接的无支链的多聚物，并且是制造这一化合物的天然底物。N-乙酰-D-氨基葡糖是天然物质，具有一些令人愉快的甜味，是无毒性的并容易溶解于水和体液中。
N-乙酰-D-氨基葡糖，具体地说2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，属于一大类的氨基糖，该类糖具有许多重要的功能并存在于人生物系统的许多区域。N-乙酰-D-氨基葡糖是一种关键的氨基糖，它在许多动物的身体中是从也称为血糖的葡萄糖产生。将含有N-乙酰氨基葡糖的复合(多聚体的)碳水化合物称为氨基多糖，它与蛋白质相连或附着于蛋白质形成一类通常称为蛋白多糖的化合物。N-乙酰-D-氨基葡糖是身体组织和血管的组成部分，并且是消化、呼吸和生殖泌尿系统的器官上的保护性覆盖物。在这个能力中，它参与了调节进出身体的物质和进入和在身体的细胞之间的物质的运动。参与氨基糖的合成和利用的生化过程存在于所有细胞中并且是相当容易理解的。
氨基糖组成了一半以上的间隙组织的氨基多糖，该组织填充了细胞间的空间并形成将细胞联结在一起的细胞“胶”。这一物质是胶原蛋白和氨基糖-多糖的凝胶状基质，它支持细胞处于原位置并调节那些在细胞之间通过的物质。
氨基糖也是基底膜的主要组成部分；基底膜是包围血管和各种组织的粗糙的薄的一层膜。这些组织控制着穿过支持组织结构的细胞膜的营养和废物并影响细胞的生长。
某些疾病过程似乎与身体中许多组织的天然组分-氨基糖的形成和利用中的不正常状态有关。因为氨基糖是许多组织的关键成份，能容易地说明为什么氨基糖的缺乏将导致细胞功能不正常。细胞膜、细胞间液体、细胞再生，以及整个组织代谢都可能受到影响。身体中这一基本结构单元的缺陷可能导致各类医学上的失调。
在1993年十一月16日批准的美国专利号5,262,310中，Isao Karube等人，公开和要求保护一个方法，该方法将含有几丁质的物质在有机溶剂，或含有水的溶剂中加热处理，然后加入β-1,4糖苷分解酶以通过酶反应分解含有几丁质的物质。可选择地，将含有几丁质的物质在有机溶剂或含有水的溶剂中超声处理，然后通过β-1,4糖苷分解酶的酶反应分解含有几丁质的物质。接着，将含有几丁质的物质与含有脲和/或表面活性剂的溶液接触，然后在存在和不存在脲和/或表面活性剂时让含有几丁质的物质与β-1,4糖苷分解酶共存以便分解含有几丁质的物质。在更进一步的一个可选方法中，在让含有几丁质的物质与含有脲和/或表面活性剂的溶液接触时，加热溶液并加入β-1,4糖苷分解酶以便分解含有几丁质的物质。具体地说，该方法包括分解几丁质的酶解方法，包括：将几丁质与有机溶剂混合，从而产生几丁质和溶剂的混合物，其中，混合步骤包括超声波处理几丁质和溶剂混合物；加热几丁质和溶剂混合物；和在混合物中加入β-1,4糖苷酶。
许多日本专利公开了各种利用几丁质酶处理几丁质或几丁质衍生物的方法。
1993年4月6日，日本专利号5,084,087公开了利用由乙烯在azuki豆类植物中诱导的酸性几丁质酶处理多糖释放N-乙酰-D-氨基葡糖的方法。
1993年1月19日，日本专利号5,007,496公开了利用几丁质酶水解已经部分脱乙酰基的几丁质制备低聚糖(氨基葡糖和N-乙酰氨基葡糖的高度聚合化的杂合低聚糖，以及氨基葡糖的单体低聚糖)的方法。制备通过透析在透析膜中进行。在膜外进行阳离子交换层析。几丁质从甲壳纲或tricomonus得到。
1991年4月19日，日本专利号3,094,697公开了包括利用酶完全把几丁质或脱乙酰几丁质分解成其结构单位，N-乙酰氨基葡糖和氨基葡糖，然后鉴定单体多糖的方法。几丁质和脱乙酰几丁质的脱乙酰化程度可以容易地高度精确地测量出来。酶优选地包括外切型的β-D-氨基葡糖酶，β-N-乙酰己糖胺酶，脱乙酰几丁质酶，几丁质酶，溶菌酶，等等。利用高速液相色谱、分光光度计，等等进行N-乙酰氨基葡糖和氨基葡糖的测量。
1990年2月1日，日本专利号2,031,685公开了特征是(a)利用内切形式的多聚糖分解酶处理淀粉和/或它的水解产物生产单体多糖和(b)富积高浓度的单体多糖的方法。可以把淀粉和/或它的水解产物、木聚糖和/或它的水解产物、甘露聚糖和/或它的水解产物、几丁质和/或它的水解产物和半乳聚糖和它的水解产物作为多聚糖和/或其水解产物，可以把α-淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、几丁质酶和半乳聚糖酶多聚多糖-分解酶。通过上面的联合方法形成的单体多糖是葡萄糖、木糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡糖和半乳糖。
1989年11月24日日本专利号1,291,793公开了通过在含有胶质或精细颗粒的液体培养基中培养木霉AF6-T8用于生产乙酰氨基葡糖生产内切型几丁质酶的方法。
1993年1月19日，日本专利号93,004,067公开了通过在存在甲壳纲外壳时培养黄杆菌MP-1C和/或假单胞菌MP-1D菌株生产脱乙酰几丁质、N-乙酰氨基葡糖等等的方法。外壳中的几丁质可以有目的地有效地分解并且可以制备脱乙酰几丁质，N-乙酰-氨基葡糖等等。也可以通过如超滤等等分级分离手段回收几丁质分解酶如几丁质酶，壳二糖酶，几丁质脱乙酰酶和脱乙酰几丁质酶。
1993年5月18日，日本专利号93,033,037公开了通过将几丁质水解成N-乙酰-壳(chito)低聚多糖，然后进一步利用酶水解制备N-乙酰-D-氨基葡糖的方法，该方法的特征是(a)利用酸部分水解几丁质和(b)利用以N-乙酰-壳低聚多糖为底物的酶处理所得到的含有N-乙酰-壳低聚多糖的混合物。溶菌酶是几丁质酶，壳二糖酶等等。它们把N-乙酰壳低聚多糖分解成N-乙酰-D-氨基葡糖。
1994年5月2日，日本专利号94,032,605公开了生产几丁质酶的链霉菌微生物，把该微生物用于生产几丁质降解产物。一个链霉菌的微生物生产几丁质酶。优选的菌株有链霉菌sp.KE-406(FERM P-8642)，链霉菌sp.KE-902(FERM P-8643)和链霉菌sp.KE-3332(FERM P-8644)。它们都是从土壤中分离的。通过培养链霉菌的菌株生产具有高活性的几丁质酶。通过利用几丁质酶可以有效地生产几丁质降解产物如，N-乙酰氨基葡糖和壳低聚多糖。
化学摘要115:230433公开了通过不同的方法将含有来自东方拟无枝酸菌IFO 12806的几丁质酶和β-N-乙酰-己糖胺酶的几丁质分解酶用各种方法固定于各类载体用于连续生产N-乙酰氨基葡糖。通过物理吸收到丹宁-脱乙酰几丁质制备的含有两种酶的已固定的酶对于N-乙酰氨基葡糖的生产是非常有用的。
发明概要
我们已经发现可以直接从几丁质生产N-乙酰-D-氨基葡糖的方法。利用我们的方法，不必经过中间产物氨基葡糖的步骤。所以，我们的方法不仅使N-乙酰-D-氨基葡糖的生产相当大地降低费用，而且由于并不需要有机溶剂(除了用乙醇的再结晶步骤)，所以该方法是环境可接受和友好的。
本发明在一个方面涉及生产N-乙酰-D-氨基葡糖(2-乙酰氨基-2-脱氧-D葡萄糖)的方法，该方法包括利用几丁质分解酶集团对几丁质进行酶促水解。几丁质分解酶集团可以至少含有从原核或真核微生物生产和分泌的一种几丁质酶和一种壳二糖酶。几丁质酶可以是内切的，或外切的β-1,4-多糖水解酶(EC3.2.1.14)，和壳二糖酶可以是β-n-乙酰-氨基葡糖酶(HC3.2.1.29)(也被称为乙酰氨基脱氧葡萄糖水解酶(BC3.2.1.29))，或β-N-乙酰-己糖胺酶(EC3.2.1.52)。
可以从甲壳类的外骨骼得到几丁质。甲壳类可以是磷虾，虾，蟹，和龙虾，或其它适当的甲壳类。可以通过利用选定的微生物来发酵从甲壳类的外骨骼等等得到的几丁质以便诱导生产至少一种几丁质酶和一种壳二糖酶，从而得到含有几丁质分解酶集团的几丁质酶和壳二糖酶。
原核微生物可以是从由粘质沙雷氏菌，变青链霉菌和液化沙雷氏菌组成的组中选出的细菌细胞系。真核微生物可以是从trichodema harzanum和疣孢漆斑菌组成的组中选出的真菌细胞系。
本发明另一方面涉及生产几丁质分解酶集团的方法，它包括：(a)在发酵罐或培养容器中加入含有几丁质的物质；(b)通过在发酵罐或培养容器中导入原核或真核微生物的接种物产生培养物以便诱导有机体扩展和生产具有几丁质酶和壳二糖酶活性的酶；(c)从培养物中回收几丁质降解酶和壳二糖降解酶的酶集团。
可以在细胞外的液体中得到几丁质酶降解酶和壳二糖酶降解酶。可以通过将培养物通过膜分离器或通过离心产生含有几丁质分解酶集团的过滤溶液回收该酶，该酶集团可能至少含有一种几丁质酶和一种壳二糖酶。来自膜分离器的滞留物可以再循环回到发酵罐或培养容器。
本发明还在另一方面涉及生产N-乙酰-氨基葡糖的方法，该方法包括：(a)在发酵罐或培养容器中加入含有几丁质的固体底物、确定的无碳水化合物培养基，以及当在几丁质上生长时生产降解几丁质和降解壳二糖的酶的有机体；(b)通过应用培养方案生产培养物，该方案诱导有机体产生和分泌至少含有一种几丁质降解酶(几丁质酶)和一种壳二糖降解酶(壳二糖酶)的几丁质分解酶集团；(c)从培养物的其它成份中分离几丁质分解酶集团；(d)机械地或物理-化学地处理含有几丁质的固体；(e)在几丁质水解反应器中导入步骤(c)的几丁质分解酶集团和步骤(d)的含有几丁质的固体，在反应器中，固体的几丁质成份水解为N-乙酰-D-氨基葡糖；(f)把几丁质分解酶集团和N-乙酰-D-氨基葡糖分离成含有N-乙酰-D-氨基葡糖的过滤流和含有几丁质分解酶的滞留流。
可以将含有几丁质酶和壳二糖酶的几丁质分解酶再循环到几丁质水解反应器。步骤(e)的几丁质水解反应器可以是连续的两级的反应器。两级反应器可以包括单个单位，其中反应器的工作体积的底下部分可以含有具有几丁质的固体的包装床，含有酶的移动相通过该包装床，并且其中上面部分是含有壳二糖分解酶的无固体水溶液。
两级的反应器也可以包括两个连续的反应器，其中第一个反应器可以含有具有几丁质的固体的包装床，含有酶的移动相通过该床，并且其中第二个反应器可以是含有一个或更多壳二糖降解酶催化的无固体水溶液的搅拌箱。
可以将该酶集团进料溶液导入包装床的底部。可以将该两级反应器的pH维持在5.5和7.5之间，并且将等温温度维持在约30℃到55℃之间。可以预处理含有几丁质的固体以便增加几丁质的表面有效性。预处理可以包括以球研磨或锤研磨或蒸汽爆炸或蒸汽爆炸处理含有几丁质的固体。
步骤(e)的几丁质水解反应器可以是半流体化的床式反应器。可以通过膜过滤方法分离加工步骤(c)的几丁质分解酶集团。通过超滤方法可以将几丁质分解酶和N-乙酰-D-氨基葡糖分离成过滤流。
本发明在另一个实施方案中涉及生产N-乙酰-氨基葡糖的方法，该方法包括：(a)在发酵罐或培养容器中加入含有几丁质的固体底物、确定的无碳水化合物的培养基，以及当在几丁质上生长时生产几丁质降解和壳二糖降解的酶的有机体；(b)应用培养方案生产培养物，该方案诱导有机体生产和分泌至少含有一种几丁质降解酶(几丁质酶)和一种壳二糖降解酶(壳二糖酶)的几丁质分解酶集团；(c)从培养物的其它成份分离几丁质分解酶集团；(d)在水解几丁质的反应器中导入几丁质分解酶集团和含有几丁质的固体，在其中将固体的几丁质成份水解成N-乙酰-D-氨基葡糖；(e)将几丁质分解酶集团和N-乙酰-D-氨基葡糖分离成含有N-乙酰-D-氨基葡糖的过滤流和含有几丁质分解酶集团的滞留流。
本发明又在另一方面中涉及生产N-乙酰-D-氨基葡糖的方法，该方法包括：(a)利用根据本发明的发酵方案生产几丁质分解的酶集团；(b)利用两级过滤或离心系统部分纯化几丁质分解酶集团，该系统允许将几丁质营养和细胞团再循环到发酵罐；(c)将部分纯化的几丁质分解酶集团传递和再循环通过该系统；(d)在几丁质水解生物反应器中导入酶和含有几丁质的固体，该生物反应器含有预处理的含有几丁质的固体底物并在其中加入含有部分纯化的几丁质分解酶集团的水溶液；和(e)通过交叉流动超滤系统从生物反应器输出/再循环流中的酶和高分子量的低聚多糖中分离N-乙酰-D-氨基葡糖产物。
可以将几丁质酶和壳二糖酶再循环到几丁质水解生物反应器。几丁质水解生物反应器可以以至少两个基本的方式中的一个进行操作：(a)单个柱，其中含有具有几丁质底物的包装床在下面部分，无几丁质(无固体)溶液在上面部分，其中酶进料溶液进入反应器的底部，产物流从顶部输出，或(b)按连续模式设计的装置，其中酶进料溶液首先通过含有几丁质底物的包装床，然后在生产N-乙酰-D-氨基葡糖产物的搅拌箱中加入从柱中退出的成份。在后一种方式中，可以将酶进料溶液导入包装床的底部或顶部。可以将反应器装置维持在25℃和55℃之间的温度和约5.5和8之间的pH下。
附图的简要说明
在附图中，说明了本发明的特定的实施方案，但不应该以任何方式将它们认为可以限制本发明的精神或范围：
图1a和1b图解说明实施本发明的方法的两个可选择的方式的流动层，该方法用于生产来自含有几丁质的固体的N-乙酰-D-氨基葡糖。
图2a图解说明了包装床几丁质水解生物反应器。
图2b图解说明了连续的搅拌箱反应器。
图2c图解说明了半液体化几丁质水解生物反应器。
图3图解说明了根据本发明的方法对于新的优化批量进料培养物方案的典型生长和几丁质酶活性生产的曲线。
图4图解说明了测得的N-乙酰-D-氨基葡糖的生产速率对由高效液相色谱测定的工作流离开两级反应器的本发明的步骤的工作时间的函数。
图5图解说明了作为操作时间的函数的在离开两级反应器的顶部的工作流中的几丁质酶和壳二糖酶的所测得的活性，该活性是相对于测量开始时导入反应器的10单位/毫升几丁质分解酶集团的移动相而言的。
图6比较了从最后的交叉流动过滤的过滤流中回收的N-乙酰-D-氨基葡糖产物与含有N-乙酰-D-氨基葡糖，壳二糖和壳三糖的标准溶液的层析谱。
图7a说明了30℃时在葡萄糖上生长的10升批量进料(最少的培养基)和7升批量发酵的粘质沙雷氏菌的生长曲线。
图7b说明了利用几丁质作为唯一碳源的批量发酵和利用葡萄糖作为起始碳源并利用几丁质在稳定生长早期，30℃时诱导的批量进料(10升)发酵的几丁质酶生产。
图8a说明几丁质源对粘质沙雷氏菌在30℃、批量培养的几丁质酶的生产的影响。
图8b说明在30℃时，在蟹和虾几丁质上生长的粘质沙雷氏菌的批量培养中细胞的生长。
图9a说明在1.5％几丁质批量培养、30℃时几丁质颗粒大小对几丁质酶生产的影响。
图9b说明在批量培养、1.5％几丁质、30℃、300微米颗粒大小(除了胶质几丁质)时蟹壳几丁质的预处理对几丁质酶的生产的影响。
图9c说明蒸汽爆炸预处理对几丁质酶生产的影响。
图10说明了在来自粘质沙雷氏菌培养物的粗提取物中几丁质酶(开放的条)和壳二糖酶(阴影的条)的相对活性，该活性是分别利用对硝基苯-β-D-N,N’-二乙酰基壳二糖和对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷确定的。活性以单位/毫升表示(即对硝基苯/分钟/毫升的微摩尔/升)。
图11说明了来自用粘质沙雷氏菌的几丁质酶处理的膨胀的胶质几丁质的水解产物的HLPC的层析谱。将1％的膨胀的几丁质与来自179小时的培养物的粘质沙雷氏菌的上清液的等分试样一起在37℃温育2小时。通过对纯标准物进行测定确定不同壳低聚物的滞留时间。峰1:NAG；峰2：壳二糖；峰3：壳三糖。通过测量在210纳米的吸收值测定峰值。
图12图解说明了pH和温度分别对几丁质酶活性的影响。1小时反应、0.125％膨胀、胶质几丁质作为底物、来自149小时粘质沙雷氏菌培养物的粗提取物。
图13图解说明了利用来自粘质沙雷氏菌培养物149小时的粗提取物时在不同温度下几丁质酶和壳二糖酶的稳定性。
图14说明了用在胶质几丁质中温育不同时间的几丁质酶催化的几丁质水解的阿累尼乌斯曲线。
图15a说明了在存在增加量的N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)时对几丁质酶(■)和壳二糖酶(◆)的测定。将活性值表示成起始未抑制值的百分数([NAG]=0)。
图15b说明了在有或没有加入固定量的N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)时利用对硝基苯N-乙酰-β-D氨基葡糖苷浓度的范围测定来自粘质沙雷氏菌粗提取物的几丁质酶。(■)0.00毫摩尔/升NAG；(●)0.21毫摩尔/升NAG；(Δ)0.42毫摩尔/升NAG；()0.83毫摩尔/升NAG；和(◆)1.67毫摩尔/升NAG。
图16图解说明了N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)的浓度对于几丁质的反应时间的曲线，该几丁质已经经过锤研磨、球研磨、蒸汽爆炸和球研磨、用酸蒸汽爆炸和球研磨和用二甲基乙酰亚胺处理。
本发明的详细说明
叙述了利用几丁质的酶促水解经济地生产N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)的新方法，水解几丁质的酶是从细菌细胞系生产和分泌的几丁质分解酶几丁质酶(几丁质多糖水解酶，EC3.2.1.14)和壳二糖酶(乙酰氨基脱氧葡糖水解酶，EC3.2.1.29)。
这一新发明包括了N-乙酰-D-氨基葡糖生产技术，该技术利用了自然界中丰富和低廉的几丁质。几丁质基本上是由N-乙酰-D-氨基葡糖组成的由β-1,4-键连接的无支链的聚合物。它是自然界中存在的第二类最丰富的聚合物(继纤维素之后)。象纤维素一样，几丁质是结构聚多糖，其天然来源包括节肢动物的外骨骼和许多真菌的细胞壁。几丁质主要的商业来源是蟹和虾壳；一些对全球贝壳类废物中几丁质总含量的估计的范围是在每年1.2×105公吨。在英属哥伦比亚省，每年虾壳废物估计有10,000公吨。在蒸汽灭菌之后目前大多数这一几丁质类废物被埋藏在土壤中。(相反，估计日本每年生产和加工约103公斤几丁质用于工业用途)。
本发明的新方法提供了目前对环境不利的几丁质类的废物处理方法之外的可选择的另一种经济可行的方法：将虾壳和蟹壳废物(对此实际存在着地区灭菌和土壤埋藏的耗价问题)生物转换成N-乙酰-D-氨基葡糖，一种具有巨大潜在的世界市场的价值相当高的治疗物。
由于它固有的温和操作条件，几丁质的酶水解是从几丁质类废物生产N-乙酰-D-氨基葡糖的一种引人注意的方法。微生物利用溶解酶的聚生体将几丁质转换成N-乙酰-D-氨基葡糖。通过外切的和内切的几丁质酶对几丁质的作用可以得到二聚体壳二糖；然后壳二糖酶酶解壳二糖得到两个分子的N-乙酰-D-氨基葡糖。这些酶的特异性保证了N-乙酰-D-氨基葡糖是最终的水解产物。这一生物过程的一个引人注意的特征是通过销售纯化的几丁质酶和壳二糖酶获得附加利益的潜力，这两种酶是在存在几丁质时由(选定的)微生物生产和分泌的。几丁质酶的天然来源包括蜗牛，甲壳纲，昆虫，脊椎动物，和豆虫。但是，从加工的观点来看，最方便的几丁质酶来源是微生物。
方法
从历史上看，几丁质酶的研究的进展已经最初与纤维素研究的进展紧密相关。正如几丁质酶，纤维素酶经常协同性地作用并强烈地吸收于它们的作为纤维素水解为可溶性糖的前体的不溶性底物上[Muzzarelli,R.A.A.(1985)，第6章，在Aspinall,G.O.(ed.)聚多糖(ThePolysaccharides),学术出版社(Academic Press)，纽约)]。结果是，在本发明生产N-乙酰-D-氨基葡糖的方法中使用的许多工具和概念来自于更早期的利用纤维素水解酶集团生产可溶性糖的技术。其余概念来自于Cosio等人[Cosio.I.G.,Fisher,R.A.，和Carroad,P.A.(1982)，食品科学杂志(J.Food.Sci),47 901-905]建议的方法，该方法用于从贝壳类的废物的生物转换生产单细胞蛋白质和乙醇。
在图1a和1b的图解流程图中说明了用于从几丁质生产N-乙酰-D-氨基葡糖的本发明的方法的两种可选择形式。在含有选定的在指数生长期的生产几丁质酶的有机体的接种物的发酵罐中加入作为碳源(和诱导剂)的贝壳类外骨骼或几丁质的等分试样。在细胞悬浮液中加入几丁质诱导两个或更多几丁质酶和壳二糖酶的酶集团的生产，该酶集团通过生长的细胞分泌到细胞外的液体中。通过将肉汤通过膜分离器或连续地离心产生在过滤物中含有几丁质分解酶集团的溶液以便从含有细胞，含有几丁质的颗粒，几丁质分解酶集团(壳二糖酶和至少两种几丁质酶)，小浓度的N-乙酰-D-氨基葡糖，和N-乙酰-D-氨基葡糖的低聚物的发酵肉汤中回收几丁质分解酶。含有能活细胞和几丁质的滞留物可以再循环到发酵罐用于进一步的细胞生长和几丁质分解酶的生产。滞留物也含有残留量的酶，这是因为在水解反应中几丁质酶吸收到几丁质上是最初的步骤。
然后通过下面的方法之一可以将含有几丁质酶的过滤溶液浓缩和进一步纯化：(a)膜超滤，其中膜的额定孔的直径足够小以致能保留几丁质分解酶集团中的各种酶，或(b)将含有粗几丁质分解酶的过滤溶液在足够低以致游离酶结合到几丁质上但不水解到任何明显的程度的温度下安装的固体-液体分离器中与液状几丁质的分散体或生料混合。由Cabib[Robert,R.L.,和Cabib,E.(1982)，生化年刊(Anal.Biochem.)127,402-412]和通过来自申请人的实验室的其它结果已经提供了几丁质酶结合到几丁质但在低温下不明显水解它的证据。在方法(b)中，把从残留营养溶液、分离的固体几丁质/酶复合物固体、洗涤、然后加入到几丁质-水解生物反应器中，其中通过各种几丁质酶酶解几丁质，然后通过壳二糖酶生产N-乙酰-D-氨基葡糖。
对于图1a说明的本发明的模型，其中将几丁质分解酶集团浓缩和通过膜超滤进一步纯化，然后可以将含有几丁质分解酶集团的浓缩溶液导入图2a或2b显示的几丁质水解生物反应器构型中的任何一个。在任何一个构型中，酶溶液首先通过几丁质的包装床，各类酶通过在不溶的几丁质和在酶的N-末端或C末端发现的几丁质结合域之间的结合反应吸收于包装床上。壳二糖酶不是几丁质酶而且已知不含与几丁质结合的结构域，不结合固体(含有几丁质)相，与溶剂一起通过包装床。所以，当几丁质分解酶集团进料溶液通过柱时包装床反应器逐渐地积累几丁质酶。结合在包装床的内部的游离的几丁质酶把不溶颗粒的几丁质成份催化成可溶的N-乙酰-D-氨基葡糖的低分子量的低聚糖，该糖然后通过移动相从该床中输出。
在从反应器的包装床(部分)输出的移动相液体积累壳二糖酶，该酶不与包装床的固体相结合，并含有N-乙酰-D-氨基葡糖和可溶的N-乙酰-D-氨基葡糖的低分子量的低聚物的混合物。生物反应器中积累的壳二糖酶的均匀水相成份提供了必要的存留时间以使过量的壳二糖酶能催化可溶的低聚糖完全被水解成N-乙酰-D-氨基葡糖，该生物反应器可以是包装床反应器的游离体积的延续部分或分离的连续的搅拌箱反应器。这一新的反应器构型提供了许多明显的优点。末端产物N-乙酰-D-氨基葡糖非竞争性地抑制几丁质酶的活性。在反应器的包装床部分中的相对低浓度的壳二糖酶保证了在包装床中N-乙酰-D-氨基葡糖是低的，可溶低聚多糖的生产速率是高的。然后在反应器的第二个均匀水相部分中的相对高浓度的壳二糖酶保证所有退出包装床的可溶性低聚多糖转换成N-乙酰-D-氨基葡糖。结果是，在本发明的方法中的N-乙酰-D-氨基葡糖的生产速率和产量明显比任何其它已测试的方法高。
通过设计交叉流动的膜超滤方法以致N-乙酰-D-氨基葡糖与过滤物一起退出并保留所有的酶达到从几丁质分解酶(壳二糖酶和所有几丁质酶)最后分离N-乙酰-D-氨基葡糖产品。为了进一步简化N-乙酰-D-氨基葡糖的生产，将酶集团的一部分再循环到几丁质水解反应器的入口；通过沉淀剂分离余下部分，以便得到几丁质酶集团的商业级的制剂，该沉淀剂可以是硫酸铵。
图1a中下面划线的方法包括了五个基本操作单位：(1)细胞生长和几丁质分解酶集团的生产需要的发酵系统；(2)含有几丁质分解酶的上清液回收系统，该系统可以包括过滤，离心和/或吸收；(3)预处理含有几丁质的底物以便提高几丁质的暴露和水解速率的物理和热化学方法；(4)两级几丁质水解反应器；和(5)提高N-乙酰-D-氨基葡糖和几丁质酶集团的商业级制剂的最终纯化系统。下面提供了说明这些操作单位的独特特征的实施例，这些特征将本申请人的N-乙酰-D-氨基葡糖生产技术与任何相关技术区别开来。
(1)利用几丁质或甲壳类外骨骼作为唯一碳源生产几丁质酶的细菌的所说的确定的批量进料的发酵：
许多细菌包括粘质沙雷氏菌和变青链霉菌，以及真菌包括trichodermaharzanum和疣孢漆斑菌，能产生含量可观的几丁质酶和壳二糖酶。所有这些有机体都把几丁质酶和壳二糖酶分泌到细胞外的液体中，从而提供了一条连续回收裂解酶集团的路径。但是，酶的产量及其降解几丁质效率在产几丁质酶的细菌中各不相同。
实施例1
当在含有作为唯一碳源的球研磨的蟹壳的最小的培养基上生长时利用工厂化振摇烧瓶实验筛选总共22个微生物的几丁质分解活性。在我们的筛选研究中的微生物的选择是根据Reynods,Berger和Reynolds，和Monreal和Reese的更早期的研究[Reynolds,D.M.(1954)，遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiology),11,150；Berger,L.R.,Reynolds,D.M.(1958)，生化生理杂志(Biochim.Bopphs.Acta),29,522；Monreal,J.，和Reese,E.T.(1969)，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.),15,689-696]，该研究鉴定了这些例外地活化几丁质底物的微生物。振摇烧瓶研究表明粘质沙雷氏菌是降解粗球研磨几丁质最活跃的微生物之一。在几丁质上培养的粘质沙雷氏菌QM B1466的生长速率至少比第二高几丁质分解活性的微生物-液化沙雷氏菌高30％。
实施例2
从一系列144从工厂化振摇烧瓶培养已经确定了粘质沙雷氏菌生长必须的培养基成份。然后利用3f工厂化设计的振摇烧瓶培养已经确定了接种物和基本发酵培养基的最佳组成，以及进料溶液、批量进料发酵的组成，在振摇烧瓶培养中将球研磨的蟹壳几丁质作为唯一碳源。
然后将这些最佳的培养基用于开发粘质沙雷氏菌培养的批量进料发酵和诱导方案。图3展示了最佳批量进料培养的典型生长和几丁质酶活性生产曲线。根据从胶质几丁质底物每小时生产1毫克N-乙酰-D-氨基葡糖的为1个单位活性，在最后培养物中的几丁质酶活性超过105单位/毫升，这表明几丁质酶活性在几丁质分解酶集团的容积生产中比任何以前的发酵方案增加了五倍以上。在我们的批量进料发酵系统中，将溶解氧的增加用于控制在反应器中加入含有几丁质进料溶液，溶解氧指示了反应器中可得碳源的消耗。也可以控制反应器的pH和温度以得到最大程度的细胞生长和几丁质分解酶产量。
以额定直径在50到300微米之间的预处理颗粒的无菌悬浮液的形式在发酵罐中定期加入几丁质和甲壳纲的外骨骼。发酵罐中几丁质的浓度已经被优化以使在持续6天的发酵过程中几丁质仍然是限制生长的营养。
(2)含有几丁质分解酶的上清液的回收和浓缩：
两种几丁质酶，几丁质酶A和几丁质酶B，和壳二糖酶是当细菌粘质沙雷氏菌在几丁质或含有几丁质的甲壳纲外骨骼上生长时产生的主要的细胞外酶。同时，当4到6天培养诱导期完成时这些酶在上清液中代表了总蛋白质含量的超过70％。对N-乙酰-D-氨基葡糖的生产，在除去不溶细胞物质时不必对几丁质分解酶集团进一步纯化，那种在有些情况下对几丁质分解酶集团的进一步纯化以对上清液进行浓缩的步骤也是不必要的。
我们已经开发了许多系统用于从我们的粘质沙雷氏菌培养物分离和浓缩含有几丁质分解酶的上清液。几丁质酶与几丁质的结合在4℃时在15分钟内达到饱和并产生每毫升含有大约7毫克几丁质/酶复合物干重的均匀的胶质几丁质/酶悬浮体。在4℃，壳二糖酶也结合于几丁质，但亲和力低得多。所以，如果必要，与不溶的几丁质的亲和力可以用于从酶集团的上清液部分分离和浓缩几丁质酶A和B。
更普遍的情况是，其中不需要几丁质酶集团的分离，我们已经使用了两种方法，即两步骤交叉流动过滤和连续的离心，用于分离和浓缩酶溶液，对于含有固体的连续系统两者都是适用的。与离心比较，交叉流动过滤更引人注意，因为它的耗价低。我们已经优化了两级交叉流动过滤系统，其中(基本的)第一级含有设计好的0.2微米的能从上清液流中除去细胞和任何残留的几丁质的过滤器，(可选择的)第二级含有设计好的能在加到几丁质水解反应器中之前浓缩几丁质分解酶集团和除去低分子量污染的超滤膜。
(3)提高酶和N-乙酰-D氨基葡糖生产的外骨骼预处理系统：
我们已经得到的结果表明含有几丁质的甲壳纲贝壳的颗粒的特征影响发酵罐中生产几丁质分解酶的速率和几丁质水解反应器中生产N-乙酰-D-氨基葡糖的速率。特别重要的是每个可得几丁质颗粒结合几丁质酶A和B的总表面积。也已经研究了几丁质来源(如蟹，虾等等)的效果并发现影响几丁质酶以及N-乙酰-D-氨基葡糖的生产，主要是因为几丁质含量的天然变化。对几丁质来源的比较表明在高锰酸钾洗涤和清洁的蟹壳上生长的粘质沙雷氏菌培养物中几丁质分解酶生产是最高的。在清洁的点-尾虾的贝壳上生长的培养物中也生产几丁质酶，但在含有蚝贝壳，蘑菇几丁质，和甲壳虫几丁质的培养物中基本上是检测不到的。
我们已经探索了许多预处理方法包括机械方法，如球研磨和锤研磨以便增加外部的表面面积，和物理-化学-方法，如高压灭菌和蒸汽爆炸(Parr轰炸TM)以便膨胀蟹壳颗粒并从而增加颗粒内的表面面积。从通过分解链内氢键结构膨胀蟹壳颗粒的想法考虑，也探索了用二甲基-乙酰胺和弱酸协同溶剂处理。
图16图解说明了相对几丁质的反应时间的N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)的浓度对几丁质反应时间的曲线，几丁质已经经过锤研磨、球研磨、蒸汽爆炸和球研磨、用酸蒸汽爆炸和球研磨和用二甲基乙酰亚胺处理。
实施例3
如图16所示，最有前途的预处理方法是蒸汽爆炸额定直径范围为50到500微米的已经球研磨的含有几丁质的颗粒。蒸汽爆炸枪可以在20到2000磅/平方英寸(psig)的压力范围内、周围的温度范围达到400℃、容积的流速达到20升/秒的条件下操作。我们对含有20％(w/v)球研磨的虾壳几丁质的研究表明，当将1毫克已处理(相对未处理的)的虾壳几丁质与1单位的几丁质酶活性在30℃,pH6.5接触1小时时能导致N-乙酰-D-氨基葡糖生产速率的成级增加，该虾壳几丁质是经过入口500psig的压力和160℃的温度蒸汽枪后膨胀的。
实施例4
在Parr炸弹TM方法中已经得到同样的结果，在该方法中将含有几丁质的充分搅拌的颗粒与高压蒸汽温育1到2小时，然后经减压口喷出以便扩展灌注溶剂的颗粒。蒸汽枪和Parr炸弹TM技术最初都是设计用于处理纤维素材料包括木材，而且就我们的了解，该项技术过去从未用于处理几丁质和含有几丁质的天然底物。
我们也已经研究了许多可与蒸汽枪或Parr炸弹TM相容的化学预处理方法包括二甲基乙酰亚胺和0.1％的硫酸。在几丁质酶生产的研究中，用二甲基乙酰亚胺和弱酸协同溶剂处理球研磨的蟹壳几丁质导致几丁质活性的小的(2％-5％)的增加，这两种化学物质被认为是通过分解链内氢键结构膨胀几丁质的。
(4)通过酶水解含有几丁质的固体用于生产N-乙酰-D-氨基葡糖的两级生物反应器：
所述的发明的反应器是根据一系列在实验室中收集的基本数据设计的，这些数据确定了：(1)几丁质分解酶集团显示最大活性的溶液条件，(2)几丁质来源和预处理对N-乙酰-D-氨基葡糖生产速率的影响，(3)作为溶液pH和温度的函数的酶集团的稳定性，和(4)一个或多个水解产物引起的酶抑制的存在、程度和机制。我们已经逐个论述了这些问题，并将结果用作新的有效的几丁质水解生物反应器的设计基础。
实施例5
已发现从粘质沙雷氏菌培养物回收的几丁质分解酶集团的最大水解活性是在45℃到49℃、pH6和7之间。
正如实施例3和4详细说明的，在各种几丁质来源和探索的预处理方法之间，将研磨的虾壳和蟹壳颗粒蒸汽爆炸到额定直径50微米和500微米之间产生最大的N-乙酰-D氨基葡糖的生产速率。但是，可以将该方法以任何形式在任何预处理程度用于所有含有几丁质的底物。
在40℃和pH6.5时，从粘质沙雷氏菌培养物回收的几丁质分解酶集团的几丁质酶和壳二糖酶的活性的半袁期分别为3.8天和2.7天；当温度上升到45℃时，半衰期分别下降到2.6天和1.7天。
所需的水解产物N-乙酰-D-氨基葡糖非竞争性地抑制总的几丁质酶和壳二糖酶的活性，最高到其最大活性的30％。
这些结果说明在反应器维持在接近pH6.5和40℃时几丁质水解速率最高，该条件控制反应器中N-乙酰-D-氨基葡糖的浓度能使得该浓度在反应器的出口是最大化的，但在反应器的残留物(至少许多残留物)中仍保持在亚抑制水平。有两种反应器构型符合这些原则：(1)包装床反应器，其中移动相携带几丁质分解酶集团和水解产物通过含有几丁质固体颗粒的包装床，和(2)液体化床式反应器，其中向上流动的移动相在流动区域部分或全部地悬浮含有几丁质的颗粒。
如图2a和2b所示的两种构型的包装床反应器，它提供的优点是反应器中的几丁质的浓度是最大的，并且可以调整通过床的流动路径和流动速率以便使几丁质水解速率最大。
图2c描述的液化床式反应器通过降低过床减压而增加了每个颗粒的有效几丁质表面面积，同时降低了对泵送的要求，其代价是反应器中的终产品抑制效应上升。
实施例6
本发明的两级几丁质水解生物反应器保持了高速度水解几丁质并使得N-乙酰-D-氨基葡糖作为仅有的大量反应器终产物。图2a和2b显示了发明的生物反应器的两种可能的构型。对图2a显示的构型的重点说明性讨论后，我们已经设计了N-乙酰-D-氨基葡糖的新的反应器，其中反应器底下约三分之二的工作体积是含有几丁质的颗粒的包装床。含有几丁质酶集团的移动相向上通过床。当酶集团与几丁质接触后，几丁质酶吸收并催化水解反应；释放N-乙酰-D-氨基葡糖和可溶的低聚多糖并积累，同时以逐渐增加的距离通过包装床。然后，N-乙酰-D-氨基葡糖和可溶的低聚多糖的浓缩的混合物进入反应器上面约三分之一的部分，反应器的这一部分不含有不可溶的几丁质并且相对地富含壳二糖酶，这是因为它是几丁质分解酶集团中唯一的不吸收于几丁质的成员。确定了反应器的体积和其中这一不含不溶几丁质部分中的液体停留时间以便使退出反应器的包装床部分的所有可溶的低聚多糖完全水解成N-乙酰-D-氨基葡糖，使N-乙酰-D-氨基葡糖成为两级反应器的唯一糖产物。
酶进料溶液进入包装床的底部，在这一部分中，底物浓度最高，N-乙酰-D-氨基葡糖浓度最小。所以，正如任何包装床反应器，在接近柱入口处N-乙酰-D-氨基葡糖的生产速率最大，并且随着向上通过柱的距离的增加而稳定地下降，向上通过柱的距离的增加相应于N-乙酰-D-氨基葡糖在柱中浓度的增加。将反应器维持在pH6.5并且等温反应器的温度在35℃到50℃之间。对于球研磨的几丁质，酶进料溶液的作用似乎只是产生N-乙酰-D-氨基葡糖并在产物流中没有产生明显量的更高级的壳低聚物。
在通过穿过10千道尔顿分子量的截断膜的交叉流动过滤除去N-乙酰-D-氨基葡糖产物后，将酶催化流连续地再循环到反应器入口。在进料流中加入额外的酶以便补偿随着时间的酶失活。连续地或半连续地在床的顶部加入预处理的甲壳纲贝壳颗粒以便在反应器中维持最适的几丁质浓度。
(5)N-乙酰-D-氨基葡糖和几丁质分解酶集团的最后纯化：
将连续的交叉流动的超滤系统用于从几丁质分解酶集团分离N-乙酰-D-氨基葡糖产物。通过过滤器保留酶集团并可以再循环到反应器或回收。在过滤流中的N-乙酰-D-氨基葡糖产物具有高于98％(w/v)的纯度。没有检测到蛋白质污染。主要的低聚多糖污染是壳二糖。各种沉淀剂包括硫酸铵可以用于从过滤溶液中回收半结晶的N-乙酰-D-氨基葡糖粉末。
验证N-乙酰-D-氨基葡糖的产生
在具有图2a显示的两级反应器类型及图1a显示的构型中目前本发明的方法能以平均速率78(±7)克/升/小时生产N-乙酰-D-氨基葡糖。在pH7和8之间和30℃时进行发酵产生101(±6)单位/毫升的几丁质酶活性。然后通过连续的两级膜过滤纯化几丁质分解酶集团，并将其稀释10倍到10单位/毫升的几丁质酶活性的生物反应器的进料浓度。两级反应器已经可以连续地操作超过10天的时期，在28小时后达到稳定状态生产水平，并从那时起到过程终止生产纯度大于98％的N-乙酰-D-氨基葡糖产物。
图4显示了当对离开两级反应器的顶部的前进流进行高效液相色谱试验测出的作为本发明方法的操作时间的函数的测定的N-乙酰-D-氨基葡糖的生产速率。图5显示了所测得的作为操作时间的函数的离开两级反应器顶部的前进流中的几丁质酶和壳二糖酶的活性，该活性与所测得的开始时加入反应器的10单位/毫升的几丁质分解酶集团的移动相活性有关。开始时在反应器的出口流中缺少壳二糖酶活性与反应器的体积空余是一致的。在反应器出口流中几丁质酶活性的缺乏证实了几丁质酶在包装床中吸收于球研磨的虾壳颗粒的几丁质上。在连续操作28小时后，虾壳开始被吸收的几丁质酶饱和，并在反应器出口流中记录到稳定状态水平的几丁质酶活性的。图6将从最后交叉流动过滤的过滤流回收的N-乙酰-D-氨基葡糖产物的层析谱与含有N-乙酰-D-氨基葡糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖的标准溶液进行了比较。N-乙酰-D-氨基葡糖是来自本发明的过程的唯一的可检测的产物。
实施例7
实验室材料和方法
从Sigma化学公司(圣路易斯，密苏里州)得到实用级(Practical-grade)的虾壳几丁质。从当地的贝壳类加工厂得到虾和蚝壳。所有盐和溶剂购自BDH化学公司。
粘质沙雷氏菌QMB1466培养物
将粘质沙雷氏菌QM B1466的划线培养维持在营养培养基(0.8％营养肉汤，1.5％琼脂)(Difco实验室，底特律，迈阿密)，4℃，每2星期转移一次。从甘油储备物(储存于-70℃)通过划线制备原始的平板并在30℃温育24小时。
25毫升的粘质沙雷氏菌的接种培养物含有1wt％(重量％)酵母提取物(Difco),2wt％蛋白胨(Difco)，和2wt％葡萄糖(BDH公司，加拿大，多伦多)的浓度的YEPD培养基。在30℃和pH7.0过夜使第一次接种培养物生长并用于相同培养物的第二次接种。这一培养物在同样的条件下生长3小时，在该时间内培养物处于完全的指数生长状态。
在含有15克/升的实用级的蟹壳几丁质、0.5克/升酵母提取物(Difco)、1.0克/升(NH4)2SO4、0.3克/升MgSO4、和1.36克/升KH2PO4的125毫升的振摇烧瓶中进行批量振摇烧瓶培养实验(Monreal和Reese,1969)。用1.0M的NaOH在蒸汽灭菌之前将培养基的pH调节到8.5。利用第二次(3小时)接种培养物接种(1％)所有振摇烧瓶培养。
底物制备
以下面途径中的一种或几种加工洗涤过的蟹，虾和蚝壳(含有几丁质)：(1)球研磨，(2)对在蒸馏水、1％(v/v)硫酸、或一种已报道的几丁质溶剂(DMA)(Austin,1988)，即1％的N,N二甲基-乙酰胺中的2％的几丁质悬浮液进行高压灭菌，和(3)对在蒸馏水或1％(v/v)DMA中的2％的几丁质悬浮液进行蒸汽爆炸。
在含有每50克蟹壳三十个2厘米直径的布隆迪球的Morton三层罐状研磨机中将甲壳纲外骨骼球研磨3小时。在振摇器装置上筛动大小范围为约40微米＜额定直径＜400微米的球研磨蟹壳颗粒，得到五个大小的部分，每一部分包括了约80微米额定颗粒直径范围。球研磨虾和蚝壳得到额定直径小于50微米的细微粉末，没有进行进一步大小的分级分离。
在蒸汽温度121℃时在Market Forge Sterilmate中对筛出的蟹壳几丁质溶液进行20分钟高压灭菌。在316不锈钢ParrTM4522型2升反应器(Parr仪器公司，Moline IL)中对筛出的蟹壳几丁质进行蒸汽爆炸。将几丁质生料加热到需要的温度(190或225℃)和由此的蒸汽压，保持10分钟，然后通过球形释放阀门快速扩展到大气压下。将高压灭菌和蒸汽爆炸的几丁质样品离心并在用于批量培养实验之前用过量体积的蒸馏水洗涤两次。
根据Berger和Reynolds,1958年的方法制备膨胀的几丁质。第一次在室温下将球研磨的蟹和虾壳浸泡在2wt％高锰酸钾溶液中15到20小时以除去色素。然后用1wt％的草酸溶液洗涤留下的粉末以便减弱残留的高锰酸钾和二氧化锰。
通过利用丙酮洗涤膨胀的几丁质制备膨胀的胶质几丁质(主要用作酶测试的参考)以便形成几丁质糊，然后慢慢将糊加入在冰浴冷却到4℃的7到9倍体积的浓缩的HCl中止水解。通过在含有多孔玻璃板和疏松填充的玻璃纤维的玻璃柱过滤从糖浆状液体中除去颗粒。将脱钙的几丁质过滤物放入强烈搅拌的液体50％乙醇溶液中以便以高度分散的状态沉淀几丁质。在5000×g离心胶质残留物20分钟并再悬浮于水中3到5次，然后以重力沉淀并用含有1毫摩尔/升CaCl2(pH6.0)的100毫摩尔/升磷酸钾缓冲液洗涤几次以便除去过量的酸和醇。最后，在100毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中透析膨胀的几丁质溶液直到保持pH5到6。
发酵
在10升Chemap发酵罐中，温度控制在30℃下进行批量发酵。利用7升的工作体积和用于振摇烧瓶实验相同的培养基(15克/升实用级蟹壳几丁质(Sigma),0.5克/升酵母提取物(Difco),1.0克/升(NH4)2SO4,0.3克/升MgSO4，和1.36克/升KH2PO4(都为BDH))，在pH8.5下进行发酵。利用如用于批量培养所述的3小时YEPD接种培养接种发酵罐(5％)。
也利用10升工作体积进行批量进料发酵。温度和pH分别控制在30℃和7.0。将蔗糖用作碳源直到获得高细胞密度，此时，将碳源转换成球研磨的实用级蟹壳几丁质。将极限培养基用于接种物和批量进料发酵培养基；根据Veron,1975的研究，在表1给出了该组成。在发酵的葡萄糖进料部分的过程中，利用Beckman葡萄糖分析仪2以规则的时间间隔检测葡萄糖水平。
几丁质活性测定
通过稍作修改的Reissig等人1995的分光光度计方法，以使得可利用ELISA96孔平板读数器分析多重样品分析来测量总的几丁质酶的活性。反应混合物含有0.8毫升0.125％(w/v)膨胀胶质几丁质的悬浮液和0.1毫升pH6.0的100毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液(含有1.0毫摩尔/升CaCl2)。将反应混合物与用同样的磷酸缓冲液稀释5到200倍的0.1毫升的酶溶液(培养上清液)混合并在37℃温育1小时，此时通过煮沸5分钟终止反应。然后将一个几丁质空白和各个样品在5000×g下离心5分钟，各个收集0.275毫升上清液，并测试NAG浓度。
通过将0.55毫升0.8摩尔/升的四硼酸钾(pH9.1)与0.275毫升上清液样品混合并在强烈煮沸的水浴中加热所得溶液3分钟来确定N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)浓度。然后立即在冰浴中冷却混合物。以三份将100毫升混合物储存于ELISA平板的孔中；也将NAG标准和空白溶液以三份加入平板。然后在每个孔中加入100毫升溶解于分析级的冰醋酸(含有12.5％w/v)10当量的HCl)中的0.112摩尔/升的对二甲基氨基-苯甲醛(Ehrlich的试剂)并将平板保持在37℃恰好20分钟。将平板在4℃冷却3分钟并随后以545纳米波长在ELISA平板读数器中测量每个孔的吸收值。将1个单位的活性定义为每小时释放1毫克N-乙酰-氨基葡糖的酶的量。
利用类似物对硝基苯-β-D-N,N’-二乙酰壳二糖(pNP-(NAG)2)(Sigma)也可以确定几丁质酶的活性。在ELISA平板中用含有50微升含有1毫摩尔/升CaCl2,pH6.0的100毫摩尔/升的KH2PO4缓冲液，50微升溶解于毫微纯度(nanopure)的水中的pNP(NAG)2(400微克/毫升)和20微升稀释于同样的缓冲液的酶的三份样品中进行测试。在温育10分钟后，利用ELISA平板读数器样品将样品在405纳米波长下读数。将空白用于去扣任何由酶或PNP-(NAG)2单独引起的吸收值。利用标准曲线计算样品释放的对硝基苯的微摩尔数。以测定条件下每分钟释放的对硝基苯的微摩尔数确定酶活性的单位。
存二糖酶活性的测定
当将酶溶液(培养上清液)的等分试样与对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡糖(pNP-NAG)(Sigma)的水溶液温育时通过测量释放的对硝基苯的量确定壳二糖酶的活性。用于这一测试的缓冲液是85毫摩尔/升Tris(羟甲基氨基甲烷)-苹果酸盐，pH7.0。将50微摩尔/升2.5毫摩尔/升pNP-NAG溶液与50微升缓冲液以及在缓冲液中适当稀释的20微升的酶溶液混合。在37℃、10分钟温育时期之后，通过加入100微升0.375摩尔/升的Na2CO3终止反应。在ELISA平板读数器中在405纳米波长处用分光光度计测量释放的对硝基苯。一个单位的壳二糖酶活性等于每分钟释放1微摩尔对硝基苯所必需的酶量。
几丁质水解产物的分析
利用Radial-PakμBondapak-NH2柱(8×100毫米，水)的HPLC分析几丁质酶对膨胀的胶质几丁质的作用。通过迁移标准(YSK Ind.有限公司，东京，日本)鉴定N-乙酰-D-氨基葡糖和壳低聚物的滞留时间。在210纳米处检测峰值。
结果和讨论
培养条件的优化
经济地生产N-乙酰-D-氨基葡糖需要优化培养基组成(和培养条件)以便在最少的培养基和操作耗价下使几丁质分解酶的生产达到最大。批量培养粘质沙雷氏菌的最佳培养基的基础是Monreal和Reese,1969改良的配方(参见表1)，该配方利用了来自为保持几丁质作为整个培养过程的限制生长的营养的设计的工厂化振摇烧瓶实验的结果。当使球研磨蟹壳几丁质含量保持恒定的15克/升时酵母提取物、(NH4)2SO4、MgSO4、和KH2PO4的浓度都允许变化。表1显示了所得到的对于最小培养基耗价而优化的培养基。在下面的表1中报道的最佳培养基中上面那些浓度中，在160小时培养后，培养基组成对几丁质酶生产和细胞密度几乎没有影响。
发酵
图7a显示作为对于通常生长8天的典型的7升批量发酵的时间函数的干细胞重(DCW)。该图也显示了在表1显示的限定的极限培养基(其中葡萄糖是唯一的碳源)上生长20小时的粘质沙雷氏菌QM B1466的10升批量进料发酵的数据，在这之后，加入球研磨的蟹壳几丁质到终浓度1.5％(w/v)以便测试高细胞密度时几丁质酶的诱导。为了使葡萄糖抑制最小，但不必消除这种抑制，在加入几丁质底物之前耗尽发酵罐中所有的葡萄糖。在几丁质加入批量进料培养之前最终的约22的OD660纳米值表示与常规的粘质沙雷氏菌在葡萄糖或几丁质上生长(最大OD660纳米为3)相比细胞密度有显著的增加。所以，我们可以实现每细胞同等几丁质酶的生产提供的几丁质酶活性的容积产量的显著增加。
图7b显示作为上面每个发酵过程的培养时间的函数的几丁质酶活性。在批量发酵中直到第二天的傍晚才观察到几丁质酶活性，在这之后，在达到将近140小时的培养之后，几丁质酶稳定上升至20到45单位/毫升的最大活性。培养时间、以及中间产物和最终的几丁质酶活性与优化的振摇烧瓶培养中观察到的非常相似，表明了由于几丁质底物的不溶的特性导致的传质限制没有因放大实验而扩大。
在高细胞密度批量进料培养中从来没有观察到几丁质酶活性，其中在指数生长期的后期，利用1.5％(w/v)的几丁质诱导细胞。在这一系统中缺乏几丁质酶的生产的一个可能的解释是在这一生长后期的细胞被胁迫到它们不能自接受几丁质为碳源的地步。让批量培养物在葡萄糖上生长到指数生长早期，通过消耗葡萄糖诱导广泛范围的细胞密度，并立即将培养物与1.5％(w/v)的球研磨蟹壳几丁质接触。在各种情况下，在五天的生长期观察到细胞密度增加4到5个OD660纳米值。在实验误差内，所得的作为诱导时间的函数的几丁质酶活性与在几丁质上生长的低细胞密度批量培养观察到的相同。这表明了只有在几丁质上生长的小部分细胞中产生几丁质分解活性，而培养物的大部分仍然是受葡萄糖抑制的。
几丁质来源和预处理
因为生产几丁质分解酶集团的耗价在很大程度上确定了本发明的方法的经济问题，我们已经探索了几丁质来源以及一些制备几丁质底物的廉价方法对粘质沙雷氏菌和几丁质生产的影响。
图8a显示了几丁质来源对其它相同的粘质沙雷氏菌QM B1466的振摇烧瓶培养中的几丁质分解酶的生产和细胞生长的影响。在每一个这些培养的中，以大小相同的球研磨外骨骼粉末提供了相当浓度的几丁质。如图8a所示，在蟹和虾壳上生长的粘质沙雷氏菌培养物的几丁质分解酶的生产是相似的，但在蚝壳培养物中基本上是不可检测的，表明几丁质在后一系统中的存在相对较少。对于在相当浓度的蟹和虾壳上的生长观察到相似的细胞生长和最终的细胞密度(图8b)。在两个系统中，游离的N-乙酰-D-氨基葡糖的浓度仍然是低的而细胞数增加。在蚝壳上生长的培养物中没有或很少观察到细胞生长。
因为几丁质酶只能水解溶剂可接触到的β-1,4-键，蟹壳废物的有效表面面积和形态学可以影响酶生产和催化活性。我们已经探索了许多目的在于增加培养上清液中几丁质酶活性的廉价的底物预处理。这些包括球研磨以便增加颗粒的外部表面面积对体积的比例，以及高压灭菌和更强的蒸汽爆炸以便膨胀蟹壳颗粒并从而(可能)改变几丁质的可得性和形态学。高压灭菌是在蒸馏水和在二甲基乙酰亚胺或硫酸的稀释溶液中进行的，以便通过链间氢键结构的裂解膨胀蟹壳颗粒。选择二甲基乙酰亚胺是因为已经表明它是几丁质的有效溶剂。通常将硫酸用作纤维素处理中的膨胀剂。图16图解说明了对于几丁质反应时间的N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)的浓度的曲线，其中的几丁质已经锤研磨，球研磨，蒸汽爆炸和球研磨，酸蒸汽爆炸和球研磨以及二甲基乙酰亚胺处理。
图9a显示了在粘质沙雷氏菌的振摇烧瓶培养中额定颗粒直径Dn对几丁质酶活性的生产的影响。当Dn从约600微米下降到400微米，每单位颗粒的平均面积有2.25倍的直接的成比例的增加时最终的几丁质酶增加了稍微超过一倍的活性。但是当颗粒直径的下降到低于180微米时没有观察到最大的几丁质分解酶的活性的明显增加。最终的细胞密度在所有的培养方法中都相似(最大OD660纳米为3)。
如图9b所示，对在1％DMA中180微米到250微米的筛出部分高压灭菌(121℃)导致几丁质酶活性的小的但能再现的增加，表明颗粒形态学的变化可以导致更高的产量。但是，当溶剂是蒸馏水(没有显示)或1％的H2SO4时没有观察到提高。另外，正如图9c所示，对同样颗粒大小的部分的更强的蒸汽爆炸预处理导致加工条件的严酷性的增加以及几丁质酶生产的明显减少。对于最大几丁质酶活性的减少而言，在225℃蒸汽爆炸的1％的DMA中的蟹壳样品其系数超过2，而膨胀的胶质几丁质其系数超过6，其中所有的非几丁质类污染已经除去。总体来看，图9a,9b和9c表明根据甲壳纲外壳底物中几丁质/NAG的可得性几丁质酶活性有强烈非线性的下降的凹线。在低的可得几丁质浓度时，随着几丁质/NAG可得性的增加几丁质分解酶的生产增加。设计用于增加每克底物的几丁质的有效性的蟹壳颗粒的更强的预处理导致在培养物中游离NAG浓度的增加(起始)，这些培养物被扩展细胞快速地消耗。在NAG上生长的粘质沙雷氏菌培养物中没有产生几丁质分解活性。所以在这些条件下观察到的几丁质分解酶生产的抑制可能是由于过量的游离NAG和富余的可得几丁质包括可溶的几丁质低聚物引起的。
N-乙酰-D-氨基葡糖生产的速率限制步骤
通过测量在149小时的诱导(参见图7b)后回收的批量培养上清液中的几丁质酶和壳二糖酶的活性评估在几丁质到NAG的水解中粘质沙雷氏菌几丁质分解酶集团的限制速率的酶。利用了壳二糖(壳二糖酶的底物)和壳三糖(几丁质酶的底物)的pNP(对硝基苯)的类似物，并将每分钟释放的pNP的微摩尔数当作两个反应的活性单位。如图10所示，在上清液中壳二糖酶的活性超过几丁质酶两倍，这表明几丁质酶活性在水解反应序列中是限制速率的。
当蟹壳或膨胀的胶质几丁质与培养上清液在37℃和中性pH时接触时，N-乙酰-D-氨基葡糖是末端产物和所形成的占支配地位的可溶产物。图11显示了来自膨胀的胶质几丁质的可溶的水解产物的典型的HPLC层析谱。第一个和主要的峰是N-乙酰-D-氨基葡糖，组成约85％的可溶水解产物，而壳二糖(第二个峰)和壳三糖(第三个峰)是仅有的以明显浓度出现的其它产物。相当高的N-乙酰-D-氨基葡糖浓度进一步证实了几丁质酶活性限制粘质沙雷氏菌几丁质分解复合物对几丁质的整个水解速率。还没有任何其它中间产物如壳二糖(15％)或壳三糖(3.7％)的明显积累，如果几丁质酶对壳二糖酶活性的比例对后一种酶不利可以预料到上述情况。这是反应器设计时需要考虑的重要问题，因为可溶的壳低聚物(壳二糖，壳三糖，等等)的明显积累是不需要的，并且可能导致几丁质酶活性的终产物抑制。
温度和pH的影响
在图12的两个左边和右边的图表中，显示了总的几丁质酶活性分别对pH和温度的依赖关系，其中单位活性现在指在149小时诱导后所取的培养上清液中每小时生产1毫克NAG。两条曲线走向是一致的，与利用蟹壳几丁质还是膨胀的胶质几丁质作为底物无关。最适pH是接近中性，与对不同几丁质底物的早期研究一致(Monreal和Reese,1969)。
对于几丁质酶活性的最适温度是在40到50℃之间。在50℃以上的温度，活性快速下降，在60℃则接近零。对部分纯化的培养上清液进行不同的量热学扫描得到的数据(量热学科学公司，7707型热传导DSC)显示在接近60℃，pH7的几丁质酶变性。
图13a和图13b在两个图表中显示在温度升高时在149小时的培养上清液中几丁质酶和壳二糖酶活性的稳定性。对于每个数据点，将不含有几丁质的培养上清液在特定的温度下温育1到24小时的时期。然后在37℃，测试每个样品中几丁质酶和壳二糖酶的总的活性。在40℃和更低的温度下两种酶仍然保持高的水解活性，随着时间几乎没有或没有显示下降。在50℃时温育培养上清液在24小时后导致逐渐失去几丁质酶活性到它的最大值的约一半。在55℃时，几丁质酶的活性下降到接近零(约15％最大活性)，该温度完全处于几丁质酶的热变性的范托夫温度范围之内(根据DSC数据)。对壳二糖酶观察到同样的走向，其中在温育温度为约0℃的热变性温度或以上，壳二糖酶活性下降到接近零。
存在几丁质时，这更精确地反映了真正的反应器条件，在温度范围从30到60℃时对一个24小时的时期测量几丁质酶的活性。在这种情况下，在温育温度下测试活性。几丁质酶催化的几丁质水解显示了如图14所示低于50℃的温度下的阿累尼乌斯行为。对于不同时间点阿累尼乌斯曲线的斜率大致相同。因为这一系统代表了酶集团和不同的反应，斜面只给出了对于该反应的有效活化能Eeff。从斜率的平均值来看，Eeff=374±67焦耳/摩尔。截距随着反应时间的增加而下降，表明有如下所述的终产物抑制，该截距成比例于反应频率系数。
酶抑制
利用p-硝基苯底物类似物测试终产物抑制性以便测试在存在增加浓度的N-乙酰-D-氨基葡糖(NAG)时的几丁质酶和壳二糖酶的活性。图15a显示的结果表明在培养上清液中的两者活性受终产物(NAG)的抑制。但是，壳二糖酶的酶活性的下降远远比几丁质酶的明显。在测试培养基中40毫摩尔/升NAG时，几丁质酶活性只失去30％，而壳二糖酶活性下降了70％。
通过测试在广泛范围的底物浓度、有和没有加入固定量的N-乙酰-D-氨基葡糖时粘质沙雷氏菌培养上清液中壳二糖酶的活性确定N-乙酰-D-氨基葡糖对壳二糖酶的抑制的特性。对得到的伊迪-霍夫斯梯图(图15b)的分析表明是非竞争性抑制。当增加测试培养基中的NAG的浓度时导致Vmax下降时Km不受影响。从伊迪-霍夫斯梯分析计算的抑制常数Ki是1.00(±0.15)毫摩尔/升，表明对于局部NAG浓度超过约0.2克/升的反应器条件时，水解生物反应器中生产速率和产物的纯度将降低。这使简单的生物反应器构型如一级连续搅拌箱反应器(CSTR)的利用率最小，表明最适反应器构型是基于抽水装置流动反应器方案的，它在反应器流中提供低的起始产物浓度和连续的产物的产生(如包装床反应器或系列CSTR)。
因为当在几丁质上生长时粘质沙雷氏菌产生的多种酶具有几丁质酶活性，所以确定几丁质酶受N-乙酰-D-氨基葡糖的抑制的特性更加困难。虽然一些结果仍然存在问题，已经在粘质沙雷氏菌培养物的上清液中鉴定了五种不同的几丁质酶[Fuchs,R.L.,Mcpherson,S.A.，和Drahos,D.J.(1986)，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.),51,504-509]。这些酶中每一种在几丁质水解中的作用还不清楚，对它们的任何一个的纯化形式的酶学数据还得到的很少。但是，从我们的结果(图15a)可以清楚地看到终产物对几丁质酶活性的抑制比对壳二糖酶所观察到的明显要弱。
这一研究证明用于粘质沙雷氏菌中几丁质分解酶集团的大规模生产的划算的培养基，以及利用这一系统从几丁质类废物水解生产N-乙酰-D-氨基葡糖的可行性是实际的。从这一研究的结果以及理想的包装床模型(抽水装置流动，非液体化或包装混合)表明1000升在最适条件下操作并含有20单位/毫升几丁质酶活性(从我们的培养上清液得到)和过量的几丁质的生物反应器每天能够生产超过半吨的N-乙酰-D-氨基葡糖。
所提议的方法的经济情况将依赖于许多因素，最令人注意的是有效设计几丁质生物反应器以便使几丁质酶和壳二糖酶的损失(如失活)和抑制最小。在40℃时，超过24小时的时间内粘质沙雷氏菌培养上清液中的几丁质酶和壳二糖酶活性基本没有损失。但是，总的几丁质酶和壳二糖酶活性受到终产物N-乙酰-D-氨基葡糖的抑制。这表明一级连续搅拌箱反应器将不是有效的，而需要更复杂的构型，如产生产物浓度梯度的包装床反应器。
表1
粘质沙雷氏菌培养的培养基组成
组成            浓度(克/升)
               最小培养基    最适培养基
葡萄糖          2.00         0
几丁质          0            15
酵母提取物      0            0.1
KH2PO4        6.81         0.136
K2HPO4        2.61         0
NaCl             10.00        0
(NH4)2SO4    1.00         0
MgSO4·7H2O   0.123        0.15
CaCl2          0.0147       0
金属溶液*      1.0％(v/v)   0
*在1升蒸馏水中：3.84克柠檬酸，55.6毫克FeSO4·7H2O,28.7毫克ZnSO4·7H2O,16.9毫克MnSO4·H2O,2.5毫克CuSO4·5H2O,2.5毫克CoCl2,6.2毫克H3BO3。

Claims (40)

1．一种生产N-乙酰-D-氨基葡糖(2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖)的方法，该方法包括利用选定的微生物发酵从甲壳纲的外骨骼得到的几丁质诱导生产至少一种几丁质酶和一种壳二糖酶得到的几丁质分解酶集团酶促水解几丁质，以从几丁质分解酶集团分离N-乙酰-D-氨基葡糖。
2．一种根据权利要求1所要求的方法，其中几丁质分解酶集团至少含有原核或真核微生物所生产和分泌的一种几丁质酶和一种壳二糖酶。
3．一种根据权利要求2所要求的方法，其中几丁质酶是内切或外切的β-1,4-多糖水解酶(EC 3.2.1.14)，壳二糖酶是β-n-乙酰氨基葡糖酶(HC 3.2.1.30)，(也被称为乙酰氨基脱氧葡萄糖水解酶(BC 3.2.1.29))，或β-N-乙酰己糖胺酶(EC 3.2.1.52))。
4．一种根据权利要求1所要求的方法，其中甲壳纲选自含有磷虾、虾、蟹和龙虾的组。
5．一种根据权利要求2所要求的方法，其中原核微生物是选自含有粘质沙雷氏菌，变青链霉菌和液化沙雷氏菌的组的细菌细胞系。
6．一种根据权利要求2所要求的方法，其中真核微生物是选自含有Trichodema harzanum和疣孢漆斑菌的组的真菌细胞系。
7．一种根据权利要求1所要求的方法，其中通过两步骤交叉流动浓缩酶集团。
8．一种根据权利要求7所要求的方法，其中该方法是在5.5和8之间的pH和25℃和55℃之间的温度下进行的。
9．生产几丁质分解酶集团的方法，包括：
(a)在发酵罐或培养容器中加入含有几丁质的物质；
(b)通过在发酵罐或培养容器中加入原核或真核微生物的接种物生产培养物以便诱导扩展微生物和生产具有几丁质酶或壳二糖酶活性的酶；
(c)从培养物中回收几丁质降解酶和壳二糖降解酶集团。
10．一种根据权利要求9所要求的方法，其中几丁质酶降解酶和壳二糖酶降解酶集团包含在细胞外液中。
11．一种根据权利要求9所要求的方法，其中通过将培养物通过膜分离器产生含有几丁质分解酶集团的过滤溶液回收酶，该几丁质分解酶集团至少含有一种几丁质酶和一种壳二糖酶。
12．一种根据权利要求9所要求的方法，其中通过离心培养物产生含有几丁质分解酶集团的过滤溶液回收酶，该酶集团至少含有一种几丁质酶和一种壳二糖酶。
13．一种根据权利要求11所要求的方法，其中将来自膜分离器的滞留物再循环回发酵罐或培养容器中。
14．一种根据权利要求12所要求的方法，其中将来自膜分离器的滞留物再循环回到发酵罐或培养容器中。
15．一种生产N-乙酰-氨基葡糖的方法，包括：
(a)在发酵罐或培养容器中加入含有几丁质的固体底物，确定的无碳水化合物的培养基，以及当在几丁质上生长时生产几丁质降解和壳二糖降解的酶的微生物；
(b)通过应用一个培养方案生产培养物，该方案诱导微生物生产和分泌至少含有一种几丁质降解酶(几丁质酶)和一种壳二糖降解酶(壳二糖酶)的几丁质分解酶集团；
(c)从培养物的其它成份分离几丁质分解酶集团；
(d)机械地或物理-化学地处理含有几丁质的固体；
(e)在几丁质水解反应器中加入步骤(c)中分离的几丁质分解酶集团和步骤(d)的含有几丁质的固体，在该反应器中，将固体的几丁质成份水解成N-乙酰-D-氨基葡糖；
(f)将N-乙酰-D-氨基葡糖和几丁质分解酶集团分离成含有N-乙酰-D-氨基葡糖的过滤流和含有几丁质分解酶的滞留流。
16．一种根据权利要求15所要求的方法，其中将含有几丁质酶和壳二糖酶的几丁质分解酶再循环到几丁质水解反应器。
17．一种根据权利要求15所要求的方法，其中步骤(e)的几丁质水解反应器是连续的两级反应器。
18．一种根据权利要求17所要求的方法，其中两级反应器包括单个单位，其中反应器的工作体积的底部含有具有几丁质固体的包装床，含有酶的移动相通过包装床，其中上部是无固体的含有壳二糖降解酶的水溶液。
19．一种根据权利要求17所要求的方法，其中两级反应器包括两个连续的反应器，其中第一个反应器具有含有几丁质固体的包装床，含有酶的移动相通过包装床，其中第二个反应器是含有无固体的水溶液的搅拌箱，无固体的水溶液被一种或几种壳二糖降解酶催化。
20．一种根据权利要求18所要求的方法，其中将酶集团进料溶液加入包装床的底部。
21．一种根据权利要求17所要求的方法，其中两级反应器维持在5.5到7.5之间的pH和30℃到55℃之间的等温温度。
22．一种根据权利要求15所要求的方法，其中将含有几丁质的固体预处理以便增强几丁质的表面有效性。
23．一种根据权利要求22所要求的方法，其中预处理方法包括球研磨或锤研磨。
24．一种根据权利要求22所要求的方法，其中预处理方法包括含有几丁质的固体的蒸汽爆炸或蒸汽膨胀。
25．一种根据权利要求15所要求的方法，其中步骤(e)的几丁质水解反应器是半液体化床式反应器。
26．一种根据权利要求15所要求的方法，其中将步骤(c)的几丁质分解酶集团通过膜过滤方法分离。
27．一种根据权利要求15所要求的方法，其中通过超滤方法将几丁质分解酶和N-乙酰-D-氨基葡糖分离成过滤流。
28．生产N-乙酰-D-氨基葡糖的方法，包括：
(a)在发酵罐或培养容器中加入含几丁质的固体底物，确定的无碳水化合物的培养基的含有几丁质的固体底物，以及当在几丁质上生长时产生几丁质降解和壳二糖降解酶的微生物；
(b)通过应用一个培养方案生产培养物，在该培养方案中，诱导微生物生产和分泌至少含有一种几丁质降解酶(几丁质酶)和-种壳二糖降解酶(壳二糖酶)的几丁质分解酶集团；
(c)从培养物的其它成份分离几丁质分解酶集团；
(d)在几丁质水解反应器中导入几丁质分解酶集团和含有几丁质的固体，其中将固体的几丁质成份水解成N-乙酰-D-氨基葡糖；
(e)将N-乙酰-D-氨基葡糖和几丁质分解酶集团分离成含有N-乙酰-D-氨基葡糖的过滤流和含有几丁质分解酶集团的滞留流。
29．一种根据权利要求28所要求的方法，其中将含有几丁质酶和壳二糖酶的几丁质分解酶再循环到几丁质水解反应器。
30．一种根据权利要求28所要求的方法，其中步骤(e)的几丁质水解反应器是连续的两级反应器。
31．一种根据权利要求30所要求的方法，其中两级反应器包括单个单位，其中反应器的工作体积的底部含有具有几丁质固体的包装床，含有酶的移动相通过包装床，其中上部是含有壳二糖降解酶的无固体水溶液。
32．一种根据权利要求30所要求的方法，其中两级反应器包括两个连续的反应器，其中第一个反应器含有具有几丁质固体的包装床，含有酶的移动相通过包装床，其中第二个反应器是含有无固体水溶液的搅拌箱，该水溶液被一种或几种壳二糖降解酶催化。
33．一种根据权利要求31所要求的方法，其中将酶集团进料溶液加入包装床的底部。
34．一种根据权利要求30所要求的方法，其中两级反应器维持在5.5到7.5之间的pH和30℃到55℃之间的等温温度。
35．一种根据权利要求28所要求的方法，其中将含有几丁质的固体预处理以便增强几丁质的表面有效性。
36．一种根据权利要求35所要求的方法，其中预处理包括球研磨或锤研磨。
37．一种根据权利要求35所要求的方法，其中预处理包括含有几丁质的固体的蒸汽爆炸或蒸汽膨胀。
38．一种根据权利要求28所要求的方法，其中步骤(e)的几丁质水解反应器是半液体化床式反应器。
39．一种根据权利要求28所要求的方法，其中将步骤(c)的几丁质分解酶集团通过膜过滤方法分离。
40．一种根据权利要求28所要求的方法，其中将几丁质分解酶和N-乙酰-D-氨基葡糖通过超滤方法分离成过滤流。
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