JP2625664B2 - アズキのエチレンで誘導される酸性キチナーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はキチナーゼ活性を有する
タンパク質、当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に
関するもので、高い病害虫及び病原菌抵抗性を有する植
物の育種に利用可能なものである。

【０００２】

【従来の技術】キチナーゼは N-アセチル-D-グルコサミ
ンがβ(1,4)結合した高分子多糖であるキチンに作用
し、β-(1,4)結合を加水分解することにより、N-アセチ
ル-D-グルコサミンを遊離する活性を有する。

【０００３】キチナーゼは微生物から、甲殻類、昆虫な
どの節足動物、あるいは高等植物まで生物種の広い範囲
に渡って分布する。これらのキチナーゼには、それぞれ
の生物種で固有の、そして重要な役割がある。例えば、
外被がキチンで構成されている節足動物においては、成
長にともなう脱皮の過程にキチナーゼは不可欠である。

【０００４】高等植物は構成成分としてキチンを含まな
いにもかかわらず、キチナーゼはエンドウ、トマト、メ
ロン、タマネギ、キャベツなど高等植物に広く分布す
る。これらのキチナーゼは高等植物の自己防衛機能に関
係すると考えられている。

【０００５】自然界では、植物も植物病原菌の感染を受
けたり、昆虫の食害を受けたり、たえず外敵との接触が
ある。これらの侵入を受けたとき、植物も様々な防衛反
応を発動して、外敵に対抗する。植物のキチナーゼはこ
のような防衛反応の１つとして誘導される。これらのキ
チナーゼはキチンで構成されている病原菌の細胞壁や昆
虫の表皮を分解して、病原菌や昆虫を駆逐したり、死滅
させたりすると考えられている。

【０００６】さらに、病原菌の細胞壁などのキチナーゼ
による分解産物は、植物の産生する抗菌物質であるファ
イトアレキシンの合成酵素、プロテアーゼ・インヒビタ
ー、抗菌タンパク質などを誘導するエリシター活性を有
し、キチナーゼの誘導が引き金となり、様々な自己防衛
機能が作動することになる。すなわち、植物が耐病性を
発揮する上で、キチナーゼは重要な機能を担っていると
考えることができる。

【０００７】農業上、病害の発生を制御することは生産
性を高める上で大変重要な課題である。過去において繰
り返して発生した飢饉は植物病害の大発生により収穫が
皆無になったことが原因であったことも少なくない。ま
た、耕地面積の増加以上に収量が増大してきたことも、
効率的に病害を抑制することに成功したことが、疑いな
く、その１つの要因である。

【０００８】植物病害の制御には、農薬の開発と病害へ
の抵抗性品種の育種という２つの異なる側面からの寄与
がある。しかし、近年、環境問題への関心が高まるにつ
れ、大量の農薬を使用することによる生態系への悪影響
が懸念されるようになってきた。したがって、より病害
抵抗性の強い品種の育成という育種的な手段による植物
病害の制御がクローズ・アップされるようになってき
た。

【０００９】抵抗性の形質は近縁野性種などから交配に
より導入されるが、これらの野性種は栽培種に要求され
る経済的な性質を持っていない場合がほとんどであり、
実用的な栽培品種を育成するには、さらに何世代もの掛
け合わせを必要とし、長い年月が要求される。

【００１０】近年、植物でも組換えＤＮＡ技術が進歩
し、従来では長い年月が必要であった品種改良に組換え
ＤＮＡ技術を導入することにより、より短期間に、より
効率的に育種のプログラムが進行するようになることが
期待されている。

【００１１】病害抵抗性の改良は、最初に組換えＤＮＡ
技術が応用された領域である。ウィルスの外被タンパク
質遺伝子を植物に導入することによりウィルス抵抗性植
物が育成されたのはその一例である。

【００１２】キチナーゼは上述したように、病原菌を直
接攻撃する作用があるだけではなく、植物の持つ一連の
自己防衛反応を作動させる作用もあり、病害抵抗性発現
の初期の段階で非常に重要な機能を担っていると考えら
れる。したがって、組換えＤＮＡ法による耐病性の改良
のターゲットとしてキチナーゼ遺伝子を取り上げること
は有意義であると考えられる。すなわち、キチナーゼ遺
伝子を操作することにより、その発現量を増大させた
り、恒常的に発現させたりすることにより、植物に強い
病害抵抗性を付与できることが期待できる。

【００１３】キチナーゼ遺伝子の導入による植物の耐病
性の強化のためには、キチナーゼ遺伝子を単離すること
が不可欠である。キチナーゼ遺伝子はすでに多くの微生
物（例えばJ. D. G. Jones, et al.,EMBOJ., 5, 467-47
3(1986)など）やインゲンマメ (K. E. Broglie, et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6820-6824(198
6))、タバコ (H. Shinshi, et al., Proc. Natl.Acad.
Sci. USA, 84, 89-93(1987))、キュウリ(J. P. Metrau
x, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,896-900
(1989))、ジャガイモ(J. J. Gaynor, Nucleic Acid Re
s., 16, 5210(1988))などから単離されているが、キュ
ウリのキチナーゼを除けば、これらの多くは等電点の高
い塩基性のキチナーゼ、あるいは、それと相同性の高い
キチナーゼであった。

【００１４】高等植物においては、キチナーゼには様々
なアイソザイムが存在し、機能分化があると考えられて
いる。そのようなアイソザイムの中でも、等電点の低い
酸性キチナーゼが細胞間隙に分泌され、蓄積されること
が知られており、(T. Boller, Physiol. Mol. Plant Pa
thol., 33, 11-16(1988))このような酸性キチナーゼが
耐病性発現に関与するものと考えられている。

【００１５】また、耐病性発現の最も初期の段階にシグ
ナル伝達に関与する物質はエチレンであり、上述の酸性
キチナーゼもエチレンで誘導されると考えられる。多く
の植物種で塩基性キチナーゼがエチレンで誘導されるこ
とが観察されているが、キュウリの酸性キチナーゼのエ
チレンによる誘導は明らかではない(J. P. Metraux,et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 896-900(198
9))。

【００１６】以上のような観点から、キチナーゼ遺伝子
の導入により、耐病性の強化を目指すためには、耐病性
発現に関与することが考えられるエチレンで誘導される
酸性キチナーゼの遺伝子を単離する必要があった。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明が解決
しようとする課題はエチレンで誘導される酸性キチナー
ゼの遺伝子を単離することである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意検討の
結果、エチレン処理したアズキの初生葉よりエチレンで
誘導される酸性キチナーゼを単離精製し、当該タンパク
質のＮ末端フラグメントのアミノ酸配列を決定した。そ
れをもとにＰＣＲ反応によりプローブを作成し、当該タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡをエチレン処理したアズ
キの初生葉より作成したｃＤＮＡライブラリーよりクロ
ーニングし、その塩基配列を決定した。このアズキの酸
性キチナーゼをコードするｃＤＮＡを保持する大腸菌AJ
12645は通産省の微生物工業技術研究所へ寄託し、寄託
番号FERM P-12485を得た。

【００１９】即ち、本発明は配列表の配列番号１に記載
されたアミノ酸配列よりＮ末端から３４個の配列を欠失
した配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するキチナー
ゼ活性を有するタンパク質に関する。また、係るキチナ
ーゼ活性を有するタンパク質に分泌のシグナル配列とな
るＮ末端に３４個のアミノ酸配列が付加した当該タンパ
ク質の前駆体タンパク質にも関するものである。本発明
は当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列、または、当
該タンパク質の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡ配列にも関するもので
ある。

【００２０】また本発明におけるキチナーゼには、キチ
ナーゼ活性を有する限り、配列表の配列番号１、２に示
されたアミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に置換されたもの、またＮ末端または
Ｃ末端から１ないし数個のアミノ酸が欠失したものも含
まれる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例をもとに具体的に説明する。

【００２２】（実施例１ アズキのエチレンで誘導され
る酸性キチナーゼ） エチレン処理したアズキ初生葉からのキチナーゼは以下
のように精製した。播種後10日目のアズキ初生葉を切取
り、20ppmのエチレンで24時間処理し、pH4.0の酢酸緩衝
液でタンパク質を抽出し粗抽出液とした。キチナーゼ活
性はコロイダルキチンに試料溶液を反応させ、生成する
還元糖をBollerらの方法(T. Boller, etal.,Planta, 15
7, 22-31, (1983))で定量した。粗抽出液は硫安塩析の
後、MonoQカラムを装着したファルマシア社製のＦＰＬ
Ｃによりアニオン交換クロマトグラフィーを行いキチナ
ーゼ活性画分を集めた。さらにSurperose6を装着したＦ
ＰＬＣにより、ゲルろ過により分子量21,000に溶出され
るキチナーゼ画分を回収した。これらの操作でキチナー
ゼは90％以上精製された。得られたタンパク質のアミノ
酸配列をアプライド・バイオシステム社製の気相プロテ
イン・シークエンサーにより決定したところ40番目まで
の配列は配列表の配列番号３に記載された配列であっ
た。

【００２３】（実施例２ アズキ酸性キチナーゼをコー
ドするｃＤＮＡの取得） キチナーゼのｃＤＮＡのクローニングは以下のように実
施した。実施例１に記載された同様の方法により20μg
のアズキ初生葉をエチレン処理した後、液体窒素により
凍結し、ワーリングブレンダーにて粉砕した。これを80
mlの4.2 M グアニジンチオシアネート、25 mM クエン酸
三ナトリウム、0.1 M メルカプトエタノール、0.5％ラ
ウロイルザルコシン酸水溶液に懸濁し、さらにポリトロ
ンで組織を完全に破砕した。ナイロンメッシュでろ過し
た後、20℃、20分間15,000rpmの遠心を行い上清を回収
した。もう一度同じ遠心を行い上清を回収した後、これ
を日立製作所製の超遠心機のスイング・ローターSRP28
用のチューブ中で、9 ml の5.7 M CsCl、 0.1 M EDTA(p
H 7.5)に重層し、20℃、24時間、28,000rpmの超遠心を
行いＲＮＡを沈降させた。上清を捨てた後、沈澱したＲ
ＮＡは0.5 mMの 0.5M NaClに溶解させ、常法に従いエタ
ノール沈澱を行った。沈澱は10 ml の10 mMTris-HCl (p
H 7.5),1 mM EDTAに溶解し、粗ＲＮＡ溶液とした。粗Ｒ
ＮＡ溶液は常法に従い、オリゴｄＴセルロースカラムを
通し(T. Maniatis, et al., Molecular Cloning, 1, 7.
26-7.27 (1989))、poly(A)+ＲＮＡを回収し、これをｍ
ＲＮＡ画分とした。ｍＲＮＡはアマルシャム社製のｃＤ
ＮＡ合成キットに供し、ｃＤＮＡを作成した。作成した
ｃＤＮＡはEcoRＩリンカーを付加した後、λgt11ベクタ
ーに組み込みｃＤＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングは以下のように行っ
た。タンパク化学的に決定したキチナーゼＮ末端フラグ
メントのアミノ酸配列を基に、７番目のアミノ酸残基か
ら１４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列と、
２４番目のアミノ酸残基から３１番目のアミノ酸残基に
相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、こ
れを鋳型としてＰＣＲ反応 (H. Erlich ed:PCR Techno
logy, Stockton Press (1989))によりプローブを増幅
し、この断片を32Ｐで標識し、ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。得られたｃＤＮＡの塩基配列を常
法に従いダイデオキシ法により決定したところ、配列表
の配列番号２に記載したＤＮＡ配列が得られ、これは実
施例１で決定したキチナーゼの配列表の配列番号３のア
ミノ酸配列をコードするものであり、このｃＤＮＡがキ
チナーゼのｃＤＮＡであることが確かめられた。また、
このＤＮＡ配列から類推されるキチナーゼの全アミノ酸
配列を配列表の配列番号１、２に示す。

【００２４】

【発明の効果】本発明はアズキにおいて、植物の自己防
衛機能に関与するものと考えられるエチレン誘導性酸性
キチナーゼ及びこれをコードするＤＮＡ配列を提供する
ことにより、病原菌、害虫への抵抗性を持つ植物体を育
種することを可能ならしめるものである。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Vigna angularis 組織の種類：エチレン処理を施した初生葉 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：−３４．．−１ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..264 特徴を決定した方法：Ｐ 他の情報：アズキのエチレンで誘導される酸性キチナー
ゼ 配列： Met Lys Pro Asn Met Ala Cys Leu Lys Gln Val Ser Ala Leu Leu Leu -30 -25 -20 Pro Leu Leu Phe Ile Ser Phe Phe Lys Pro Ser His Ala Gly Gly Ile -15 -10 -5 Ser Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly Ser Leu Ala Asp Ala 1 5 10 Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Ala Phe Leu Phe Thr 15 20 25 30 Phe Gly Gly Gly Gln Thr Phe Gln Leu Asn Leu Ala Gly His Cys Asn 35 40 45 Pro Ser Ile Asn Asn Cys Asn Val Phe Ser Asp Gln Ile Lys Glu Cys 50 55 60 Gln Ser Lys Asp Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly 65 70 75 Ser Tyr Ser Leu Thr Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln Val Ala Asn Tyr 80 85 90 Ile Trp Asn Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Ser Ser Arg Pro Leu Gly 95 100 105 110 Asp Ala Ile Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser Gly Thr Gly 115 120 125 Glu His Trp Asp Asp Leu Ala Arg Ala Leu Lys Gly Phe Asn Ser Gln 130 135 140 Leu Leu Leu Thr Ala Ala Pro Gln Cys Pro Ile Pro Asp Ala His Leu 145 150 155 Asp Thr Ala Ile Lys Thr Gly Leu Phe Asp Ile Val Trp Val Gln Phe 160 165 170 Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Gln Tyr Ser Ser Gly Asn Thr Asn Asp Leu 175 180 185 190 Ile Ser Ser Trp Asn Gln Trp Thr Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Phe 195 200 205 Leu Gly Val Pro Ala Ser Thr Ala Ala Ala Gly Ser Gly Phe Ile Pro 210 215 220 Ala Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Thr Ile Lys Gly Ser Ser 225 230 235 Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp Gly Gln Ser 240 245 250 Gly Tyr Ser Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val 255 260 配列番号：２ 配列の長さ：１０８９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Vigna angularis 組織の種類：エチレン処理を施した初生葉 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：13..906 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：13..114 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：115..906 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GACAACACACTC ATG AAA CCT AAC ATG GCT TGC CTC AAA CAA GTT TCA GCC 51 Met Lys Pro Asn Met Ala Cys Leu Lys Gln Val Ser Ala -30 -25 CTG TTA CTT CCT CTG TTG TTC ATT TCC TTC TTC AAA CCC TCC CAC GCC 99 Leu Leu Leu Pro Leu Leu Phe Ile Ser Phe Phe Lys Pro Ser His Ala -20 -15 -10 GGA GGA ATT TCC GTC TAC TGG GGT CAA AAC GGT AAC GAG GGC TCC CTG 147 Gly Gly Ile Ser Val Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly Ser Leu -5 1 5 10 GCC GAC GCA TGC AAC ACC GGC AAC TAC AAA TAC GTC AAT ATA GCA TTC 195 Ala Asp Ala Cys Asn Thr Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Ala Phe 15 20 25 TTG TTC ACG TTC GGC GGC GGC CAG ACC CCG CAA CTG AAC CTT GCC GGC 243 Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Gln Thr Phe Gln Leu Asn Leu Ala Gly 30 35 40 CAC TGC AAC CCC TCT ATC AAC AAC TGC AAC GTG TTC AGC GAC CAG ATC 291 His Cys Asn Pro Ser Ile Asn Asn Cys Asn Val Phe Ser Asp Gln Ile 45 50 55 AAG GAG TGC CAG AGC AAG GAC ATC AAA GTG CTC CTG TCA CTA GGC GGC 339 Lys Glu Cys Gln Ser Lys Asp Ile Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly 60 65 70 75 GCC AGT GGC AGC TAC TCC CTC ACG TCC GCC GAT GAC GCA ACA CAG GTT 387 Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Ser Ala Asp Asp Ala Thr Gln Val 80 85 90 GCC AAC TAC ATC TGG AAC AAC TTT CTC GGC GGG CAG TCG AGC TCC CGT 435 Ala Asn Tyr Ile Trp Asn Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Ser Ser Arg 95 100 105 CCT CTG GGC GAC GCT ATT TTA GAC GGT GTC GAT TTC GAC ATC GAA TCA 483 Pro Leu Gly Asp Ala Ile Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp Ile Glu Ser 110 115 120 GGC ACC GGT GAG CAT TGG GAT GAT CTC GCA AGA GCC CTA AAA GGG TTT 531 Gly Thr Gly Glu His Trp Asp Asp Leu Ala Arg Ala Leu Lys Gly Phe 125 130 135 AAT TCA CAG TTG CTC TTA ACT GCT GCA CCG CAG TGT CCG ATC CCT GAT 579 Asn Ser Gln Leu Leu Leu Thr Ala Ala Pro Gln Cys Pro Ile Pro Asp 140 145 150 155 GCT CAC TTG GAT ACT GCC ATC AAA ACT GGG CTC TTT GAC ATT GTT TGG 627 Ala His Leu Asp Thr Ala Ile Lys Thr Gly Leu Phe Asp Ile Val Trp 160 165 170 GTG CAA TTC TAC AAC AAC CCT CCT TGC CAG TAT TCG AGT GGC AAC ACC 675 Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Gln Tyr Ser Ser Gly Asn Thr 175 180 185 AAC GAC CTC ATC AGT TCT TGG AAC CAG TGG ACC TCA AGC CAG GCG AAG 723 Asn Asp Leu Ile Ser Ser Trp Asn Gln Trp Thr Ser Ser Gln Ala Lys 190 195 200 CAG TTG TTT TTG GGA GTG CCA GCT TCT ACA GCA GCT GCT GGA AGT GGG 771 Gln Leu Phe Leu Gly Val Pro Ala Ser Thr Ala Ala Ala Gly Ser Gly 205 210 215 TTT ATT CCT GCT GAT GTG TTA ACT TCT CAG GTT CTT CCT ACC ATC AAG 819 Phe Ile Pro Ala Asp Val Leu Thr Ser Gln Val Leu Pro Thr Ile Lys 220 225 230 235 GGT TCT TCC AAG TAT GGA GGA GTC ATG CTG TGG GAC AGA TTC AAT GAC 867 Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp Asp Arg Phe Asn Asp 240 245 250 GGT CAA AGC GGA TAT AGT GGT GCT ATC ATA GGA AGT GTT TAGTTTGTTTT 917 Gly Gln Ser Gly Tyr Ser Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val 255 260 AGGTTGACATTACATATCCATATATTTAGATACTGTTTTCTGTCTTTGGAATAAGTAGCA 977 CCTTCCGTAGGATTTCTTTTCTTCCTACACACACATGTAGAGTGCTATGTGTTATTTATC 1037 ATATAAAATATGTCTCATCACAGTAAAAGAAAGTATAGATTATCTTCAAAAA 1089 配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：Vigna angularis 組織の種類：エチレン処理を施した初生葉 配列の特徴 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..40 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly Ser Leu Ala Asp Ala Cys Asn 1 5 10 15 Thr Gly Asn Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Ala Phe Leu Phe Thr Phe Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Thr Phe Gln Leu Asn 35 40

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載されたアミノ
   酸配列のうち、１番目のチロシン残基から２６４番目の
   バリン残基に至るアミノ酸配列を有し、かつ、N-アセチ
   ル-D-グルコサミンがβ-(1,4)結合により重合した多糖
   に作用し、そのβ-(1,4)結合を加水分解することによ
   り、N-アセチル-D-グルコサミンを遊離せしめる能力を
   保持することを特徴とする、キチナーゼ活性を有するタ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載されたアミ
   ノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のタンパク質
   をコードするＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載された塩基配
   列の内、１６３番目のチミジン残基から９０６番目のチ
   ミジン残基に至る塩基配列を有する請求項３に記載のＤ
   ＮＡ配列。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載された塩基
   配列を有する請求項３に記載のＤＮＡ配列。