CN1201816C - Igf/igfbp的药用制剂 - Google Patents

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Abstract

公开IGF/IGFBP复合物的新型药用制剂。IGF/IGFBP复合物、最好是rhIGF-I/IGFBP-3复合物用增量剂和任选缓冲盐配制，但没有外加的渗压剂盐。还公开了IGF/IGFBP复合物的冷冻干燥制剂。

Description

IGF/IGFBP的药用制剂
                        技术领域
本发明总体上涉及治疗性蛋白制剂领域，尤其是涉及胰岛素样生长因子I(IGF-I)和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的复合物制剂。
                       技术背景
生长因子是在一种确定的靶细胞群中刺激各种各样生物反应(如DNA合成、细胞分裂、特定基因的表达等)的多肽。已鉴定许多不同的生长因子家族，包括转化生长因子β家族(TGF-β)、表皮生长因子和转化生长因子α(TGF-α)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子家族(FGF)和胰岛素样生长因子家族(IGF)，后者包括IGF-I和IGF-II。
IGF-I和IGF-II(所述“IGF”)在氨基酸序列和结构上是相关的，每种多肽分子量约为7.5kDa。IGF-I介导生长激素的主要作用，因此是出生后生长的主要介质。因为用这类生长因子处理细胞导致IGF-I的生成增加，所以IGF-I与其它各种生长因子的作用有关。相比之下，认为IGF-II在胎儿的生长中起主要作用。IGF-I和IGF-II两者均有胰岛素样活性(其名字由此而来)，并对神经组织细胞具有促细胞有丝分裂(刺激细胞分裂)作用。
几乎所有IGF都以IGF-I、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)及一种称作酸不稳定亚单位(ALS)的更大蛋白质亚单位的非共价结合的复合物形式循环，这就是几乎检测不到游离IGF-I的原因。该三元复合物由这三种组分各等摩尔量组成。ALS没有直接与IGF-结合的活性，而是似乎只与IGF/IGFBP-3复合物结合(Baxter等，J.Biol.Chem.264(20)：11843-11848，1989)，虽然一些报告提出在没有IGF的情况下IGFBP-3能与大鼠ALS结合(Lee等，Endocrinology136：4982-4989，1995)。IGF/IGFBP-3/ALS三元复合物的分子量约为150kDa。该三元复合物被认为起到“防止游离IGF浓度快速变化的IGF-I和IGF-II的储存池及缓冲剂”的作用(Blum等(1991)，载于MODERN CONCEPTS OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS中的“用作临床指标的血浆IGFBP-3水平”，第381-393页，E.M.Spencer编辑，Elsevier，纽约)。在循环中大量过量的游离ALS的确存在，而基本没有过量的(未结合的)IGFBP-3(Baxter，J.Clin.Endocrinol.Metab.67：265-272，1988)。
IGF-I和IGFBP-3的复合物(“二元复合物”或“IGF-I/IGFBP-3”)与非复合IGF-I在物理和化学性质上有很大不同。二元复合物比非复合IGF-I约大5倍，具有不同的总pI，并具有不同的总疏水性。这些差异导致二元复合物与IGF-I相比作用大不相同。
由于其活性范围广，已将IGF-I研制为各种疾病的治疗药物，包括肌萎缩性脊髓侧索硬化(通常称为Lou Gehrig’s病)和糖尿病。遗憾的是IGF-I的使用伴有各种不良的副作用，包括低血糖、浮肿(它可引起Bell’s麻痹、腕管综合症以及各种其它有害病症)、低磷酸盐血症(低血清磷)及高钠血症(过量的血清钠)。以IGF-I和IGFBP-3的复合物给予IGF-I能减少或去除这些不良副作用(Adams等，1996，Prog.Growth Factor Res.6：2-4)。
尽管给予IGF-I/IGFBP-3复合物可能是最理想的，该复合物象许多蛋白质一样，在多数制剂中具有非常有限的稳定性(存放期)。已公开单独的或与另一种蛋白(如生长激素)结合的IGF-I的各种旨在稳定的制剂，但这样公开的IGF-I/IGFBP-3制剂由于其蛋白质稳定性差而并不令人满意。这些二元复合物制剂需要频繁地在非常低的温度下(如-70℃)冷冻该蛋白质。冷冻机尤其是需要保持在-70℃的超低温冷冻机除去研究设备之外是不常有的，并且也是非常昂贵的。相应地能够在普通冰箱温度或更高温度下储存而仍提供较长存放期的制剂对于治疗用的IGF-I/IGFBP的商业性开发是关键的。
已公开IGF的各种制剂，尤其是IGF-I的各种制剂。例如美国专利第5,681,814公开一种皮下注射用的IGF-I制剂，该制剂在pH5-5.5的缓冲溶液中包括IGF-I、2-50mg/ml渗压剂盐(如氯化钠)、1-15mg/ml防腐剂(如苯甲醇或苯酚)。国际专利申请第WO 97/07816号公开一种液体IGF-I制剂，该制剂于缓冲液中包括IGF-I和甘露醇。然而由于IGF-I和IGF/IGFBP-3之间显著的物理/化学性差异，没有理由希望IGF-I制剂适用于IGFBP-3。
应该注意到尽管IGFBP-3是含量最丰富的IGF结合蛋白(“IGFBP”)，但是在各种组织和体液中至少已确认5种其它显著不同的IGFBP。虽然这些蛋白质结合IGF，但是它们产生自不同的基因并具有不同的氨基酸序列。不象IGFBP-3，其它循环的IGFBP没有被IGF所饱和。IGFBP-3是仅有的能与IGF和ALS形成150kDa三元复合物的IGFBP。然而仍然建议其它一些IGFBP与IGF-I联合用作治疗剂。
然而尽管以与IGFBP-3的复合物给予IGF-I存在优势，但是关于药用制剂的公开几乎没有。Bagi等(J.Bone Mineral Res.9(8)：1301-1311，1994)公开将IGF-I/IGFBP-3给予切除卵巢的大鼠。用单一磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制IGF-I/IGFBP-3复合物。Celtrix Pharmaceuticals有限公司已公开用含有105mM氯化钠(NaCl)作为渗压剂盐的醋酸盐缓冲液(pH5.5)配制的IGF-I/IGFBP-3的用途。然而该制剂用作商业性药物制剂并不理想，因为它不允许冷冻干燥产品。
冷冻干燥(在控制条件下冷冻干燥)通常用于蛋白质的长期贮存。当处于冷冻干燥状态时，冷冻干燥的蛋白质对降解、聚集、氧化及其它变性过程具有相当的抵抗力。冷冻干燥蛋白质通常情况下用任选含有抑菌性防腐剂(如苯甲醇)的水重复制。遗憾的是许多防腐剂(如苯甲醇)与蛋白质不相容或至少降低其稳定性。然而当前推荐给24小时或更长时间给予的药物加入防腐剂，并且这一推荐可能成为在美国出售的药物的一个必要条件。
可接受的商业性冷冻干燥制药用制品必须形成一种可接受的“冻干饼(lyo cake)”(冻干的制品块)。最好是所述冻干饼具有光滑表面和均匀外观。很少将冷冻干燥蛋白质单独制成可接受的冻干饼，因此必须加入适当的增量剂。通常碳水化合物如甘露醇、山梨醇及蔗糖在冷冻干燥药用制品中用作增量剂。此外通常情况下加入缓冲剂，尤其是在如生长因子和细胞因子的蛋白质药物制剂中。因为蛋白质通常情况下对pH波动或极端pH尤其敏感，当制剂处于液体状态(如冷冻干燥之前和复制之后)时使用缓冲剂来控制该制剂的pH值。
因此在药学上可接受的制剂领域需要提供高稳定性IGF-I/IGFBP-3药物产品。
                        发明公开
本发明人创制的新的IGF-I/IGFBP-3制剂提供长期稳定的IGF-I/IGFBP-3复合物。本发明制剂是药学上可接受的制剂。
本发明人令人惊奇地发现具有非常低水平渗压剂盐的IGF-I/IGFBP-3复合物的药用制剂比加入高水平盐的制剂更稳定。另外，本发明人发现令人惊奇的意外结果，即不加入pH缓冲盐进一步提高IGF-I/IGFBP-3制剂的稳定性。
在更令人惊奇的意外发现中，本发明人发现具有高蛋白质浓度及具有低渗压剂盐且没有加入pH缓冲盐的IGF-I/IGFBP-3制剂具有高稳定性。
在一个实施方案中本发明制剂包含IGF-I/IGFBP-3复合物、增量剂以及pH缓冲盐。在该实施方案的制剂中没有外加的渗压剂盐。
在进一步的实施方案中，本发明制剂包括IGF-I/IGFBP-3复合物和增量剂。在此实施方案的制剂中没有加入渗压剂盐或pH缓冲盐。因其允许制备含很高蛋白质浓度的药物制剂，所以该实施方案制剂特别具有优势。
本发明制剂可以是液体制剂或冻干制剂。这些制剂也可任选包含非离子表面活性剂。液体制剂可任选包含防腐剂以减少或消除细菌生长。
                      附图简述
图1显示成熟的人IGFBP-3(Ala5)变异体的氨基酸序列(单字母氨基酸代码)。
                实施本发明的最佳模式
本发明人获得许多令人惊奇的意外发现，这些发现使得可以生产商业和药学上可接受的IGF/IGFBP稳定制剂。本发明人已发现惊人的意外的结果，即去除所加的渗压剂盐提高IGF-I/IGFBP-3制剂的稳定性。此外，更意外的是本发明者发现去除pH缓冲盐提高IGF-I/IGFBP-3制剂的稳定性。本发明者也惊奇地发现具有低水平渗压剂盐且没有外加pH缓冲盐的制剂在苯甲醇存在的情况下具有更高的稳定性，苯甲醇是一种普遍使用的、通常会促进蛋白质聚集的药用防腐剂。含或不含外加pH缓冲剂的具有低浓度渗压剂盐的制剂能用高浓度IGF-I/IGFBP复合物制得而没有大量蛋白质的丢失。
定义
“胰岛素样生长因子”或“IGF”包括各种因子家族，包括但不限于IGF-I和IGF-II。所述IGF是分子量约7.5kDa的多肽。IGF包括天然存在的IGF-I或IGF-II、其类似物或变异体(如其中IGF-I的一个或多个酪氨酸残基(即残基24、31或60)被非芳香族残基(即不是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)所取代的变异体)、其中氨基酸残基49、50、51、53、55和56改变的突变体(如残基49-51改变为Thr-Ser-Ile，或残基55-56改变为Tyr-Gln)以及IGF-I或IGF-II和其它氨基酸序列之间的融合物。IGF可得自天然资源或用重组方法制备。
本文使用的“胰岛素样生长因子结合蛋白”或“IGFBP”是胰岛素样生长因子结合蛋白家族，该家族包括但不限于IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、GFBP-5和GFBP-6。IGFBP可得自天然或重组资源。
“胰岛素样生长因子结合蛋白3”或“IGFBP-3”是指所述IGFBP家族成员之一。在人类该成熟蛋白是264个氨基酸，包括至少2种天然存在的等位变异蛋白，其中该成熟蛋白的第5个氨基酸残基是甘氨酸或丙氨酸(分别称为Gly5 IGFBP-3和Ala5 IGFBP-3)。当由人或其它哺乳动物细胞产生时，该蛋白质是通过在3个不同位点的多达3个N-连接糖基化进行翻译后修饰的。当在细菌中产生时，该蛋白未被糖基化。IGFBP-3也包括各种蛋白变异体如那些在正常N-连接糖基化氨基酸位点更改为另一种氨基酸(在整个说明书中序列变异将表示为X#Y，其中X是所述天然蛋白质中氨基酸残基的单字母氨基酸代码，#是所述成熟蛋白质序列中的残基号，而Y是该残基所变成的氨基酸)的变异体，尤其是天门冬氨酸如N89D；N109D；N172D；N89D，N109D，N89D，N172D；N109D，N172D；以及N89D，N109D，N172D变异体或N89X；N109X；N172X；N89X，N109X；N89X，N172X；N109X，N172X和N89X，N109X，N172X变异体。其它变异包括在116和135位的改变，在此处天然序列天冬氨酸改变为谷氨酸(如D116E、D135E和D116E、D135E)或改变为任何其它的氨基酸(如D116X、D135X和D116X、D135X)以及IGFBP-3核定位序列(NLS)的变异如K228E、R230G和K228E、R230G和/或在残基215、216和/或231上的改变。当然变异体IGFBP-3可能含有一个以上的变异(如一种变异体IGFBP-3可能包括抗水解变异以及NLS变异)。IGFBP-3可通过从天然资源纯化或在原核生物或真核生物宿主细胞中重组生产，虽然天然存在的等位变异蛋白之外的变异体最好用重组方法生产。
所述术语“增量剂”是指药物学上可接受并增加冻干饼体积的化合物。可接受的增量剂包括但不限于碳水化合物，例如单糖如右旋糖、核糖、果糖等，糖醇如甘露醇、肌醇及山梨糖醇，双糖包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然存在的聚合物如淀粉、右旋糖苷、壳聚糖、透明质酸盐、蛋白质(如明胶和血清白蛋白)和糖原，以及合成的单体和聚合物。用于本发明的增量剂最好也作为渗压剂盐(即有助于使液体形式的该制剂与正常人血清等渗)而起作用。
本文使用的术语“渗压剂盐”是指为辅助制剂变成与正常人血清等渗而加入的盐。渗压剂盐正常情况下是通常被认为给人使用是安全的化合物，它包括氯化钠、氯化钙、氯化钾等。药学上可接受的渗压剂盐通常可参见USP(美国药典，United States PharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，MD，1995)。
“防腐剂”是一种抑菌性、杀菌性、抑真菌或杀真菌性化合物，它可加入到本发明制剂中以阻止或消除该制剂中细菌或其它污染微生物的生长。该防腐剂应该是药学上可接受的且通常认为用于人类是安全的。用于本发明制剂中的防腐剂实例包括苯甲醇、苯酚、氯化苯甲烃铵、间甲酚、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等。药学上可接受的防腐剂通常可参见USP(同前)。对于液体制剂和复制冷冻干燥制剂，0.9-1％(v/v)的苯甲醇是最佳防腐剂。
本文使用的术语“非离子表面活性剂”是指减少水的表面张力的化合物。表面活性剂有时在许多方面有帮助，如减少蛋白质结合到贮存和给药装置上、减少形成蛋白质聚集以及在冻干制剂的复制中辅助蛋白质的再溶解作用。用于本发明的表面活性剂将不会促进蛋白质变性。适合用于本发明的表面活性剂实例包括但不局限于聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)。十二烷基聚(氧乙二醇醚)23(Brij 35)和辛基酚聚(乙二醇醚)10(TritonX-100)。通常适合用于本发明组合物的非离子表面活性剂可参见USP(同上)。
本文使用的与特定制剂有关的术语“稳定”是指所述制剂在特定条件下贮存特定时间后符合纯化的最低可接受标准。这意味着所述制剂中的IGF/IGFBP在普通贮存条件(即对于冷冻干燥制剂约为20℃，或对于液体制剂为冷藏、冷冻或20℃)下一年时间内聚集增加的百分点优选低于30，更优选低于15，所述聚集用尺寸排阻色谱法(用SEC分析所述物质，并以IGF/IGFBP主峰外的物质峰面积与总峰面积比值测量聚合百分数)进行测定。稳定制剂在普通贮存条件下一年时间内降解增长百分点也优选小于10，更优选5个百分点，所述降解用反相HPLC(所述材料用RP-HPLC分析并以IGF和IGFBP主峰外的物质峰面积与总峰面积的比值测量降解百分数)进行测量。
优选IGF包括野生型IGF-I(最优选重组人IGF-I，rhIGF-I)和变异体IGF，它可通过任何本领域已知的方法生产。最好是利用在国际专利申请第WO 94/04076号和第WO 96/40722号中公开的技术重组生产该rhIGF-I。优选IGFBP包括重组野生型人IGFBP-3，包括天然存在的等位变异体(尤其是野生型人IGFBP-3的Gly5和Ala5等位变异体)以及人IGFBP-3的变异体(如在89、109、116、135、172、228及230位点的变异体)。用于本发明的IGFBP可用任何本领域已知的方法生产，并且最好利用在国际专利申请第WO 94/04076号和第WO96/40722号中所公开的融合蛋白技术重组生产。
IGFI/IGFBP复合物的形成最好是通过IGF和IGFBP的单纯混合而实现。对于IGF-I和IGFBP-3的情况，该复合物不用任何进一步处理快速形成。如果有这样的需要，在复合物形成之后可进一步纯化该复合物。这种纯化可用任何本领域已知的技术来完成。
用于本发明制剂的IGF/IGFBP复合物最好具有小于5％的降解产物和小于15％的聚集物。
通常在包括pH缓冲盐和溶解的渗压剂盐(如NaCl)的水溶液中用IGF和IGFBP形成所述复合物。为形成本发明的所述制剂，必须从溶液中去除所溶解的盐及任选的pH缓冲盐。这可通过本领域已知的任何缓冲剂交换技术来实现，该技术包括但不限于渗滤、透析、逆向渗透及其它超滤技术和通过尺寸排阻色谱法脱盐来实现。该蛋白质溶液可直接交换入本发明的制剂中，或最好是将其交换入纯水中。如果该蛋白质溶液交换入纯水中，将所述制剂的其它组分加至该水/蛋白质溶液并充分混合。所述制剂的组分(如增量剂)可以干化学剂(为其中大多数增量剂和一些表面活性剂由生产厂家提供的形式)或以液体浓缩物加入。
本发明制剂不含外加的渗压剂盐。因为完全去除在IGF和IGFBP的生产和纯化期间所加入缓冲溶液中的盐几乎是不可能的，尤其是当所述制剂以工业方法生产时，该制剂不可能完全不含渗压剂盐。然而在本发明制剂中渗压剂盐浓度低，优选小于12.5mM，更优选小于2.5mM，最优选小于1mM。
在一个优选实施方案中，在pH缓冲液(即含能够缓冲pH变化的缓冲盐的溶液)中配制IGFI/GFBP复合物。该pH缓冲液优选pH约为5.0-7.0，更优选约5.5-6.5。所述IGF/IGFBP可被缓冲交换入水中，然后加入所需pH的pH缓冲盐的浓缩液或加入干性pH缓冲盐于该IGF/IGFBP溶液中。也可将该IGF/IGFBP直接缓冲交换入pH缓冲液中。最好将该IGF/IGFBP直接缓冲交换入pH缓冲液中。该缓冲盐可以是任何药学上可接受的缓冲盐如磷酸钠、磷酸钾、醋酸钠、柠檬酸钠和琥珀酸钠。优选缓冲盐是柠檬酸钠和琥珀酸钠，更优选琥珀酸钠。在稳定性检测实验中，本申请人惊奇地发现含有pH缓冲剂但缺少外加渗压剂盐的包含IGF-I/IGFBP-3的药物制剂比含有外加渗压剂盐的制剂更稳定。在更令人惊奇的结果中本申请人发现包含pH5.5的琥珀酸盐缓冲剂的制剂比含有柠檬酸盐和醋酸盐缓冲剂的制剂更稳定。
在本发明的另一个优选实施方案中，IGF/IGFBP复合物被缓冲交换入纯水中。必要时，可向IGF/IGFBP溶液中加入一种或多种增量剂以使其与正常人血清等渗。该增量剂最好是甘露醇、山梨醇、蔗糖、肌醇、乳糖、右旋糖或多种增量剂的混合物。在一个最佳实施方案中，该增量剂是甘露醇和蔗糖，并且所加增量剂总量达到6％(w/v)，甘露醇与蔗糖的最佳比例为3∶2(即3.6％(w/v)的甘露醇和约2.4％(w/v)的蔗糖)。还设计了制成低渗、冷冻干燥的制剂，然后用减量的水复制以获得蛋白质浓度增加的等渗制剂。例如，IGF-I/IGFBP-3复合物可在1.5％甘露醇、1％蔗糖中以蛋白质浓度为50mg/ml进行配制，冷冻干燥，然后复制至0.5倍原体积，获得100mg/ml的与人血清等渗的复制制剂。此实施方案的制剂中既未加入渗压剂盐也未加入缓冲盐。申请者惊奇地发现缺少任何外加pH缓冲剂或渗压剂盐的甘露醇和蔗糖中包含IGF-I/IGFBP-3的药物制剂比含有pH缓冲剂和渗压剂盐的制剂更稳定。此外，申请者发现此实施方案的制剂因为能制成含有非常高的蛋白浓度的制剂(见实施例5)而特别具有优势。
本发明的制剂可以液体制剂保存或将其冷冻干燥。液体制剂最好长期冷冻贮存。冷冻的液体制剂可贮存于超低温冰箱(即约低于-70℃)中、非除霜冰箱(即约-20℃)或除霜冰箱(即在约5℃和-15℃之间循环)。最好将液体制剂贮存于超低温冰箱中，但贮存于非除霜冰箱或除霜冰箱是可以接受的。
冷冻干燥的制剂首先制备成为液体，然后冷冻并冷冻干燥。该冷冻干燥工艺是本领域技术人员所熟知的，并且它包括在控制条件下使水从该冻干制剂中升华。冷冻干燥的制剂可冷藏贮存或在普通室温(如约20℃)下贮存。通过加入水溶液再溶解该制剂而复制冷冻干燥制剂备用。该复制溶液最好是水(如USP WFI或注射用水)或抑菌水(如含0.9％苯甲醇的USP WFI)，虽然也可以使用含有缓冲剂或其它赋形剂的溶液。水和抑菌水是优选的复制溶液。可向该复制溶液中加入其它防腐剂，包括苯酚(最好是约0.2-0.3％)、间甲酚(最好是约0.25-0.3％)、硫柳汞(最好是约0.25-0.3％)、对羟基苯甲酸甲酯(最好是约0.25-0.3％)、对羟基苯甲酸丙酯(最好是约0.25-0.3％)、氯丁醇(最好是约0.5％)等。
实施例
实施例1：pH缓冲剂的比较
将冷冻的重组人(rh)IGF-I/IGFBP-3(在50mM pH5.5的醋酸盐和105mM NaCl中浓度为10mg/ml)融化并分成3ml的样品。将一个样品在三个500ml pH5.5的20mM琥珀酸钠、3％山梨糖醇、2％蔗糖中进行透析。第二个样品在更换3次的500ml pH5.5的20mM柠檬酸钠、3％山梨糖醇、2％蔗糖中进行透析。完成透析后，将这些样品再调整至10mg/ml。将这些样品置于冷冻干燥器架上并使其在18℃平衡约10分钟，之后将温度降到5℃保持大约18分钟。在5℃平衡后将温度快速降到-15℃，在此温度下保持约12分钟，然后降至-35℃，在此时降低冷冻干燥器中的压力(200-300微米汞柱)并将样品冷冻干燥4个小时。该温度在6小时内升(在真空条件下)至20℃，然后于20℃(在真空条件下)再保持28小时。
将所述两个复制样品加上一个在pH5.5的50mM醋酸钠、105mM NaCl中的10mg/ml IGF-I/IGFBP-3的对照样品于37℃下孵育10天。在此10天结束时，肉眼检察这些样品，然后用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。使用以5％乙腈、0.1％三氟乙酸(TFA)上样的Vydac 4.6×250mm C18柱(5μm珠)，并用26％-34％梯度液洗脱40分钟以上而进行RP-HPLC分析。用Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱进行SEC分析，该柱在pH7.0的50mM磷酸钾、0.5M NaCl中以0.5ml/min的流速运行。在所述实验期间，将于-80℃下保存的在50mM pH5.5的醋酸盐和105mM NaCl中浓度为10mg/ml的rhIGF-I/IGFBP-3样品融化并用作对照。
通过测量IGF-I和IGFBP-3主峰外物质与所述总物质的比值(表示为降解百分数)，用RP-HPLC分析测量IGF-I和IGFBP-3的降解。在此试验中柠檬酸盐和琥珀酸盐缓冲剂大约相当，也与所述对照相当。醋酸盐缓冲剂(对照)有3.6％的降解，而柠檬酸盐和琥珀酸盐制剂分别是3.5％和4.1％。
SEC分析表明所述三个样品之间有很大的差异。SEC分析用来测量蛋白质聚集物的形成，它是通过比较样品中IGF-I/IGFBP-3主峰外物质与所述总物质而以聚集物百分数表示。所述对照具有6％最高聚集物水平，而柠檬酸盐为5％。琥珀酸盐令人惊奇地好于其它制剂，在37℃10天之后只有2.5％的聚集。
实施例2：含pH缓冲剂制剂的pH优化
将5ml 10mg/ml rhIGF-I/IGFBP-3样品在pH4.5、5.0、5.5、6.0或6.5的含3％甘露醇、2％蔗糖的20mM琥珀酸钠缓冲液(在24小时内更换三次500ml的此溶液)中透析。透析后通过测量OD276检测蛋白质浓度，并根据需要调节浓度使样品为10mg/ml。检测每个样品的pH，确保该pH在所要求pH±0.1pH点之内，然后如实施例1所述，将这些样品过滤除菌并冷冻干燥。复制后检测样品pH，然后再一次无菌过滤这些样品并将各等份样品在5℃和37℃放置10天。用RP-HPLC和SEC分析所述制剂的稳定性。
SEC分析表明聚集增加与pH升高有关。pH4.5的缓冲剂产生3.6％聚集率，pH5时为4％，pH5.5时为4.2％，而pH6和6.5的分别为5.3％和7.2％聚集率。
RP-HPLC分析表明相反的趋势，降解率的增加通常与pH的下降有关。pH4.5导致降解率最高(6.2％)，而pH5、5.5、6和6.5的结果分别为4％、3.8％、3.5％和4.2％。
基于这些结果，选择pH5.5作为含有pH缓冲剂制剂的最佳pH。
实施例3：含pH缓冲剂制剂的pH缓冲剂浓度优化
将5ml rhIGF-I/IGFBP-3样品于含有3％(w/v)甘露醇、2％(w/v)蔗糖以及各种浓度的琥珀酸钠pH5.5(0、5mM、10mM、20mM和40mM)溶液中进行透析。样品在更换三次的500ml缓冲液中透析48小时。透析后通过测量OD276检测蛋白质浓度，并根据需要调节浓度，使样品浓度为10mg/ml。检测每个样品的pH以保证该pH在所要求pH±0.1pH点之内，然后如实施例1中所述，将这些样品除菌过滤并冷冻干燥。复制后检测样品pH，然后将这些样品再一次除菌过滤并将各等份样品在5℃和37℃下放置10天。用RP-HPLC和SEC分析所述制剂的稳定性。
SEC分析表明聚集作用和琥珀酸盐缓冲液浓度呈正相关。40mM琥珀酸盐导致5.5％的聚集率，而20mM、10mM、5mM和0样品分别导致4.5％、3.6％、3.2％和2.4％的聚集率。
RP-HPLC分析表明关于降解率(3.5-4％降解率)，除5mM样品具有7.5％的降解率之外，所有样品都相当。降解率中这一“峰形”可能是由于对无论什么过程或酶参与IGFBP-3的降解都最适宜的盐。
这些结果表明没有外加pH缓冲剂的冷冻干燥制剂比有pH缓冲剂的制剂更稳定。
实施例4：含高浓度IGF-I/IGFBP-3的制剂
将30ml 10mg/ml的rhIGF-I/IGFBP-3溶液在3.6％(w/v)甘露醇、2.4％(w/v)蔗糖(制剂溶液)中完全透析，然后通过首先使用Amicon Centricon10离心超滤设备进行超滤浓缩溶液，用OD276检测该浓度，然后通过加入制剂溶液调节该浓度，从而将溶液浓缩至10、20和40mg/ml。如实施例1中所述，将10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml rhIGF-I/IGFBP-3样品制剂溶液冷冻干燥，然后用水或水加0.9％的苯甲醇复制并无菌过滤。将样品在37℃下放置7天，然后用RP-HPLC和SEC分析稳定性。分析结果见表1。
RP-HPLC分析表明增加蛋白质浓度对蛋白质降解的影响较小，而且苯甲醇的加入似乎并不影响降解。
SEC分析表明增加蛋白质浓度增加样品中的聚集水平。有趣的是，苯甲醇的加入在通常情况下增加蛋白质的聚集，尤其是IGF-I/IGFBP-3的聚集，但是苯甲醇的加入对在没有外加渗压剂盐或pH缓冲剂的甘露醇/蔗糖制剂中的聚集没有真正的影响。
                     表1
样品              降解率            聚集率
10mg/ml            1.4％              1.2％
10mg/ml+苯甲醇     1.2％              1.2％
20mg/ml            1.9％              2.1％
20mg/ml+苯甲醇     1.7％              2.1％
40mg/ml            1.9％              4.2％
40mg/ml+苯甲醇     1.3％              6.1％
使用浓缩至75mg/ml的rhIGF-I/IGFBP-3进行进一步实验。首先将该蛋白质在3.6％甘露醇/2.4％蔗糖中充分透析，然后使用带有截留10kDa过滤器的搅拌式细胞超滤装置进行浓缩。除菌过滤使该溶液无菌，如上所述冷冻干燥，然后复制。OD276分析该复制蛋白的浓度为75mg/ml。将含有及不含0.9％苯甲醇的样品在37℃下温育7天，然后用RP-HPLC和SEC进行分析(结果见下表2)。
极高蛋白质浓度引起蛋白质聚合的增加。有趣的是虽然在低蛋白质浓度苯甲醇对聚合或降解无影响，在这种非常高的蛋白浓度下苯甲醇的加入的确促进聚合但没有促进降解。
                       表2
样品              聚集率                降解率
75mg/ml            15％                   3.4％
75mg/ml+苯甲醇     27％                   3.0％
实施例5：含有非常高浓度IGF-I/IGFBP-3的制剂
将rhIGF-I/IGFBP-3在以下四种不同制剂之一中进行完全透析：(1)3.6％甘露醇、2.4％蔗糖；(2)1.5％甘露醇、1％蔗糖；(3)0.525％甘露醇、0.35％蔗糖；或(4)水。透析后使用搅拌式细胞浓缩器将该溶液浓缩至50mg/ml蛋白质浓度。
如实施例1中所述，将样品(1ml制剂1、2ml制剂2、4ml制剂3及10ml制剂4)转移至小瓶并冷冻干燥。设计不同制剂以获得标称浓度分别为50、100、200和500mg/ml(所计算的终浓度实际为49、96、187和495mg/ml)的rh IGF-I/IGFBP-3。将样品复制至每种净重为1g，并通过测量OD276确定蛋白质浓度，制剂4除外，它形成不能分析的稠糖浆。在Brij35(标准品，一种未被冷冻干燥的rh IGF-I/IGFBP-3样品，在此分析中以98.57％纯度分析)存在下用SEC测量纯度。结果见表3。
                           表3
制剂     标称浓度     预期浓度     测量浓度     SEC纯度
1         50mg/ml       49mg/ml       50mg/ml       98.29％
2         100mg/ml      96mg/ml       96mg/ml       98.31％
3         200mg/ml      187mg/ml      186mg/ml      97.57％
4         500mg/ml      495mg/ml      不可测量      不可测量
此外，在冷冻干燥前和复制后测量pH值。结果见表4。
                       表4
制剂    标称浓度      冷冻干燥前pH     复制后pH
1        50mg/ml        未测定             6.88
2        100mg/ml       6.91               6.87
3        200mg/ml       6.62               6.80
4        500mg/ml       6.60               未测定
在冷冻干燥前和复制后也用渗透压计测量重量克分子渗透浓度。血液、血浆及血清的正常实验室重量克分子渗透浓度值范围为280-296mOsm/kg(Merck Manual of Diagnosis and Therapy，R.Berkow编辑，第16版，第2581页，1992)。结果见表5。
                              表5
制剂        标称浓度       预期重量克分子渗   测量的重量克分子
                             透浓度             渗透浓度
1            50mg/ml         304mOsm/kg          309.5mOsm/kg
2            100mg/ml        293mOsm/kg          297mOsm/kg
3            200mg/ml        294mOsm/kg          290mOsm/kg
在第二次评估这些制剂中冷冻干燥蛋白质稳定性的实验中，如实施例1中所述，在制剂1、2或3中对rhIGF-I/IGFBP-3进行完全透析并冷冻干燥。冷冻干燥后将这些样品(a)复制为50、100或200mg/ml(“时间0”)或(b)在22℃或37℃下保存一个月(分别为22℃和37℃)，然后复制为50、100或200mg/ml的标称浓度。用SEC或RP-HPLC(如实施例1中所述)分析这些样品的纯度。将保存于-80℃的rhIGF-I/IGFBP-3用作对照。结果(SEC和RP-HPLC分别见表6和表7)表明在这些条件下制剂1、2和3是稳定的，但含有低浓度增量剂的制剂(如制剂3)由于des(Gly-Pro)IGF-I的形成稳定性稍差。
                                 表6
制剂     标称浓度   SEC纯度(％)   SEC纯度(％)     SEC纯度(％)
                      时间0         1个月22℃              1个月37℃
对照    10mg/ml       96.7           97.5*           97.5*
1       50mg/ml       未测定         97.9             97.5
2       100mg/ml      98.4           96.5             97.8
3       200mg/ml      98.3           98.3             97.3
*对照样品在温育期间保存在-80℃。
                                       表7
制剂  标识浓度  HPLC纯度(％)  HPLC纯度(％)    HPLC纯度(％)
                  时间0         1个月22℃              1个月37℃
对照   10mg/ml    99.3           99.6*           99.6*
1      50mg/ml    未测定         99.5             99.6
2      100mg/ml   99.4           99.4             99.6
3      200mg/ml   99.4           99.3             99.4
*对照样品在温育期间保持在-80℃。
在整个说明书中引用的所述专利、专利申请以及公开出版物通过引用整体结合到本文中。
通过直接描述和实施例详细描述了本发明。本发明的同等物和改进对本领域技术人员而言将是显而易见的，并包含于本发明范畴内。

Claims (25)

1.IGF-1和IGFBP-3复合物制剂，该制剂包含：
(a)IGF-1/IGFBP-3复合物，其中所述IGF-1为天然存在的IGF-1、其中至少一个酪氨酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的残基所取代的变异体，或者为其中至少一个残基49、50、51、53、55或56被改变的变异体，且所述IGFBP-3为天然存在的IGFBP-3、其中至少一个残基89、109或172的天冬酰胺被改变为天冬氨酸的变异体、其中至少一个位置116或135的天冬氨酸被改变为谷氨酸的变异体，或者其中至少一个残基228、230、215、216或231被改变的变异体；
(b)增量剂；以及
(c)pH缓冲剂盐，
其中所述制剂含有的渗压剂盐浓度低于12.5mM。
2.权利要求1的制剂，其中所述增量剂包括山梨醇。
3.权利要求1的制剂，其中所述增量剂包括甘露醇。
4.权利要求1的制剂，其中所述增量剂包括蔗糖。
5.权利要求1的制剂，其中所述增量剂包括甘露醇和蔗糖。
6.权利要求5的制剂，其中甘露醇与蔗糖的比例为3∶2。
7.权利要求1的制剂，其中所述pH缓冲剂盐包括琥珀酸钠。
8.权利要求7的制剂，其中所述pH缓冲剂盐浓度小于40mM。
9.权利要求7的制剂，其中所述pH缓冲剂盐浓度小于20mM。
10.权利要求7的制剂，其中所述pH缓冲剂盐浓度小于10mM。
11.权利要求1的制剂，其中所述制剂pH为5.5-6.5。
12.权利要求1的制剂，其中所述制剂还包含非离子表面活性剂。
13.权利要求1的制剂，其中所述制剂还包含防腐剂。
14.权利要求13的制剂，其中所述防腐剂是苯甲醇。
15.权利要求1的制剂，其中所述制剂为冷冻干燥制剂。
16.IGF-1和IGFBP-3复合物制剂，该制剂包含：
(a)IGF-1/IGFBP-3复合物，其中所述IGF-1为天然存在的IGF-1、其中至少一个酪氨酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的残基所取代的变异体，或者为其中至少一个残基49、50、51、53、55或56被改变的变异体，且所述IGFBP-3为天然存在的IGFBP-3、其中至少一个残基89、109或172的天冬酰胺被改变为天冬氨酸的变异体、其中至少一个位置116或135的天冬氨酸被改变为谷氨酸的变异体，或者其中至少一个残基228、230、215、216或231被改变的变异体；以及(b)增量剂；
其中所述制剂含有的渗压剂盐浓度低于12.5mM且不含有pH缓冲剂盐。
17.权利要求16的制剂，其中所述增量剂包括山梨醇。
18.权利要求16的制剂，其中所述增量剂包括甘露醇。
19.权利要求16的制剂，其中所述增量剂包括蔗糖。
20.权利要求16的制剂，其中所述增量剂包括甘露醇和蔗糖。
21.权利要求20的制剂，其中甘露醇与蔗糖的比例为3∶2。
22.权利要求16的制剂，其中所述制剂还包含非离子表面活性剂。
23.权利要求16的制剂，其中所述制剂还包含防腐剂。
24.权利要求23的制剂，其中所述防腐剂是苯甲醇。
25.权利要求16的制剂，其中所述制剂为冷冻干燥制剂。
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