CN1195866C - 蔗糖加工成葡萄糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从蔗糖制备商业量葡萄糖的方法，从蔗糖制备商业量葡萄糖和分支果聚糖的方法，所述方法使用的反应器。

Description

蔗糖加工成葡萄糖的方法
本发明的技术背景
本发明的技术领域
本发明涉及一种从蔗糖制备商业量葡萄糖的方法，和该方法所使用的反应器。更具体地说，本发明涉及从蔗糖制备葡萄糖的方法，该方法是通过蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶接触，随后分离葡萄糖和分支果聚糖，由此提高生产效率。
背景技术的描述
在自然界中发现，葡萄糖是以单糖存在或掺入多糖中的一种糖类，葡萄糖在临床上用作流体和营养补充物，微生物培养中用作碳源和广泛用作食品添加剂。
在商业上，葡萄糖通过从淀粉(Dean，Gottfried，Advan.Carbohyd，Chem.5，127(1950))和通过蔗糖的酸水解来制备。尽管制备葡萄糖的原料易得，但是相对于这种原料的成本，这种材料的费用较高。因此，葡萄糖的商业合成方法可以改进。
在整个自然界中存在果聚糖(Science and Technology of Fructans，1993ed.M.Suzuki and N.j.Chatterton，CRC Press，Inc.)。在植物中有四种果聚糖，它们是：1)菊糖，主要存在于双子叶植物如耶路撒冷菜蓟和菊苣根中的2，1-连接的果聚糖；2)左聚糖或猫尾草粉，在某些单子叶植物例如梯牧草中发现的2，6-连接的果聚糖；3)存在于单子叶植物如大麦、蓝色龙舌兰和小麦中的2，1-和2，6-分支果聚糖；和4)一系列新的果聚糖，在葡萄糖上2，1-和2，6-连接的果糖。葡萄糖是在这些分子的中间，不是在这些分子的末端。于是，两个末端果糖的果糖残基均以2，1-和2，6-方式与其它果糖连接，生产一个配合物结构(天冬)，许多植物产生这些葡糖的一种或一种以上。
据报导，在酵母和真菌中有2，1-连接的果聚糖。
已知，在细菌中有两种果聚糖：1)来自变异链球菌的菊糖2，1-果聚糖和2)来自枯草杆菌、发酵单胞菌和许多其它菌的左聚糖2，6-连接的果聚糖。
菊糖是由连接αD-葡糖苷的β-2，1-连接的果糖链组成；它们是直链结构，通常包括许多β-O-呋喃果糖单元。平均链长度和分子量分布将取决于植物的种类、生长期和制备方法。通常平均链长度为10-25，在这种情况下，各个单元有约9-24个果糖单元。
据报导，分支菊糖包括连接αD-葡糖苷的β-2，1-连接的果糖链的直链，在其上有分支的、β-2，6-果糖单元。据报导，这种分支菊糖已经从蓝色龙舌兰植物(G.O Aspinall and P.C.Das Gupta，Proceeding of theChemicai Society 1959 718-722 and M.N.Satyanarayana，Indian J.ofBiochem and Biophys.(1976)13：408-412)和大麦长叶(Simmen等人，Plant Physiol(1993)101：459-468)汁液中分离出来。
菊糖的性质随链长度和分支度变化。包括聚合度为约3-7果糖单元的短直链菊糖组合物已经用作降低卡值糖的替代物(DE4003140)。较长链的菊糖组合物已经用作脂肪模拟物，而分支的葡聚糖既可用作降低卡值糖的替代物也可用作脂肪模拟物。
Coussement等人的U.S.5659028号公开了一种分支果糖-低聚糖，它是由主要包括果糖单元和优选链长度为2-15个单元、并在其上连接一个或几个主要由果糖单元组成的铡链的链组成。
在葡萄糖生产的领域中，Nagle等人的U.S.4637835号报导了利用氯化钙催化剂和氢离子从α-纤维素制备葡萄糖和其它糖类的方法。
Mivawaki等人的U.S.5524075号报导了通过用酶糖化液化淀粉制备高纯葡萄糖。
Venkatasubramanian等人的U.S.4299677号报导了用离子交换膜从葡萄糖和果糖的混合物中直接分离葡萄糖和果糖的方法
Harada等人的U.S.5169679号报导了主要由β-2，1键合的、分子量为2,000-20,000,000组成的果聚糖作为食品添加剂的应用，例如在生产低卡值的食品中用作填充剂或脂肪替代物。
Kurz等人的U.S.5478732号报导了用水解酶处理粗品菊糖悬浮液得到中等链长(例如聚合度为10-12)菊糖的方法。在酶处理期间，短链组分降解成单糖和二糖，而长链菊糖被分离，然后转化成干的形态。
Adachi等人在U.S.4681771号中报导，当蔗糖(G-F)与有果糖转移活性的酶(下文称果糖基转移酶)接触时，得到包括葡萄糖、蔗糖、三糖(GF2)、四糖(GF3)和少量的果糖、五糖(GF4)和六糖(GF5)的低卡值低生龋齿增甜剂组合物。高直链菊糖的量戏剧性地减少，主要是菊糖GF2-3。
Kono等人的U.S.5314810号报导，用于与蔗糖反应的固定的果糖基转移酶的半衰期，通过将其载持在脱乙酰壳多糖衍生物或离子交换树脂之类的粒状载体上可以得到提高。据报导这种载持的酶可用于低生龋齿增甜剂组合物的工业生产。
Heady的U.S.4317880号报导，通过果糖基转移酶和葡萄糖异构酶制剂的共同作用，从蔗糖生产新的果糖聚合物和高果糖浆。
Catani等人在共同待审查的U.S.申请号09/019709号(1998.2.6申请)中报导了从蔗糖生产葡萄糖和/或果糖的方法。
但是，从蔗糖制备葡萄糖的现有技术的方法生产效率低，因此葡萄糖的商业量的生产仍需改进。
此外，需要有用于如直链和支链菊糖之类的多糖商业量的制备方法。
本发明的概述
本发明的目的是提供从蔗糖制备商业量葡萄糖的方法。
本发明的第二个目的是提供从蔗糖制备商业量的葡萄糖和支链果聚糖的方法。
本发明的上述目的也可以通过用于制备葡萄糖的一种方法实现，即在一反应器中使蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶接触，产生包括葡萄糖和分支果聚糖的反应产物，随后分离葡萄糖和分支果聚糖。
在另一方案中，通过在反应器中，首先使蔗糖与伸长链的β-2，1-果糖基转移酶接触，然后与分支β-2，6-果糖基转移酶接触，产生包括葡萄糖和分支果聚糖的反应产物，完成了葡萄糖的制备过程，在这个方案中，蔗糖几乎耗尽。
在一定程度上来说，本发明是基于组合使用果糖基转移酶可从蔗糖(G-F)高效率地制备葡萄糖这一发现。此外，在通过蔗糖与两种果糖基转移酶反应生成葡萄糖期间所产生的分支果聚糖可以商业量进行分离，这进一步提高了本发明方法的经济性。
附图简述
结合附图参考下面的详细描述时，就可以更充分地理解本发明和明确本发明的许多优点，其中：
图1描述蔗糖转化成葡萄糖和分支果聚糖的流程图；
图1a描述在设置葡萄糖外分离器的一反应器中，蔗糖转化成葡萄糖和分支果聚糖的流程图；
图2描述在两个反应器中，蔗糖转化成葡萄糖和分支果聚糖的流程图；
图2a描述在两个反应器中，蔗糖转化成葡萄糖和分支果聚糖的流程图，每个反应器设置葡萄糖外分离器。
优选实施方案的详细描述
葡萄糖是商业的主要商品，用于制药和食品。在食品应用中，分支菊糖果聚糖像非分支果聚糖那样，在器官感觉试验方面具有良好的性能并具有与蔗糖相似的填充特性，但是在消耗时，不产生过量气体。在食品应用中，分支果聚糖也具有良好地填充性。
在本文中，术语“β-2，1-果糖基转移酶”指的是能够从作为给予体的蔗糖把果糖基转移到作为受体的蔗糖或其它的糖(例如果聚糖)并生成β-2，1键的任一种酶或任意的几种酶。果糖单元优选以呋喃糖形态转移。此外，优选β-2，1-果糖基转移酶选择作为受体的呋喃糖形态的果糖。在植物中，通过蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)和果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)特别地提供这些酶活性(参见Pollock等人AnnuRev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.42，77-101(1991))。从变异链球菌分离出的β-2，1-连接的果糖基转移酶显示出了向蔗糖和果聚糖转移果糖的活性。蔗糖的果糖基转移的结果产生了葡萄糖单元。β-2，1-果糖基转移酶可以把果糖转移到末端果糖的C1位置(例如形成直链伸长)，或转移到直链果聚糖的C1位置(例如β-2，6连接的-果聚糖)形成支链点。一些果糖基转移酶具有两种活性(例如使链伸长和分支)，但是，一些果糖基转移酶只有一种活性。选择适宜的链伸长和/或分支果糖基转移酶是本技术领域内的技术人员所周知的。
适宜的β-2，1-果糖基转移酶的非限制性实例可由下列微生物获得：曲霉菌属如米曲霉ATCC20498；短柄曲霉ATCC20524；泡盛曲霉、萨氏曲霉和黑色曲霉ATCC20611；青霉菌属如詹司克氏青霉ATCC10115和26546；变黑青霉；娄格法尔特氏青霉；镰孢菌属如亚麻镰孢IAM5011和短柄霉属如出芽短柄霉ACTT9348；变异链球菌ATCC25175；和出芽短柄变性黑霉A-8ATCC20612。适宜的霉还可以从酵母和其它微生物得到，例如酵母菌属如酿酒酵母；红酵母菌属如R.lutinis；毕赤酵母菌属如豆酱毕赤酵母；汉逊氏酵母菌属如豆酱汉逊氏酵母；伽丝酵母菌属如热带伽丝酵母并且从高等植物如天冬、大丽菊块茎、菊苣根和耶路撒冷菜蓟中获得，如JP-A-56-154967号和JP-B-59-53834号所述。
一种特别优选的霉是一种细菌的β-2，1-果糖基转移酶，它可以从变异链球菌分离的基因中得到。特别是，变异链球菌ATCC25175可以是果糖基转移酶基因源。当与异质蛋白质序列融合构成时，可以得到果糖基转移酶。例如，适宜的融合蛋白质是从变异链球菌分离出来的融合到谷光甘肽-S-转移酶C-末端的果糖基转移酶。
变异链球菌果糖基转移酶的编码序列，缺乏预定信号的序列，通过可用于形成表达果糖基转移酶融合蛋白的转化细胞的PCR，从变异链球菌菌株ATCC25175分离出来。Shiroza，T.和Kuramitsu，H.K.(J.Bacteriol.，170，810-816(1998))报导了从变异链球菌菌株GS-5分离出来的另一种适宜的果糖基转移酶基因序列。
在本文中，术语“β-2，6-果糖基转移酶”(也称为果聚糖合成酶)指的是能够把作为给予体的蔗糖的果糖基转移到作为受体形成β-2，6键的蔗糖或另一种糖(如果聚糖)的任一种酶或任意几种酶.果糖单元优选以呋喃糖形态转移。此外，优选β-2，1-果糖基转移酶选择作为受体的呋喃糖形态的果糖。这特别地描述了蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)(参见Sprenger等人Proc.Natl Acad.Sci.USA，92，11652-11656(1995))和果聚糖：果聚糖6G-果糖基转移酶(6G-FFT)(参见Viin等人，植物杂志(1997)11(3)387-398)。在β-2，6-果糖基转移酶的作用下，蔗糖的果糖基转移的结果产生葡萄糖单元。β-2，6-果糖基转移酶可以把果糖转移到末端果糖的C6位置(例如形成直链伸长)，或转移到形成分支(例如，β-2，1连接的菊糖)的直链果聚糖的C6位置。一些果糖基转移酶具有两种活性(例如链伸长和分支)，但是一些果糖基转移酶只有一种活性。适宜的链伸长和/或分支果糖基转移酶的选择是本领域内的技术人员公知的。
适宜的β-2，6-果糖基转移酶可以从大麦长叶和青草之类的植物源中得到。Simmen等人(Plant Physiol.(1993)101：459-468)和Duchateau等人(Plant Physiol.(1995)107：1249-1255)描述了从大麦长叶得到的这种β-2，6-果糖基转移酶。有β-2，6-果糖基转移酶活性的果聚糖蔗糖酶也是从枯草杆菌(ATCC6051)和发酵单胞菌中得到。Sprenger等人描述了大麦蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶的纯化、克隆和表达(Proc.Natl，Acad.Sci.，USA Vol.92，pp.11652-11656(1995)和FEBS Lett 1997 Jan 6：400(3)：355-8)。
本发明方法是将蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶的反应，但是，使用其它的葡萄糖基转移酶，包括不干扰与β-2，1-果糖基转移酶反应，或与β-2，6-果糖基转移酶的反应的其它果糖基转移酶也在本发明的范围内。
下面描述的果糖基转移酶主要适用于β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶。
如U.S.5314810号所述，果糖基转移酶可以固定在带伯-季胺的载体上。
在一优选的方案中，果糖基转移酶至少是部分纯化的。本文中所使用的术语“纯化的”意指从自然界产生的宿主生物中已被纯化或至少部分被纯化的酶。纯化优选产生至少部分除去了将降解果聚糖的降解酶如菊糖酶和可降解果糖基转移酶的蛋白酶。酶优选纯化到不存在降解酶的程度。当酶源是转染的大肠杆菌微生物，而转染的大肠杆菌微生物没有天然降解酶时，可以使用原细胞溶胞产物。
在一优选的方案中，每一种纯化的果糖基转移酶具有合成与降解活性比为≥1000-1，优选为1500-1，更优选为≥2000-1(例如，对果聚糖键的每一个开裂来说，优选形成至少1000个键的果糖)。一个单位等于每分钟把1μmol单糖转移为受体时，原黑色曲霉生长的上清液含约90单元/毫克蛋白质，制备的DEAE-纯化的黑色曲霉制剂有约2000单位/毫克蛋白质。10μgDEAE纯化过的黑色曲霉制剂在50℃约一天时间具有把一升50％蔗糖完全转化成葡萄糖和直链果聚糖的足够活性。另外，可以连续操作制备同样的霉，在50℃至少两周效率不会下降，且蔗糖连续地添加。
每一种果糖基转移酶可纯化到活性为90-3000U/mg，优选为100-2000U/mg。在一优选的方案中，每一种果糖基转移酶的活性为≥100U/mg，优选为≥150U/mg，更优选为≥200U/mg。
第三种果糖基转移酶是把果糖转移到葡萄糖的C6羟基的2，6-G-果糖基转移酶。这种2，6-G-果糖基转移酶优选使用蔗糖作为果糖给予体。适宜的2，6-G-果糖基转移酶是通过本技术领域内的技术人员公知的方法从天然物源分离出来的。适宜物源的非限制性实例是洋葱、天冬和所有的紫色植物。
当直链β-2，1-链伸长的果糖基转移酶和β-2，6-链伸长的果糖基转移酶一起使用时，可以生成包括β-2，1和β-2，6-链的星状果聚糖。这种化合物可用作多价载体，食品填充剂和交粘剂或聚合物的芯。
本发明方法所用的原料是蔗糖或含蔗糖的组合物。蔗糖是指从任意的蔗糖原料例如糖甘蔗或糖甜菜精制或原状的溶液或干的二糖。在蔗糖原料中含蔗糖的量≥10重量％，优选为≥20重量％，更优选为≥50重量％，最优选为≥70重量％。原料可以包含其它的物料，只要它们不显著地干扰蔗糖转化成葡萄糖就行(例如1-蔗果三糖(G1-2F1-2F))。
蔗糖可以上述的任意形态加入。但是，为了保持反应介质总的离子强度和浓度，蔗糖以干态或溶液连续或间断地加入。加到反应混合物中的蔗糖的速率和频率是使低聚糖保持高的生产速率，并在一定程度上取决于果糖基转移酶的特性和具体活性、反应温度和葡萄糖与果聚糖的排除速率。通过常规的试验可以完成蔗糖加入的最佳速率和频率的测定，这是本技术领域内的普通技术人员已知的。
本发明的方法优选在水溶液中进行。
在反应介质中蔗糖的浓度没有特别地限制，可为50mM至饱和。按重量百分数计，反应溶液中的蔗糖量可为1-80重量％，以反应混合物的总重量计，通常为40-80％重量/重量，优选为50-70％重量/重量，更优选为60％重量/重量。
分支果聚糖结构随所选定的反应条件而改变。在本发明的范围内，可以生成包括两种基本键的分支果聚糖：1)果糖：果糖连接的β-2，1-；和2)果糖：果糖连接的β-2，6-。具体的分支果聚糖结构包括1)带β-2，6-支链的直链β-2，1-菊糖；2)带β-2，1-支链的直链β-2，6-果聚糖；3)带含β-2，1-支链的β-2，6-支链的直链β-2，1-菊糖；和4)带含β-2，6-支链的β-2，1-支链的直链β-2，6-果聚糖。分支点添加到本身是分支点的任意直链可以继续。本领域技术人员将会理解，果聚糖可包括由于果糖开始转移到蔗糖而产生的葡萄糖单元。
在一个实施方案中，包括β-2，1-键的直链菊糖果聚糖是在链伸长的β-2，1-果糖基转移酶作用下生成的，随后在分支β-2，6-果糖基转移酶作用下与果糖单元分支。蔗糖是用于两种果糖基转移酶的果糖给予体。蔗糖和果聚糖的末端果糖是β-2，1-果糖基转移酶的受体，而直链果聚糖链是β-2，6-果糖基转移酶的受体。包括β-2，1-键的直链菊糖果聚糖可以在一个或一个以上的步骤中生成，利用一个步骤的方法有利于低DP的菊糖链的更大量的生成，使用一个以上步骤的方法有利于较少量的但是较长菊糖链(例如较高的DPs)产生。为了生成较长的菊糖链，在用一部分被转化的蔗糖形成果聚糖后，再加入剩余的蔗糖。生成伸长链果聚糖(例如较高的DPs)的这种方法已被Catani等人在共同待审查的U.S.申请号09/019709(1998.2.6申请)中公开，其全部内容引入本文供参考。
在另一实施方案中，包括β-2，6-键的直链果聚糖是在β-2，6-果糖基转移酶的作用下生成的，随后在β-2，1-果糖基转移酶的作用下与果糖单元分支。蔗糖是两种果糖基转移酶的果糖给予体。蔗糖和果聚糖的末端果糖是β-2，6-果糖基转移酶的受体，而直链果聚糖链是β-2，1-果糖基转移酶的受体。包括β-2，6-键的直链果聚糖可在一个或一个以上步骤的方法中生成，使用一个步骤的方法有利于低DP的果聚糖链较大量的生成，使用一个以上步骤的方法有利于较长的果聚糖链(例如较高DPs)较少量的生成。为了生成较长的果聚糖链，先用一部分被转化的蔗糖生成果聚糖，再加入其余部分的蔗糖。生成伸长直链果聚糖的这种方法如制备伸长直链果聚糖的方法所述。
包括含分支果糖单元连接的β-2，1-的β-2，6键的直链果聚糖可用作食品添加剂和食品增甜剂。这种果聚糖一般有包括2-15个，优选3-10个，更优选4-7个果糖单元的直链果聚糖骨架，这些果糖单元是以β-2，6-键连接葡萄糖。附加在其上的将是以β-2，1-键连接的一个或一个以上的形成分支的果糖单元。分支可随机地存在于直链果聚糖骨架上。这种果聚糖的分子量为约700-3600gms/mol。每个分支本身可是伸长的链。
在另一实施方案中，β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶对蔗糖同时作用产生了包括β-2，1和β-2，6键的支链和直链的果聚糖。每种果糖基转移酶均使用作为果糖给体的蔗糖并使用作为受体的蔗糖和/或果聚糖。此外，每种果糖基转移酶可为直链或支链。
在另一实施方案中，直链菊糖或直链果聚糖在β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶的作用下分支。每种果糖基转移酶使用蔗糖作为果糖给予体并使用果聚糖作为受体。此外，每种果糖基转移酶可为直链或支链。
上述果聚糖的每一种通过使用果聚糖作为受体和优选使用蔗糖作为葡萄糖给予体的葡萄糖基转移酶的作用进一步加工成包括一个或一个以上的葡萄糖单元。
生成分支果聚糖的一个优点是相对于只生成直链果聚糖来说提高了葡萄糖的生成效率，这是因为从蔗糖生成的分支基团将产生葡萄糖单元的缘故。当从蔗糖生成直链果聚糖时，果糖首先与蔗糖键合，消耗了两个单元蔗糖的反应将只产生一个单元的葡萄糖。就此而论，从蔗糖合成分支果聚糖就提供合成葡萄糖的高效方法。
蔗糖与果糖基转移酶的反应可在一定温度范围内进行。反应温度可为室温，即18-25℃，直到刚低于果糖基转移酶开始快速失活的温度。优选的温度范围是25-60℃。反应更优选在35-55℃下进行。反应最优选在30-50℃下进行。
反应水溶液适宜的PH值不用缓冲或使用众所周知的缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸盐和TRIS缓冲剂缓冲。当反应是在延长的时间期间如两周时间进行时，优选使用缓冲剂。
蔗糖与果糖基转移酶反应进行时间应足以长到产生商业量的葡萄糖。反应时间可为2-48天，取决于一批生产量的大小。当以连续方式进行反应时，在2-4周的期间内，10毫升体积的反应物以2.5克/时的速率反应而不明显地损失活性。
蔗糖与果糖基转移酶反应的PH值没有特别地限制，反应最佳的PH值取决于所使用的具体地酶。通常PH值为4.0-8.0，优选为5.0-7.5，更优选为约6.0。
本发明的方法可以间歇方式进行，也可以连续方式进行。连续反应可通过超滤装置循环反应物，因此产物可以从超滤器作为透过物连续地排出，转移酶含在超滤器的滞留物中。如果需要，可以加入新鲜基质和新鲜酶，置换已经失活的基质和酶，以与从超滤器排出透过物相同的速率加入反应混合物。
蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶的反应可以在管式反应器中进行。
管式反应器一般包括一长的管件、移动反应物流通过管的泵、反应物的入口和反应产物的出口。
管式反应器可用本技术领域内技术人员已知的传统反应器的材料来制造。例如，管式反应器可用不锈钢、衬玻璃的不锈钢或高密度聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或聚酯的聚合物来制造。在一优选的方案中，管式反应器是用聚氯乙烯制造。
管式反应器一般为管状，其长度和直径随具体进行的反应而改变。通常，管的内径为1-24，优选为4-20，更优选为6-10。
泵使管式反应器内的物料沿反应器的长度方向移动。本领域内的普通技术人员已知的传统的泵都可使用。适宜泵的非限制性实例是：
通常，泵将提供足以保持0.1-2ft/秒，优选0.2-1ft/秒，更优选0.3-0.7ft/秒流率的力。泵优选产生固体活塞流作用的流动。
管式反应器的入口没有特别地限制，可简单地包括加入反应物料的一个口，或作为初始加料用或作为在反应器的运行过程期间的连续加料用。反应物通过重力或通过泵计量进入反应器。反应物以固态如粉末或在适宜溶剂中的溶液加入。
如上所述，反应器也可以在沿反应器长度方向，在初始入口的下游设置其它的入口。这些入口可以用作沿反应物流的不同点处加入其它的反应物。
反应产物的出口没有特别地限制，可以为从反应器物流中直接排出反应器全部物料的形式，或提供从反应器物流中选择排出反应产物的形式。反应产物的选择排出可是一个按大小排除的过滤器。
反应器的长度随具体反应和通过反应器的流速及温度之类的反应条件而变化。
反应器也可以设置加热器或冷却器之类的温度控制系统。调节温度的能力优选在整个反应器长度保持不同温度的区域。
在一个方案中，蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶在管式反应器的第一部分区域反应，随后在下游区域与β-2，6-果糖基转移酶反应。在与β-2，6-果糖基转移酶反应前，β-2，1-果糖基转移酶可通过加热一足够长的时间和温度失活，在约一分钟内，所述的温度通常为约65-95℃，优选为约75-90℃，更优选为约85℃。供选择地，失活区域可包括从管式反应器的物流中除去生物催化剂的区域，例如是经一大小截留膜或相似物区域。失活也可通过引入使生物催化活性失活的生物催化剂自杀底物来实现。果糖基转移酶优选通过加热失活作用失活。
可具体使用以果聚糖作为受体的具有β-2，6-果糖基转移酶活性的果聚糖酶是使用枯草杆菌(ATCC6051)表达得到的，它在菊糖链与果糖的β-2，6-键的形成中有效地利用蔗糖。这种果糖基转移酶通过本领域内技术人员已知的传统方法得到。当蔗糖有效地反应时，简化了从残留蔗糖中分离葡萄糖的问题。
在一优选的方案中，如果可能，β-2，6-果糖基转移酶作用后的蔗糖浓度≤20重量％，优选≤10重量％，更优选≤5重量％，最优选≤1重量％。
反应也可以在一个反应器或串联的几个反应器中进行，反应器可以设置适宜的反应物入口和产物的出口。出口可以选择性地排出具体地产物。通过设置排出产物和将其它物料返回反应器的适宜的分离器可得到选择性。分离器可为膜式或色谱柱。在某些情况下，分离器可包括提供选择性除去所要求产物的一组膜和/或色谱柱。
在反应产生葡萄糖之后，通过在10-15分钟内加热反应混合物到约100℃使果糖基转移酶失活。如果需要，在利用通过适宜尺寸的过滤器超滤之前或之后，酶可以从反应混合物中除去。
通常，在β-O-呋喃果糖中，果聚糖有果糖单元的生成β-2，1-键的直链骨架，。β-O-呋喃果糖单元的数量一般为4-20，优选4-15，更优选为4-8。接枝到直链果聚糖骨架上将是以β-2，6-键连接到骨架上的一个或几个β-O-呋喃果糖单元。但是，在骨架上接枝的果糖单元的数量和密度一般是变化的，平均计，每5个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，优选为每4个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，更优选为每3个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，最优选为每2个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖。这些比率仅提供在直链骨架上的支化点的数量。
在另一个方案中，分支的果聚糖在带β-2，1-键连接到的β-O-呋喃果糖单元的分支果糖上链可以伸长分支果糖单元，提供似梳结构的分支果聚糖结构。以β-2，1-键连接到分支果糖上的β-O-呋喃果糖单元的数量随反应条件而变化，通常为2-20，优选为2-10，更优选为2-8。果糖单元是附加到各个分支果糖单元上。对每个分支果糖单元不必要有相同数量的伸长链的果糖单元。术语梳状聚合物是聚合物化学领域内众所周知的化合物，因此，本文中所述的分支果聚糖的结构对本领域内的普通技术人员来说是清楚的。
在各个接枝在直链β-2，1-连接的果聚糖上的梳状链上生成支链和伸长链的支链也在本发明的范围内。但是，接枝在各个梳状链上的果糖单元的数量和密度可以变化，按平均计，通常为每5个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，优选为每4个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，更优选为每3个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖，最优选为每2个β-2，1-线性连接果糖单元，有至少1个接枝果糖。这些比率仅提供在梳状直链上的分支的数量。在梳状链上β-2，1-连接分支果糖的β-O-呋喃果糖单元的数量随反应条件而变化，通常为2-20，优选为2-10，更优选为2-8。果糖单元将附加在各个分支果糖单元上。每个分支果糖单元不必须有相同数量的伸长链的果糖单元。
为详细说明的目的，提供使用至少一种β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶从蔗糖制备葡萄糖的具体细节。
在一反应器中，蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶进行反应。该反应器可包括一蔗糖的入口和葡萄糖的出口。随着聚合度的增加，葡萄糖的浓度也增加，因此可能降低生成葡萄糖反应的速率。所以，在一优选的方案中，在反应期间，从反应介质中除去葡萄糖。通过本技术领域内的技术人员已知的传统方法如通过膜过滤或色谱法除去葡萄糖。在本发明的范围内，色谱法包括本领域内的技术人员已知的离子交换法和凝胶排阻色谱法。
可以使用泵提高对膜或色谱柱的压力。在一个优选的方案中，葡萄糖的出口包括一允许葡萄糖从反应介质流过，不允许蔗糖、果聚糖或果糖基转移酶通过的膜。
然后，加入β-2，6-果糖基转移酶，当其与蔗糖反应时，提供了直链的分支。
葡萄糖可以连续地、分批地或半分批地除去，但是，在一优选的方案中，葡萄糖是连续地从反应介质中除去。
通过本领域内的技术人员已知的传统方法，例如通过过滤以及也可以通过结晶的方法来分离和纯化葡萄糖。
在一优选的方案中，果聚糖也可以从反应混合物中除去，优选从反应混合物中连续地除去果聚糖。果聚糖也可以通过本技术领域内技术人员已知的传统方法，例如，通过离子交换法或凝胶排阻色谱法除去。在一优选的方案中，果聚糖的出口包括允许果聚糖从反应介质中流过而不允许蔗糖、葡萄糖或果糖基转移酶通过的膜。供选择地，果聚糖可以从反应介质中分离，而蔗糖和葡萄糖返回反应混合物中。
在一优选的方案中，所产生的果聚糖的量，以蔗糖起始重量计，为≥10重量％，优选为≥20重量％，更优选为≥30重量％，再优选为≥40重量％并且最优选为≥50重量％。
在一优选的方案中，所产生的葡萄糖的产率，以蔗糖的反应重量计，为25-50重量％，优选为≥25重量％，优选为≥33重量％，更优选为≥37重量％，更优选为≥40重量％，和最优选为≥50重量％。
在本发明的范围内，商业量的定义是葡萄糖产生的速率为103-105kg/天，优选为≥1000kg/天、≥2000kg/天，更优选为≥5000kg/天。此外，商业量的生产速率是相对于蔗糖原料而言的。所以上述识别的生产速率是基于6000kg的单位处理量而言。因此，术语“商业量”不是指绝对量而言，而是商业上可接受的生产速率。
为了提高葡萄糖的生产效率，在链分批伸长的一优选的方案中，每批将包括在先反应产物的20-25重量％。因此，在起始一批链伸长完成后，除去了75-80重量％的反应物，剩余的20-25重量％的反应物保留，用于第二批链伸长的反应物。所以第一反应产物的20-25重量％与蔗糖和β-2，1-果糖基转移酶一起加入反应器。在这种情况下，从蔗糖用β-2，1-果糖基转移酶转移的果糖以较高的浓度存在，其结果有利于较多的附加果聚糖而不是三糖(F-F-G)的生成。由于较多的果聚糖产生更有效地产生了葡萄糖，所以这就提供了生成葡萄糖更有效的方法。
在另一个优选的方案中，如果需要，通过从链伸长(β-2，1-果糖基转移酶)或分支(β-2，6-果糖基转移酶)的产物中回收未反应的蔗糖可以进一步提高该方法的效率。通常，果糖基转移酶与蔗糖的作用将产生包括葡萄糖、未反应的蔗糖、果聚糖和果糖的反应混合物。未反应蔗糖的除去并作为果糖基转移酶原料的循环大大地提高了葡萄糖的生产效率。
例如，可通过本领域内的技术人员已知的传统的色谱技术除去蔗糖。作为一个具体的实例，可以利用模拟的移动床技术分离葡萄糖、较高级的果聚糖(DPs和更高级的)和蔗糖。通常，蔗糖部分进一步包括较低级的果聚糖DP3和DP4及葡萄糖，所有这些都可返回到果糖基转移酶反应中，提高葡萄糖的生产效率。
通常，模拟移动床技术将使用阴离子交换树脂的盐如交联度为4-6％的苯乙烯-二乙烯基苯磺酸树脂的钠盐作为载体。当树脂的交联度高于6％时，分离效率降低。当树脂的交联度低于4％时，树脂的机械规整度差。适宜的树脂是商购于Dow化学品公司商品名为DOWEX离子交换树脂。
葡萄糖的分离可以通过使用本技术领域技术人员已知的传统中空纤维型膜的大小排阻技术来完成。将商购的大小排阻膜G10和G5顺序组合提供葡萄糖和包括可循环到反应器的蔗糖与低级果聚糖部分的有效分离。
下面参考图1，其中1表示一反应器，2表示蔗糖的入口，3表示葡萄糖的出口，4表示果聚糖的出口和5表示可透过葡萄糖，但是不能够透过蔗糖、果糖基转移酶或果聚糖的一分离器。蔗糖经入口2加入反应器到含β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶的反应器1部分。在这样的一种构型中，产生果聚糖的那部分是集中在该分离器的一侧。反应器设置位于分离器5的葡萄糖侧的葡萄糖出口3。果聚糖的出口4可以设置一允许果聚糖通过但是不允许蔗糖、果萄糖或果糖基转移酶通过的一分离器(末示出)。如果使用膜系统分离果聚糖，该膜通常允许葡萄糖和蔗糖通过，但是不允许分支果聚糖通过。所以，果聚糖被有效地分离。
现在参考图1a，其中1表示反应器，1a表示分离器部分，2表示蔗糖入口，3表示葡萄糖出口，4表示果聚糖出口和5表示葡萄糖的一分离器。蔗糖经入口2加入反应器到含β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶的反应器1的1a部分。在这样的一种构型中，葡萄糖在经出口3排出之前，通过分离器5从介质中分离。在葡萄糖分离过程中，剩余的物料可以循环到反应器的1a部分。果聚糖的出口4可以设置一允许果聚糖通过，但是不允许蔗糖、葡萄糖或果糖基转移酶通过的分离器。
在另一方案中，反应器包括蔗糖入口设置一从蔗糖中分离葡萄糖和果聚糖两者的外分离器。如果需要，未反应的蔗糖可以返回到反应器中。
现在参考图2，其中1表示第一反应器，2和11表示蔗糖的入口，3和8表示葡萄糖的出口，4表示直链果聚糖的出口，5和10表示允许葡萄糖通过，但是不允许蔗糖、果糖基转移酶或较高果聚糖通过的分离器，6表示第二反应器，7表示直链果聚糖的入口和9表示支链果聚糖的出口。所使用的两个反应器用允许葡萄糖透过，但是不允许蔗糖、果糖基转移酶或直(支)链果聚糖通过的分离器5和10分隔开。在第一反应器1中，蔗糖的浓度是提供合成直链β-2，1-菊糖果聚糖的浓度，产物然后经直链果聚糖的入口7被转移到第二反应器6中。在一优选的方案中，直链果聚糖的出口4或直链果聚糖的入口7不允许活性果糖基转移酶通过。这可以通过设置带不允许果糖基转移酶通过的膜的出口4或入口7实现。供选择地，出口4或入口7可以设置使果糖基转移酶失活的区域，例如通过加热足够长时间和温度，一般在约1分钟内，加热为约65-95℃，优选为约70-90℃，更优选为约85℃。在第二反应器6中，第二反应器6的一部分中含β-2，6-果糖基转移酶和直链果聚糖与蔗糖反应。葡萄糖允许通过分离器10，并经葡萄糖出口8排出。在葡萄糖分离过程中，剩余的物料可以循环到第二反应器6中。分支果聚糖经分支果聚糖出口9排出。分支果聚糖出口9可以设置允许分支果聚糖通过，但是不允许蔗糖、葡萄糖或果糖基转移酶通过的分离器(未示出)。
现在参考图2a，其中1表示第一反应器，1a表示分离反应器部分，2和11表示蔗糖入口，3和8表示葡萄糖出口，4表示直链果聚糖出口，5和10表示允许葡萄糖通过，但是不允许蔗糖、果糖基转移酶或直(支)链果聚糖通过的外分离器，6表示第二反应器，6a表示分离反应器部分，7表示直链葡聚糖的入口和9表示支链果聚糖的出口。所使用的两个反应器，设置允许葡萄糖通过，但是不允许蔗糖、果糖基转移酶或直(支)链果聚糖通过的外分离器5和10。在第一分离器部分1a中，提供合成直链果聚糖，β-2，1键的蔗糖浓度，产物然后经直链果聚糖的入口7转移到第二分离器部分6a中。在一优选的方案中，直链果聚糖的出口4或直链果聚糖的入口7不允许活性果糖基转移酶通过。这可以通过在出口4或入口7设置不允许果糖基转移酶通过的膜来实现。供选择地，出口4或入口7可以设置果糖基转移酶的减活区域，例如通过加热足够长时间和温度，通常，在约1分钟内，加热为约65-95℃，优选为约70-90℃，更优选为约85℃。在第二反应器6中，包含在分离器部分6a的β-2，6-果糖基转移酶和直链果聚糖与蔗糖反应。允许葡萄糖通过分离器10，并经葡萄糖出口8排出。分支果聚糖经分支果聚糖出口9排出。分支果聚糖出口9可以设置允许分支果聚糖通过，但是不允许蔗糖、葡萄糖或β-2，6-果糖基转移酶通过的分离器(末示出)。如果需要，分离器5和10设置除葡萄糖以外如蔗糖和低果聚糖的物料循环管。
本发明的方法优选在适宜于生产商业量分支果聚糖的反应器中进行。反应器优选包括一个或几个加入蔗糖和/或果糖基转移酶的入口和从反应器分离商业量的分支果聚糖的分离装置。反应器可包括如图2和2a所示的用作反应器系统的多个反应器。
通过传统的化学改性或其它的酶化改性酶化产生的支化果聚糖的其它的变体也在本发明的范围内。化学改性的非限制性实例是：烷基化作用、酯化反应、脱水作用、环化反应和部分水解。酶化改性的非限制性实例是糖基化作用。
可作为食品填充剂和食品增甜剂使用的分支果聚糖本身也具有甜度。
本发明已进行了一般性地描述，下面，通过参考所提供的某些具体实例，就会更进一步地理解本发明。除非另有说明，这些实例是为了说明本发明，而不是企图限制本发明。
克隆和表达方法：
变异链球菌果糖基转移酶的编码序列，缺乏预定信号的序列，可以通过PCR从变异链球菌菌珠ATCC25175中分离。设计和合成两个引物。第一个引物是5-TCTGCGGGATCCCAGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3，含BamHI限制位点，接着与紧挨在突变链球菌果糖基转移酶编码序列中预定信号序列的末端的序列相同的序列。第二个引物是5-TCTGCGAAGCTTTTATTTAAAACCAATGCTTACACA-3包含HimdIII限制位点，相反接着相对应于变异链球菌果糖基转移酶编码序列的C-末端的互补序列。两个引物与从变异链球菌菌珠ATCC25175中分离出来的基因DNA结合并在PCR中使用。生成的DNA片段用BamHI和HimdIII消化并连接BamHI和HimdIII消化的质粒、pGEX-KT-ext。这种连接作用产生了上述变异链球菌果糖基转移酶编码序列，与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的编码序列被立即置于下游的位相内。pGEX-KT-ext变异链球菌-果糖基转移酶质粒转移进入大肠杆菌BL21细胞中。生成转移物的蛋白质表达使细胞间积累了GST-ext变异链球菌-果糖基转移酶融合蛋白质。
十分清楚，按照上述的技术，本发明可以做出许多改进和修改。因此，应当理解，在附属的权利要求范围内，本发明可以用文中所述以外的方法实施。

Claims (17)

1.一种从蔗糖制备葡萄糖的方法，包括：
1)蔗糖与β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶接触产生葡萄糖；和
2)分离反应产物中的葡萄糖。
2.按权利要求1的方法，其中所述β-2，1-果糖基转移酶是从选自出芽短柄霉、米曲霉、泡盛曲霉、萨氏曲霉、黑色曲霉、娄格法尔特氏青霉、变异链球菌、詹司克氏青霉和高等植物的生物中获得的。
3.按权利要求1的方法，其中所述β-2，1-果糖基转移酶或β-2，6-果糖基转移酶中的至少一种是通过在果糖基转移酶基因的宿主中表达而得到，所述果糖基转移酶基因对所述宿主为非本身的。
4.按权利要求1的方法，其中所述的葡萄糖是连续地或半分批地分离的。
5.按权利要求1的方法，其中所述的反应产物进一步包括分支果聚糖且所述方法进一步包括分离所述分支果聚糖。
6.按权利要求5的方法，其中所述分支果聚糖是连续的分离的。
7.按权利要求1的方法，其中所述的葡萄糖是通过膜过滤或色谱法分离的。
8.按权利要求5的方法，其中所述分支果聚糖是通过膜过滤或色谱法分离的。
9.按权利要求1的方法，其中所述的β-2，1-果糖基转移酶是一链伸长的果糖基转移酶。
10.按权利要求1的方法，其中所述β-2，6-果糖基转移酶是一分支的果糖基转移酶。
11.按权利要求1的方法，其中所述的β-2，1-果糖基转移酶是一分支的果糖基转移酶。
12.按权利要求1的方法，其中所述的β-2，6-果糖基转移酶是一链伸长的果糖基转移酶。
13.一种制备商业量葡萄糖的反应器，包括：
1)一反应器容器；
2)一蔗糖入口；
3)一葡萄糖出口；和
4)β-2，1-果糖基转移酶和β-2，6-果糖基转移酶。
14.按权利要求13的反应器，进一步包括一分支果聚糖的出口。
15.按权利要求13的反应器，其中蔗糖的所述入口是连续的入口。
16.按权利要求14的反应器，其中所述的分支果聚糖的所述出口是连续的出口。
17.按权利要求13的反应器，其中所述葡萄糖的所述出口是连续的出口。
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