ES2693461T3 - Enzimas que degradan celulosa y/o hemicelulosas de Macrophomina phaseolina y usos de las mismas - Google Patents

Enzimas que degradan celulosa y/o hemicelulosas de Macrophomina phaseolina y usos de las mismas Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es: por lo menos 90% idéntica a una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID No. 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una ß-1,4-endoglucanasa.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Enzimas que degradan celulosa y/o hemicelulosas de Macrophomina phaseolina y usos de las mismas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a enzimas que degradan celulosa y/o hemicelulosas que se pueden derivar de un hongo M. phaseolina. La invencion proporciona polipeptidos que tienen cualquier actividad celulolftica, que incluye una actividad de celulasa, una actividad de endoglucanasa, celobiohidrolasa, p-glucosidasa, a-glucosidasa, xilanasa, mananasa, p-xilosidasa, arabinofuranasidasa, a-fucosidasas, p-glucuronil hidrolasa insaturada y/u oligomerasa, polinucleotidos que codifican los polipeptidos mencionados anteriormente, y metodos para fabricar y utilizar los polinucleotidos y polipeptidos mencionados anteriormente. La invencion proporciona enzimas para la bioconversion de residuos celulosicos en azucares fermentables y estos azucares se pueden utilizar como materia prima qmmica para la produccion de etanol y combustibles, que incluyen los biocombustibles tales como bioetanol, biopropanol, biobutanol y biodiesel. Los polipeptidos de la invencion se pueden utilizar en una variedad de procesamientos farmaceuticos, agncolas, de alimentos y piensos, biocombustibles, eficiencia energetica y contextos industriales. La invencion tambien proporciona composiciones o productos de fabricacion que comprenden mezclas de enzimas que tienen por lo menos una enzima de la presente invencion. La invencion tambien se refiere a construcciones de acido nucleico, vector y celulas anfitrionas que comprenden los polinucleotidos, asf como a metodos para producir y utilizar los polipeptidos que se utilizan en la degradacion de celulosa y/o hemicelulosa.
Antecedentes de la invencion
La celulosa consiste en una cadena lineal de residuos de D-glucosa unidos a p 1-4 que tienen una estructura molecular como se muestra en la Figura 1. Estas cadenas de glucosa lineales largas estan unidas fuertemente en microfibrillas y no estan unidas covalentemente entre sf por hemicelulosas (Kolpak FJ, Blackwell J. Determination of the structure of cellulose II. Macromolecules 1976; 9:273-278; Carpita NC, Gibeaut DM. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J 1993; 3:1-30). La celulosa forma microfibrillas insolubles cristalinas en las paredes celulares de las plantas las cuales se recalcitran a hidrolisis enzimatica. Esta recalcitancia es el cuello de botella en la produccion de etanol celulosico (Himmel M, Ding S, Johnson D, Adney W, Nimlos M, Brady JW, Foust TD. Biomasa recalcitrance: Engineering plants and enzimas for biofuels production. Science 2007; 315: 804). Por otro lado, las hemicelulosas son el grupo mas complejo de polisacaridos que no contienen almidon y consisten de poftmeros de xilosa, arabinosa, galactosa, manosa que a menudo estan muy ramificados y conectados a otra estructura de pared celular.
La celulosa, que ha sido el material biologico mas abundante en el mundo, es un recurso amplio y renovable que podna ayudar a satisfacer las necesidades energeticas del mundo. Pero la produccion de azucares fermentables a partir de biomasa mediante el uso de enzimas celulolfticas todavfa no es capaz de competir economicamente debido a la ineficiencia de las enzimas celulolfticas utilizadas actualmente. Subsiste la necesidad de investigacion dirigida a aumentar la eficacia de las enzimas celulolfticas que se pueden utilizar para generar azucar fermentable a partir de materiales lignocelulosicos con un coste reducido. Para la digestion completa de celulosa a glucosa, los sistemas de celulasa requieren tres clases de enzimas, p-1,4-endoglucanasas (EGL), exoglucanasas/celobiohidrolasas (CBH) y p- glucosidasa (BGL). Durante el proceso de hidrolisis, la endoglucanasa primero divide aleatoriamente diferentes regiones de celulosa cristalina, produciendo extremos de cadena. Las celobiohidrolasas luego liberan secuencialmente la celobiosa desde el extremo del poftmero de celulosa. Finalmente, la p-glucosidasa rompe los enlaces entre los dos azucares de glucosa de la celobiosa para producir monomeros de glucosa (Figura 2). Este efecto sinergico de estas enzimas hace posible la hidrolisis de la celulosa a la glucosa (Wood TM. Synergism between enzyme components of Penicillium pinophilum cellulase in solubilizing hydrogen bond ordered celulose. J Biochem 1989; 260:37-43; Wood TM, McRae ST. The cellulase of Trichoderma koningii: purification and properties of some endoglucanase components with special reference to their action on celulose when acting alone and in synergism with the cellobiohidrolase. J Biochem 1978;171:61-9; Wood TM, McRae ST. Synergism between enzima involved in the solubilization of the native celulose. Adv Chem Ser 1979; 18:181-210). Es decir, por lo menos se requieren tres tipos de enzimas, por ejemplo, endoglucanasas, celobiohidrolasas y p-glucosidasa y su efecto sinergico para la digestion completa de celulosa. Para cada una de estas tres enzimas existen diferentes variantes estructurales que realizan la misma funcion. Se requieren muchas mas enzimas para digerir las hemicelulosas a monomero de azucar, que incluyen xilanasa, xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y glucuronidasa.
Es un objeto de la presente invencion proporcionar polipeptidos aislados que tienen actividad celulolftica y secuencias de acido nucleico aisladas que codifican los polipeptidos para mejorar la conversion de materiales celulosicos en azucar fermentable.
El documento WO 2010/076388 divulga endoglucanasas fungicas, su produccion y medios para su produccion. Las endoglucanasas se describen como que tienen un rendimiento sustancial a bajas temperaturas. Las endoglucanasas se utilizaron para tratar material celulosico, especialmente en la industria textil, por ejemplo, en bioacabado o biosdesgaste. Tambien se pueden utilizar en detergentes, en alimentos para animales y/o en la industria de la pulpa y papel o la produccion de bioetanol.
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Resumen de la invencion
En un primer aspecto la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que es: por lo menos 90% identica a una secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID No. 2, en la que dicha molecula de acido nucleico codifica una p-1,4-endoglucanasa.
En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una molecula de acido nucleico aislada del primer aspecto ininterrumpida por un codon de parada dentro una secuencia de codificacion que codifica una protema o peptido heterologo.
En un tercer aspecto la presente invencion proporciona una construccion recombinante que comprende la molecula de acido nucleico aislada del primer aspecto.
En un cuarto aspecto la presente invencion proporciona una construccion de expresion que comprende la molecula de acido nucleico aislada del primer aspecto, en la que la secuencia de nucleotidos se asocia operativamente con una secuencia de nucleotidos reguladora que contiene senales reguladoras transcripcionales o traduccionales, o ambas, que controlan la expresion de la secuencia de nucleotidos en una celula anfitriona.
En un quinto aspecto la presente invencion proporciona una celula anfitriona disenada geneticamente que comprende la molecula de acido nucleico aislada del primer aspecto.
En un sexto aspecto la presente invencion proporciona un metodo para elaborar un polipeptido que comprende las etapas de: i. cultivar una celula transformada con la construccion de expresion del cuarto aspecto bajo las condiciones apropiadas para producir el polipeptido; y ii. aislar el polipeptido.
En un septimo aspecto la presente invencion proporciona un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 95% identica a una secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID No. 3, y exhibe la actividad catalftica de p-1,4-endoglucanasa.
En un octavo aspecto la presente invencion proporciona una protema quimerica que comprende el polipeptido aislado del septimo aspecto fusionada a traves de un enlace covalente a una secuencia de aminoacidos de un segundo polipeptido.
En un noveno aspecto la presente invencion proporciona una celula anfitriona, transformada con la construccion de expresion del cuarto aspecto, en la que dicha celula anfitriona produce una enzima que acelera degradacion celulolftica
En un decimo aspecto la presente invencion proporciona un hongo transgenico de M. phaseolina con degradacion celulolftica mejorada, que comprende la construccion de expresion del cuarto aspecto.
Entre otras cosas, la presente invencion divulga una molecula de polinucleotido que codifica una enzima celulolftica que se deriva de un hongo M. phaseolina. La presente invencion tambien se refiere al uso del hongo M. phaseolina en la degradacion de materiales celulosicos.
La invencion proporciona polipeptidos que tienen actividad celulolftica, que incluyen actividad de endoglucanasa, celobiohidrolasa, p-glucosidasa, a-glucosidasa, glucanasas, a-glucan liasa, a-xilosidasa, p-xilosidasa, b-glucuronil hidrolasa d-4,5-no saturada, amiloglucosidasa, manosidasa, a-fucosidasa, arabinosidasa, xilanasa, mananasa, p- galactosidasa, p-galactanasa, arabinofuranosidasa, y/o oligomerasa, y acidos nucleicos que codifican cada uno del polipeptido, y metodos para elaborar y utilizar cada uno de dichos polipeptidos.
El objetivo principal de la presente invencion es divulgar los conjuntos de secuencias de nucleotidos que codifican p-1,4- endoglucanasa (SEQ ID No. 2) de los hongos M. phaseolina. Para cada gen de la invencion, una secuencia de marco de lectura abierto (ORF) se derivo manualmente de la secuencia genomica respectiva al eliminar las secuencias de intrones predichas y cortar y empalmar juntas las secuencias de exones. Tambien se incluyen vectores, construcciones/vectores de expresion y celulas anfitrionas que comprenden los genes enzimaticos.
En otro objeto, la invencion proporciona secuencias de polipeptido deducidas de las secuencias ORF de los genes. Con base en la conservacion de secuencia exhibida entre los genes de M. phaseolina de la invencion y sus homologos en otros hongos, se concluye que los polipeptidos codificados por estos genes de M. phaseolina exhiben actividades enzimaticas similares a sus homologos. Las secuencias de polipeptidos de la invencion corresponden a aquellas de p- 1,4-endoglucanasa (SEQ ID No. 3). La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que comprenden cualquier complemento de las secuencias de nucleotidos descritas anteriormente.
Las enzimas de la invencion tienen una tasa catalftica incrementada para mejorar el proceso de hidrolisis de celulosa. Este aumento de la tasa catalftica conduce a una mayor eficiencia en la produccion de azucares fermentables, que pueden ser utilizados por microorganismos para la produccion de etanol. La invencion proporciona aplicaciones
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Las composiciones y metodos de la invencion se utilizan en la digestion enzimatica de biomasa y pueden comprender el uso de muchas enzimas diferentes, que incluyen celulasas y hemicelulasas.
Las composiciones utilizadas para poner en practica la invencion incluyen una “mezcla de celulasa” que es una mezcla de por lo menos tres enzimas celulasas diferentes, tales como endoglucanasa, celobiohidrolasa y p-glucosidasa para la digestion completa de celulosa para producir monomero de glucosa.
Las composiciones utilizadas para practicar la invencion pueden incluir mezclas de enzimas, que incluyen xilanasas, xilosidasas, celobiohidrolasas y/o arabinofuranosidasas u otras enzimas que pueden digerir hemicelulosa a azucares de monomero.
Las endoglucanasas de la invencion se utilizan en la industria alimenticia, por ejemplo, para la panadena y el procesamiento de frutas y hortalizas, la descomposicion de desechos agncolas, en la fabricacion de alimentos para animales, en la produccion de pulpa y papel, fabricacion de textiles y agentes de limpieza domesticos e industriales.
La presente invencion tambien proporciona la biologfa molecular y la informacion genetica de los genes y enzimas establecidos en el objeto principal que se va a explotar/utilizar para la regulacion, conversion de celulosa y/o degradacion de hemicelulosas para la produccion de productos valiosos.
Con el fin de facilitar la produccion in vitro del polipeptido degradante de celulosa y/o hemicelulosas, la presente invencion tambien incluye una construccion de expresion capaz de expresar el polipeptido que contiene por lo menos 95% de aminoacidos secuenciales como se establece en la SEQ ID No. 3. Preferiblemente, la construccion de expresion ha insertado ADN o ADNc con nucleotidos secuenciales como se establece en la SEQ ID No. 2.
Tambien se divulga una construccion genica recombinante que comprende una plantilla de polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID No. 2, en la que la plantilla de polinucleotido es expresable en una celula anfitriona para producir una enzima que degrada la celulosa y/o hemicelulosa. Preferiblemente, la construccion genica recombinante comprende adicionalmente una region promotora unida operativamente para mejorar la expresion de la plantilla de polinucleotido.
De acuerdo con una de las realizaciones preferidas de la presente invencion, los hongos de M. phaseolina son la cepa ms6. El polipeptido aislado tambien se deriva preferiblemente de esta cepa.
La presente invencion proporciona una manera potencialmente comercial y factible para aislar la enzima que degrada celulosa y/o hemicelulosas de M. phaseolina con el fin de satisfacer la creciente demanda mundial para digerir celulosa y/o hemicelulosas de cualquier fuente, que incluye todas las fuentes biologicas, tales como biomasas de plantas, maderas o subproductos de procesamiento de madera, en la fabricacion de textiles y en agentes de limpieza para el hogar e industriales, y/o en el procesamiento de residuos de biomasa para la produccion de azucar fermentable.
La presente divulgacion se dirige adicionalmente a la utilizacion de la conversion de sustratos celulosicos y/o hemicelulosicos en azucares fermentables y la produccion sucesiva de alcohol combustible.
Cualquiera o todas estas utilidades se pueden desarrollar en un kit para comercializacion, ya sea como productos de investigacion o como suministros para usos industriales. Los kits pueden comprender polinucleotidos y/o polipeptidos que corresponden a uno o mas genes de M. phaseolina de la invencion, anticuerpos y/u otros reactivos.
Un experto en la tecnica apreciara facilmente que la presente invencion esta bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, asf como los inherentes a los mismos. Las realizaciones descritas en este documento no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invencion.
Estas y otras caractensticas, aspectos y ventajas de la presente invencion se entenderan mejor entendidas con referencia a la siguiente descripcion y reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos y tablas.
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y forman parte de la especificacion, ilustran la divulgacion y junto con la descripcion, sirven para explicar los principios de la invencion y la divulgacion relacionada.
La Figura 1 Exhibe la estructura molecular de la celulosa.
La Figura 2 Exhibe la conversion de la celulosa a glucosa utilizando digestion enzimatica.
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La Figura 3 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 1 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 4 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 4 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 5 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 7 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 6 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el
que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 10 y el carril M es escalera de peso
molecular de ADN.
La Figura 7 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el
que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 13 y el carril M es escalera de peso
molecular de ADN.
La Figura 8 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el
que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 16 y el carril M es escalera de peso
molecular de ADN.
La Figura 9 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el
que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 19 y el carril M es escalera de peso
molecular de ADN.
La Figura 10 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 22 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 11 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 25 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 12 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 28 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 13 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 31 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 14 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 34 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 15 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 37 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 16 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-1,4-endoglucanasa de la SEQ ID NO. 46 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 17 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de celobiohidrolasa de la SEQ ID NO. 49 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 18 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de celobiohidrolasa de la SEQ ID NO. 52 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 19 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de celobiohidrolasa de la SEQ ID NO. 55 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 20 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 58 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 21 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 61 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 22 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 64 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 23 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 67 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 24 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 70 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
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La Figura 26 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 76 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 27 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 79 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 28 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 82 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 29 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 85 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 30 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 91 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 31 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 94 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 32 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 97 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 33 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 100 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 34 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 103 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 35 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 106 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 36 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 109 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 37 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 112 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 38 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-glucosidasa de la SEQ ID NO. 115 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 39 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 118 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 40 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 121 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 41 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 124 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 42 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 127 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 43 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 133 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 44 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 136 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 45 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 139 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 46 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 142 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
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La Figura 47 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 145 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 48 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 148 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 49 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 151 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 50 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 154 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 51 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 157 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 52 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 160 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 53 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de exo-1,3-p-glucanasa de la SEQ ID NO. 163 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 54 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-glucan liasa de la SEQ ID NO. 166 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 55 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-xilosidasa de la SEQ ID NO. 175 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 56 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada de la SEQ ID NO. 178 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 57 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada de la SEQ ID NO. 181 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 58 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada de la SEQ ID NO. 184 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 59 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada de la SEQ ID NO. 187 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 60 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada de la SEQ ID NO. 190 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 61 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de glucan 1,4-a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 193 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 62 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de glucan 1,4-a-glucosidasa de la SEQ ID NO. 196 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 63 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,2-manosidasa de la SEQ ID NO. 202 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 64 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,2-manosidasa de la SEQ ID NO. 205 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 65 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,2-manosidasa de la SEQ ID NO. 208 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 66 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,2-manosidasa de la SEQ ID NO. 211 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 67 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polipeptidos de a-1,2-manosidasa de la SEQ ID NO. 214 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 68 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 220 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
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La Figura 69 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 223 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 70 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 226 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 71 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 229 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 72 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 232 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 73 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 235 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 74 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 238 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 75 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 241 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 76 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la sEq ID NO. 247 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 77 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-1,3-glucanasa de la SEQ ID NO. 250 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 78 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-fucosidasa de la SEQ ID NO. 253 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 79 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-fucosidasa de la SEQ ID NO. 256 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 80 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 259 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 81 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 265 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 82 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 268 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 83 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 271 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 84 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 274 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 85 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 277 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 86 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 280 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 87 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de xilano p-1,4-xilosidasa de la SEQ ID NO. 283 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 88 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,5-a-arabinosidasa de la SEQ ID NO. 292 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 89 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,5-a-arabinosidasa de la SEQ ID NO. 295 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 90 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,5-a-arabinosidasa de la SEQ ID NO. 298 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
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La Figura 91 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-xilanasa de la SEQ ID NO. 304 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 92 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-xilanasa de la SEQ ID NO. 307 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 93 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-xilanasa de la SEQ ID NO. 310 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 94 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-xilanasa de la SEQ ID NO. 313 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 95 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 316 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 96 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 319 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 97 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 322 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 98 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 325 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 99 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 328 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 100 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de a-arabinofuranosidasa de la SEQ ID NO. 331 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 101 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-galactosidasa de la SEQ ID NO. 337 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 102 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-galactosidasa de la SEQ ID NO. 340 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 103 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-galactosidasa de la SEQ ID NO. 343 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 104 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de p-galactosidasa de la SEQ ID NO. 346 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 105 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-galactanasa de la SEQ ID NO. 352 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 106 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-galactanasa de la SEQ ID NO. 355 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 107 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-galactanasa de la SEQ ID NO. 358 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 108 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,6-p-galactanasa de la SEQ ID NO. 361 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
La Figura 109 es la imagen del gel de agarosa electroforado que muestra el resultado de la amplificacion de PCR en el que el carril 1 hay polinucleotidos de endo-1,4-p-mananasa de la SEQ ID NO. 364 y el carril M es escalera de peso molecular de ADN.
Descripcion detallada de la invencion
Las definiciones y/o metodos proporcionados en este documento definen la presente invencion y grnan a los expertos en la tecnica en la practica de la presente invencion. Excepto cuando se indique lo contrario, los terminos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de aquellos expertos en la tecnica relevante. En la medida en que se encuentre que cualquiera de las definiciones y/o metodos son inconsistentes con cualquiera de las definiciones y/o metodos proporcionados en cualquier patente o referencia diferente de patente incorporada en el presente documento o en cualquier referencia encontrada en otra parte, se entiende que dicha definicion y/o metodo que se ha
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proporcionado/adoptado expresamente en esta solicitud se utilizara en este documento. Los terminos singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, “que comprende A o B” significa que incluye A, o B, o A y B. Tambien se debe entender adicionalmente que todos los tamanos de bases o tamanos de aminoacidos, y todos los pesos o valores de masa moleculares, dados para los acidos nucleicos o polipeptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripcion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento se pueden utilizar en la practica o en la prueba de la presente divulgacion, los metodos y materiales adecuados se describen a continuacion.
La presente divulgacion proporciona las secuencias de nucleotidos de los genes de M. phaseolina implicados en la degradacion de celulosa y/o hemicelulosas. Los genes codifican protemas con actividad celulolftica que esta en uso en una industria o de interes para una industria. A continuacion, se describen los genes que codifican las enzimas celulolfticas de la divulgacion, su identificacion, caracterizacion, modificacion y metodos de uso en diversos procesos industriales.
Las secuencias de nucleotidos del ADN genomico de M. phaseolina se obtuvieron mediante un esfuerzo de secuenciacion de ADN de bombardeo aleatorio del genoma completo. El ADN genomico se preparo a partir de un aislado de la cepa ms6 de M. phaseolina que se aislo de la planta de yute infectada (Corchorus spp.). Las secuencias de nucleotidos generadas se ensamblaron para formar secuencias y clones solapados y andamios por el ensamblador Newbler. Las secuencias de nucleotidos se anotaron inicialmente por programas de software, como Augustus, Glimmer M (The Institute of Genome Research, Rockville, Md.) y Evidence Modeler (EVM), que pueden identificar regiones de codificacion putativas, intrones y uniones de empalme y corte. Adicionalmente, se realizo una curacion automatizada y manual de las secuencias de nucleotidos para refinar y establecer una caracterizacion precisa de las regiones de codificacion y otras caractensticas de los genes.
Las secuencias genomicas que codifican las enzimas que degradan celulosa y/o hemicelulosa se identifican principalmente por comparacion de secuencias de nucleotidos de ADN genomico de M. phaseolina y las secuencias de nucleotidos de genes enzimaticos conocidos de otros microorganismos. Antes de esta divulgacion, no se conodan las secuencias de nucleotidos de estos genes de M. phaseolina (implicados en la degradacion de la celulosa y/o hemicelulosas), los marcos de lectura, las posiciones de los exones e intrones, la estructura de las enzimas y su utilidad potencial en diversas industrias, que incluyen aquellos involucrados en la fabricacion de alimentos y piensos, bebidas, textiles, bioetanol y detergentes.
Mas de 14000 ADNc de M. phaseolina fueron parcial o totalmente secuenciados. Entre ellos, se descubrieron ciento treinta y cuatro ADNc que codifican nuevas enzimas con funciones putativas en la degradacion de la celulosa y/o hemicelulosa.
Los marcos de lectura abiertos (ORF) se analizan despues de la secuenciacion total o parcial de los clones de las colecciones de ADNc derivadas de ARNm de M. phaseolina y se analizan adicionalmente mediante un software de analisis de secuencias y al determinar la homologfa con secuencias conocidas en bases de datos (publicas/privadas).
En el contexto de esta divulgacion, una serie de terminos utilizados a lo largo de la especificacion tienen los significados indicados, a menos que se indique expresamente que tienen un significado diferente.
El termino “actividad celulolftica”, como se utiliza en este documento, se define como una actividad biologica que hidroliza un material celulosico. Para los propositos de la presente invencion, la actividad celulolftica se determina midiendo el aumento en la hidrolisis de un material celulosico mediante una mezcla celulolftica en condiciones apropiadas/efectivas, por ejemplo, una cantidad apropiada/efectiva (tal como, 1-10 mg) de protema celulolftica/g de celulosa en forraje de mafz pretratado (PCS) durante una cantidad apropiada/efectiva de dfas (tal como, 5-7 dfas) a un nivel apropiado/efectivo de temperatura (tal como 50°C), que luego se compara con una hidrolisis controlada sin adicion de protema celulolftica.
El termino “PCS” o “forraje de mafz pretratado”, como se utiliza en el presente documento, se define como un material celulosico derivado de forraje de mafz mediante tratamiento con calor y acido diluido.
El termino “celulosa” pretende incluir formas solubles e insolubles, amorfas y cristalinas de celulosa.
El termino “hemicelulosa” pretende incluir glucanos, mananos, xilanos, arabinanos o acido poliglucuronico o poligalacturonico.
El termino “material celulosico” se define aqrn como cualquier material que contiene celulosa. La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, cascos, cascaras y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de arboles. El material celulosico tambien se puede encontrar, pero no se limita a, en material herbaceo, residuos agncolas, residuos forestales, residuos solidos municipales, residuos de papel y residuos de fabrica de pulpa y papel. Se entiende aqrn que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, que es un material de pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una condicion mixta.
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El termino “gen”, como se utiliza en el presente documento (a menos que se indique/infiera lo contrario), se define generalmente como las secuencias genomicas del hongo M. phaseolina (o cualquiera de sus cepas), particularmente la secuencia de polinucleotidos que codifica el polipeptido de la serie de enzimas involucradas en la degradacion de celulosa y/o hemicelulosa. El termino puede incluir adicionalmente moleculas de acido nucleico que comprenden secuencias de nucleotidos en direccion ascendente, en direccion descendente y/o de intron.
El termino “marco de lectura abierto (ORF),” significa una serie de tripletes de nucleotidos que codifican aminoacidos sin ningun codon de terminacion y la secuencia del triplete es traducible a protema utilizando la informacion de uso de codon apropiado para un organismo particular.
Una “secuencia de codificacion” o “region de codificacion” se refiere a una molecula de acido nucleico que tiene la informacion de secuencia necesaria para producir un producto genetico, tal como un aminoacido o polipeptido, cuando se expresa la secuencia. La secuencia de codificacion puede comprender secuencias no traducidas (que incluyen intrones o regiones no traducidas 5' o 3') dentro de las regiones traducidas, o puede carecer de tales secuencias no traducidas de intervencion (por ejemplo, como en el ADNc).
El termino “ADNc” se define aqrn como una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa de una molecula de ARNm madura y cortada y empalmada obtenida de una celula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que usualmente estan presentes en el ADN genomico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a traves de una serie de pasos antes de aparecer como ARNm cortado y empalmado maduro. Estas etapas incluyen la eliminacion de secuencias de intrones mediante un proceso llamado corte y empalme.
Como se utiliza en este documento, un “polinucleotido” es una secuencia de nucleotidos tal como un fragmento de acido nucleico. Un polinucleotido puede ser un polfmero de ARN o ADN de cadena sencilla o doble, que opcionalmente contiene bases de nucleotidos sinteticas, no naturales o alteradas. Un polinucleotido en forma de un polfmero de ADN puede estar compuesto por uno o mas segmentos de ADNc, ADN genomico, ADN sintetico o mezclas y/o combinaciones de los mismos. Un polinucleotido aislado de la presente invencion se puede derivar de, pero no se limita a, las SEQ ID Nos. 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82,
85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157,
160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229,
232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301,
304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364, o cualquier complemento de dichas secuencias.
“Aislado” significa alterado “por la mano del hombre” del estado natural. Si una composicion o sustancia ocurre en la naturaleza, se considerana como “aislada” si se ha cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleotido o un polipeptido naturalmente presente en una planta o animal vivo no esta “aislado”, pero el mismo polinucleotido o polipeptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural esta “aislado”, como el termino se emplea en el presente documento.
El termino “recombinante”, cuando se utiliza aqrn para referirse a un polipeptido o protema, normalmente significa que un polipeptido o protema se deriva de sistemas de expresion recombinantes (por ejemplo, microbianos o mairnferos). “Microbiano” se refiere a polipeptidos o protemas recombinantes fabricados en sistemas de expresion bacterianos o fungicos. Los polipeptidos o protemas expresados en la mayona de los sistemas bacterianos, por ejemplo, E. coli, estaran libres de modificaciones de glicosilacion; los polipeptidos o protemas expresados en hongos seran glicosilados.
Un “vector” generalmente se refiere a un replicon, tal como un plasmido, fago, cosmido, levadura o virus, o una secuencia de replicacion artificial (ARS) o un cromosoma artificial para expresar un polipeptido de una secuencia de nucleotidos. El termino “vector” tambien pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plasmido”, que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde segmentos de ADN adicionales pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula anfitriona en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores de mamfferos episomicos). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una celula anfitriona tras la introduccion en la celula anfitriona, y por lo tanto se replican junto con el genoma anfitrion. Mas aun, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento como “vectores de expresion recombinantes”
(o simplemente, “vectores de expresion”). En general, los vectores de expresion de utilidad en las tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. En la presente especificacion, “plasmido” y “vector” se pueden utilizar indistintamente, ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente utilizada. Sin embargo, la invencion pretende incluir otras formas de vectores de expresion, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicacion, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
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El termino “vector de expresion” se define aqu como una molecula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido de la invencion o divulgacion, que esta unido operativamente a nucleotidos adicionales que proporcionan su expresion.
El termino “construccion de expresion” puede comprender un ensamble de un(os) elemento(s) geneticos que tienen una funcion reguladora en la expresion de genes, por ejemplo, promotores o potenciadores, o una secuencia de codificacion que se transcribe en ARN, ARNm y traducido a protema, y que esta unido operativamente a promotor o secuencias apropiadas de iniciacion y terminacion de la transcripcion.
El termino “unido operativamente” denota aqu una configuracion en la que una secuencia de control se coloca en una posicion apropiada con respecto a la secuencia de codificacion de la secuencia de polinucleotidos de tal manera que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia de codificacion de un polipeptido.
El termino “celula anfitriona” se refiere a una celula de cualquier organismo. Las celulas anfitrionas preferidas se derivan de plantas, bacterias, levaduras, hongos, insectos u otros animales. Se debe entender que el termino “celula anfitriona” pretende referirse no solo a la celula sujeto en particular, sino a la progenie de dicha celula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula madre, pero aun estan incluidas dentro del alcance del termino “celula anfitriona” como se utiliza en este documento. El termino “celula anfitriona”, como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier tipo de celula que sea susceptible de transformacion, transfeccion, transduccion y similares con una construccion de acido nucleico o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion o divulgacion. Los metodos para introducir secuencias de polinucleotidos en diversos tipos de celulas anfitrionas son bien conocidos en la tecnica. Se proporcionan celulas anfitrionas o progenie de celulas anfitrionas transformadas con los casetes de expresion recombinante de la presente invencion o divulgacion. Las celulas anfitrionas pueden ser celulas vegetales. Preferiblemente, las celulas vegetales son celulas de yute.
El termino “construccion de acido nucleico”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molecula de acido nucleico, ya sea de cadena sencilla o doble, que se afsla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de acidos nucleicos de una manera que de otro modo no existen en la naturaleza. El termino construccion de acido nucleico es sinonimo del termino “casete de expresion” cuando la construccion de acido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresion de una secuencia de codificacion de la presente invencion o divulgacion.
El termino “celulas anfitrionas recombinantes” significa celulas cultivadas que comprenden una unidad transcripcional recombinante, y expresaran polipeptidos o protemas heterologas, y ARN codificado por el segmento de ADN o gen sintetico en la unidad transcripcional recombinante. Las celulas pueden ser procariotas o eucariotas.
“Polipeptido”, como se utiliza en el presente documento, es una unica cadena lineal de aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos, y que tiene una secuencia de mas de 100 aminoacidos de longitud.
El termino “promotor” como se utiliza en el presente documento, generalmente se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que funciona para dirigir la transcripcion de un gen en direccion descendente. El promotor generalmente sera apropiado para la celula anfitriona en la que se esta expresando el gen objetivo. El promotor, junto con otras secuencias de acido nucleico regulador de la transcripcion y la traduccion (tambien denominadas “secuencias de control”) es necesario para expresar un gen dado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripcion y la traduccion incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, sitios de union ribosomal, secuencias de inicio y detencion de la transcripcion, secuencias de inicio y detencion de la traduccion, y secuencias potenciadoras o activadoras.
El termino “in vitro”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reaccion biologica que se produce en un ambiente artificial fuera de un organismo vivo, que generalmente se realiza en un laboratorio que utiliza componentes de un organismo que se han aislado de su contexto biologico habitual con el fin de permitir un analisis mas detallado o mas conveniente para ser realizado.
El termino “% de homologfa” se utiliza de manera intercambiable en este documento con el termino “% de identidad” en el presente documento y normalmente se refiere al nivel de identidad de la secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos entre la secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de los polipeptidos de la invencion o la secuencia de aminoacidos del polipeptido de la invencion, cuando se alinea utilizando un programa de alineacion de secuencias.
Por ejemplo, como se utiliza en este documento, 80% de homologfa significa lo mismo que 80% de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido, y de acuerdo con lo anterior, un homologo de una secuencia dada tiene mas de 80% de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Niveles de ejemplo de identidad de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 80, 85, 90, 95, 98% o mas de identidad de secuencia con una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia de codificacion para uno cualquiera de los polipeptidos de la invencion, como se describe en el presente documento.
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Programas informaticos de ejemplo que se pueden utilizar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el conjunto de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, accesibles al publico en
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Las busquedas de secuencias se llevan a cabo normalmente utilizando el programa BLASTN al evaluar una secuencia de acidos nucleicos dada en relacion con las secuencias de acido nucleico en las Secuencias de ADN GenBank y otras bases de datos publicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar secuencias de acidos nucleicos que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoacidos en las Secuencias de Protemas de GenBank y otras bases de datos publicas.
Una alineacion preferida de las secuencias seleccionadas con el fin de determinar el “% de identidad” entre dos o mas secuencias se realiza utilizando, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W.
El termino “cebador”, como se utiliza en el presente documento, es un oligonucleotido capaz de unirse a una secuencia de acidos nucleicos diana y de cebar la smtesis de acido nucleico. Un oligonucleotido de amplificacion como se define aqu sera preferiblemente de 10 a 50, lo mas preferiblemente de 15 a 25 nucleotidos en longitud. Mientras que los oligonucleotidos de amplificacion de la presente invencion se pueden sintetizar qmmicamente, dichos oligonucleotidos no son acidos nucleicos de origen natural.
La abreviatura utilizada a lo largo de la especificacion para referirse a los acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos son las abreviaturas convencionales de una letra. Por lo tanto, cuando se incluyen en un acido nucleico, los nucleotidos de codificacion de origen natural se abrevian de la siguiente manera: adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Tambien, a menos que se especifique lo contrario, las secuencias de acido nucleico presentadas en este documento es la direccion 5'^ 3'.
Como se utiliza en este documento, el termino “complementario” y sus derivados se utilizan en referencia al emparejamiento de acidos nucleicos mediante las reglas bien conocidas de los pares A con T o U y los pares C con G. El complemento puede ser “parcial” o “completo”. En el complemento parcial, solo algunas de las bases de acidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases; mientras que, en el complemento completo o total, todas las bases se emparejan de acuerdo con la regla de emparejamiento. El grado de complemento entre las cadenas de acido nucleico puede tener efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de hibridacion entre las cadenas de acido nucleico, como es bien conocido en la tecnica. La eficiencia y la resistencia de dicha hibridacion dependen del metodo de deteccion.
Las secuencias de ADN y divulgacion de la invencion se generaron mediante reacciones de secuenciacion y pueden contener errores menores que pueden existir como nucleotidos, inserciones y/o supresiones mal identificadas. Sin embargo, dichos errores menores, si estan presentes, no debenan perturbar la identificacion de las secuencias como un gen de M. phaseolina que codifica una enzima de interes industrial, y se incluyen espedficamente dentro del alcance de la invencion y divulgacion.
Se abarcan por la divulgacion secuencias de nucleotidos genomicos y secuencias de codificacion de genes que codifican enzimas de M. phaseolina de interes industrial. De acuerdo con lo anterior, en una realizacion, se proporciona la SEQ ID No. 2 la cual identifica una secuencia de nucleotidos del marco de lectura abierto (ORF) de un gen identificado. SEQ ID Nos. 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224,
227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296,
299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362 y 365 se proporcionan en la divulgacion, cada uno de los cuales identifica una secuencia de nucleotidos del marco de lectura abierto (ORF) de un gen identificado. En otra variante, se proporcionan las secuencias genomicas de los genes identificados por las SEQ ID Nos. 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70,

73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148,

151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220,

223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292,
295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364.
Como se utiliza en este documento, “gen” tambien se refiere a (i) un gen que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleotidos y/o fragmentos de los mismos que se establecen en las SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110,

113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182,

185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254,

257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323, 326,
329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127,

130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199,
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202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271,
274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343,
346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364; (ii) cualquier secuencia de nucleotidos o fragmento de la misma que codifica la secuencia de aminoacidos que se establecen en las SEQ ID Nos. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201,
204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273,
276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345,
348, 351, 354, 357, 360, 363 y 366; (iii) cualquier secuencia de nucleotidos que hibrida al complemento de las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206,

209, 212, 215, 218, 221,224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278,

281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350,
353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223,

226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295,
298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364 bajo
condiciones de rigurosidad media, por ejemplo, hibridacion con ADN unido a un filtro en una cantidad adecuada/efectiva de 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a un nivel apropiado/efectivo de temperatura (tal como, 45°C) seguido de uno o mas lavados en un nivel apropiado/efectivo de SDS, tal como 0.2x SSC/0.1% de SDS en un nivel apropiado/efectivo de temperatura (tal como, 50 a 65°C), o bajo condiciones altamente estrictas, por ejemplo, hibridacion para filtrar acido nucleico unido en una cantidad apropiada/efectiva de 6x SSC a un nivel apropiado/efectivo de temperatura (tal como, 45°C) seguido de uno o mas lavados en un nivel apropiado/efectivo de SDS (como, 0.1 x SSC/0.2% de SDS) a un nivel apropiado/efectivo de temperatura e (tal como, 68°C), o bajo otras condiciones de hibridacion que son evidentes para aquellos expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York). Preferiblemente, los polinucleotidos que se hibridan a los complementos de las secuencias de ADN divulgadas en este documento codifican productos genicos, por ejemplo, productos genicos que son funcionalmente equivalentes a un producto genico codificado por uno de los genes enzimaticos o fragmentos de los mismos.
Como se describio anteriormente, las secuencias de genes incluyen no solo secuencias de nucleotidos degeneradas que codifican las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID Nos. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129,
132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201,
204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273,
276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345,
348, 351, 354, 357, 360, 363 y 366, pero tambien secuencias de nucleotidos degeneradas que cuando se traducen en organismos diferentes de M. phaseolina, proporcionanan un polipeptido que comprende una de las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID Nos. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150,
153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222,
225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294,
297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363 y
366, o un fragmento de los mismos. Un experto en la tecnica conocena como seleccionar los codones apropiados o modificar las secuencias de nucleotidos de las SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206,
209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278,
281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350,
353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151,
154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223,
226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295,
298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364, al utilizar las secuencias de genes en M. phaseolina o en otros organismos. Por ejemplo, en Candida albicans, el CTG de codon codifica un residuo de serina en lugar de un residuo de leucina.
Las secuencias de nucleotidos de la invencion y otras secuencias de la divulgacion se pueden utilizar como marcadores geneticos y/o marcadores de secuencia para ayudar al desarrollo de un mapa genetico, ffsico o de secuencia del genoma de M. phaseolina. Las secuencias de nucleotidos y los productos genicos correspondientes de la invencion tambien se pueden utilizar para detectar la presencia de M. phaseolina. Se pueden utilizar metodos de hibridacion y con base en anticuerpos bien conocidos en la tecnica para determinar la presencia y concentracion de las secuencias de nucleotidos y los productos genicos correspondientes.
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Las secuencias de nucleotidos tambien se pueden utilizar para identificar inhibidores de las enzimas que pueden tener efectos terapeuticos, dado el hecho de que las enzimas pueden desempenar una funcion en la invasion de un anfitrion durante una infeccion.
En otra variante, ademas de las secuencias de nucleotidos de M. phaseolina descritas anteriormente, tambien se incluyen homologos u ortologos de los genes de la invencion que pueden estar presentes en M. phaseolina y otras especies de hongos. Particularmente preferidos son homologos u ortologos en hongos filamentosos. Estos genes enzimaticos se pueden identificar y aislar mediante tecnicas de biologfa molecular bien conocidas en la materia.
El termino “Hongos”, como se utiliza en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (Hawksworth DL, Kirk PM, Sutton BC, Pegler Dn. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi (8th Ed.). 1995; CAB International, Wallingford, United Kingdom. 616p) y levadura. Los grupos representativos de Ascomycota incluyen, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Aspergillus. Los grupos representativos de Basidiomycota incluyen hongos, mohos, y tizones. Los grupos representativos de Chytridiomycota incluyen Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces. Los grupos representativos de Zygomycota incluyen, por ejemplo, Rhizopus y Mucor.
El termino “hongos filamentosos” incluye todas las formas filamentosas de hongos. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacaridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento de hifas y el catabolismo del carbono es necesariamente aerobico.
De acuerdo con lo anterior, la divulgacion proporciona secuencias de nucleotidos fungicas que se pueden hibridar a los polinucleotidos de los genes. La divulgacion incluye un acido nucleico aislado que comprende y/o que consiste de una secuencia de nucleotidos que es por lo menos 50% identica a una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende y/o que consiste de: SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287,
290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359,
362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232,
235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304,
307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364.
En otra variante, la divulgacion incluye un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos fungica que hibrida bajo condiciones de rigurosidad medio a un segundo acido nucleico que comprende y/o consiste de una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende y/o que consiste de la SEQ ID NO. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179,

182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251,

254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323,
326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40,
43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196,

199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268,

271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340,
343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364.
En todavfa otra variante, la divulgacion incluye un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos fungica que codifica un polipeptido la secuencia de aminoacidos de la cual por lo menos 50% identica a una secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que comprende y/o que consiste de las SEQ ID Nos. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186,
189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258,
261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330,
333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363 y 366.
Las secuencias de nucleotidos de la divulgacion todavfa incluye adicionalmente secuencias de nucleotidos fungicas que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o more secuencia de nucleotidos identidad a las secuencias de nucleotidos establecidas en las SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107,

110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179,

182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248, 251,

254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320, 323,
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326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196,
199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268,
271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340,
343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364.
Para aislar genes homologos, la secuencia de genes de M. phaseolina descrita anteriormente se puede marcar y utilizar para cribar una coleccion de ADNc construida a partir del ARNm obtenido del organismo de interes, que incluye, pero no se limita a M. phaseolina. De acuerdo con lo anterior, se incluyen las sondas de acido nucleico, preferiblemente marcadas de forma detectable, que comprenden una cualquiera de las secuencias de nucleotidos de la SEQ ID NO. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170,

173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242,

245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314,
317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115,

118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187,

190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259,

262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331,
334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 y 364. Las condiciones de hibridacion debenan ser de menor rigor cuando la coleccion de ADNc se derivo de un organismo diferente del tipo de organismo del que se derivo la secuencia marcada. El cribado de ADNc tambien puede identificar clones derivados de transcripciones empalmadas alternativamente en la misma especie. Alternativamente, se puede utilizar la sonda marcada para explorar una coleccion genomica derivada del organismo de interes, de nuevo, utilizando condiciones apropiadamente estrictas. Las condiciones de baja rigurosidad seran bien conocidas por aquellos expertos en la tecnica, y variaran de manera predecible dependiendo de los organismos espedficos a partir de los cuales se derivan la coleccion y las secuencias marcadas. (Detalles en Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third edition, 2001, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).
Adicionalmente, se puede aislar una secuencia de genes homologa al realizar una reaccion en cadena de polimerasa (PCR) utilizando dos conjuntos de cebadores de oligonucleotidos degenerados disenados sobre la base de secuencias de aminoacidos dentro del gen de interes. La plantilla para la reaccion puede ser ADNc obtenido por transcripcion inversa de ARNm preparado a partir del organismo de interes. El producto de la PCR se puede subclonar y secuenciar para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una secuencia de genes de enzimas homologas.
El fragmento de PCR luego se puede utilizar para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de metodos bien conocidos por aquellos expertos comunes en la tecnica. Alternativamente, el fragmento etiquetado se puede utilizar para cribar una coleccion genomica.
En otra variante de la divulgacion, las secuencias de genes de M. phaseolina se pueden utilizar para desarrollar enzimas modificadas o nuevas que exhiben caractensticas qrnmicas y/o ffsicas particularmente deseables. Debido a la aparente relacion de las secuencias de aminoacidos entre las enzimas de M. phaseolina y otros hongos filamentosos, la estructura de una enzima de otro hongo se puede utilizar para predecir la estructura de la enzima de M. phaseolina, y ayudar en la modificacion racional de la enzima de M. phaseolina para propiedades utiles y superiores. Las secuencias proporcionadas por la presente divulgacion tambien pueden se utilizar como materiales de partida para la modificacion racional o el diseno de nuevas enzimas con caractensticas que permiten que las enzimas se desempenen mejor en procesos exigentes.
Las secuencias de nucleotidos del gen se pueden alterar mediante tecnicas de mutagenesis aleatoria y dirigida al sitio o tecnicas de evolucion molecular dirigida, tales como, pero no se limita a, los metodos descritos en (Arnold FH. Protein engineering for unusal environments. Curr. Opinion Biotechnol. 1993;4:450-455), mutagenesis dirigida a oligonucleotidos (Reidhaar-Olson JF, Sauer RT. Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science, 1988; 241:53-57), mutagenesis qrnmica (Eckert KA, Drinkwater NR. recA-dependent and recA- independent N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis at a plasmid-encoded herpes simplex virus thymidine kinase gene in Escherichia coli. Mutat Res. 1987;178:1-10), mutagenesis dirigida a sitio (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985;82:488-492; Oliphant A, Nussbaum AL, Struhl K. Cloning of random-sequence oligodeoxynucleotides. Gene 1986;44 177-183), PCR propensa a error (Cadwell RC, Joyce GF. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR metodos Appl. 1992;2:28-33), mutagenesis en casete (Stauss Hj, Davies H, Sadov nikova E, Chain B, Horowitz N, Sinclair C. Induction of cytotoxic T lymphocytes with peptides in vitro: identification of candidate T-cell epitopes in human papilloma virus. PNAS 1992; 89(17): 7871-7875)) metodos de mezcla de ADN como se describe en Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. PNAS 1994;91(22):10747-10751 y en las Patentes de Estados Unidos 5,605,793; 6,117,679; y 6,132,970, y los metodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos.
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5,939,250, 5,965,408, 6,171 820. Las mutaciones en la secuencia de nucleotidos se pueden determinar mediante la secuenciacion del gen en los clones.
En una realizacion, el polinucleotido de 699 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 2 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un del polipeptido de 232 aminoacidos, como en la sEq ID NO. 3, con una masa molecular predicha de aproximadamente 24 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 2 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 696 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 5 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 231 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 6, con una masa molecular calculada de aproximadamente 24 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 5 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 786 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 8 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 261 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 9, con una masa molecular calculada de aproximadamente 28 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 8 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 873 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 11 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 290 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 12, con una masa molecular calculada de aproximadamente 32 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 11 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 732 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 14 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 243 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 15, con una masa molecular calculada de aproximadamente 25 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 14 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 834 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 17 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 277 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 18, con una masa molecular calculada de aproximadamente 29 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 17 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1431 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 20 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 476 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 21, con una masa molecular calculada de aproximadamente 51 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 20 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 762 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 23 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 253 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 24, con una masa molecular calculada de aproximadamente 27 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 23 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1113 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 26 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 370 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 27, con una masa molecular calculada de aproximadamente 38 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 26 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 678 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 29 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 225 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 30, con una masa molecular calculada de aproximadamente 24 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 29 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
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El polipeptido de 963 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 35 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 320 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 36, con una masa molecular calculada de aproximadamente 35 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 35 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1479 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 38 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 492 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 39, con una masa molecular calculada de aproximadamente 58 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 38 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1743 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 41 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 580 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 42, con una masa molecular calculada de aproximadamente 64 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 41 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1083 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 44 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 360 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 45, con una masa molecular calculada de aproximadamente 39 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 44 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1395 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 47 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-endoglucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 464 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 48, con una masa molecular calculada de aproximadamente 47.68 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 47 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-endoglucanasa que divide espedficamente los enlaces internos de la cadena de celulosa.
El polipeptido de 1368 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 50 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de celobiohidrolasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 455 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 51, con una masa molecular calculada de aproximadamente 48 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 50 revela que esta secuencia produce la protema de celobiohidrolasa que ataca la celulosa de cualquiera de los extremos de reduccion y no reduccion del polfmero de celulosa y produce un dfmero de glucosa, celobiosa.
El polipeptido de 1392 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 53 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de celobiohidrolasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 463 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 54, con una masa molecular calculada de aproximadamente 50 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 53 revela que esta secuencia produce la protema de celobiohidrolasa que ataca la celulosa de cualquiera de los extremos de reduccion y no reduccion del polfmero de celulosa y produce un dfmero de glucosa, celobiosa.
El polipeptido de 528 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 56 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de celobiohidrolasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 175 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 57, con una masa molecular calculada de aproximadamente 19 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 56 revela que esta secuencia produce la protema de celobiohidrolasa que ataca la celulosa de cualquiera de los extremos de reduccion y no reduccion del polfmero de celulosa y produce un dfmero de glucosa, celobiosa.
El polipeptido de 2448 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 59 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 815 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 60, con una masa molecular calculada de aproximadamente 87 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 59 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2511 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 62 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 836 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 63, con una masa molecular calculada de aproximadamente 90 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 62 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
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El polipeptido de 2712 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 68 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 903 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 69, con una masa molecular calculada de aproximadamente 96 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 68 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 3249 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 71 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 1082 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 72, con una masa molecular calculada de aproximadamente 1l9 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 71 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2616 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 74 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 871 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 75, con una masa molecular calculada de aproximadamente 93 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 74 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2418 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 77 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 805 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 78 con una masa molecular calculada de aproximadamente 84 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 77 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2346 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 80 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 781 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 81 con una masa molecular calculada de aproximadamente 84 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 80 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2499 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 83 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 832 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 84 con una masa molecular calculada de aproximadamente 91 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 83 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2337 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 86 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 778 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 87 con una masa molecular calculada de aproximadamente 84 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 86 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2361 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 89 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 786 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 90 con una masa molecular calculada de aproximadamente 85 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 89 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 1905 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 92 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 634 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 93 con una masa molecular calculada de aproximadamente 70 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 92 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 1731 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 95 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 576 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 96 con una masa molecular calculada de aproximadamente 65 kD. El analisis bioinformatico de
la SEQ ID NO. 95 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en
algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
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El polipeptido de 1617 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 101 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 538 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 102 con una masa molecular calculada de aproximadamente 61 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 101 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 1863 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 104 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 620 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 105 con una masa molecular calculada de aproximadamente 69 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 104 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 1629 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 107 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 542 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 108 con una masa molecular calculada de aproximadamente 61 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 107 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 654 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 110 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 217 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 111 con una masa molecular calculada de aproximadamente 25 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 110 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2406 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 113 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 801 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 114 con una masa molecular calculada de aproximadamente 77 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 113 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2214 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 116 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 737 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 117 con una masa molecular calculada de aproximadamente 78 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 116 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucosidasa que hidroliza la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
El polipeptido de 2664 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 119 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 887 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 120 con una masa molecular calculada de aproximadamente 97 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 119 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a- D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales en la liberacion de a-D-glucosa.
El polinucleotido de 2172 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 122 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 723 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 123 con una masa molecular calculada de aproximadamente 80 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 122 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales en la liberacion de a-D-glucosa.
El polinucleotido de 2226 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 125 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 741 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 126 con una masa molecular calculada de aproximadamente 83 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 125 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales con liberacion de a-D-glucosa.
El polinucleotido de 2967 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 128 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 988 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 129 con una masa molecular calculada de aproximadamente 112 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 128 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales con liberacion de a-D-glucosa.
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El polinucleotido de 2544 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 134 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 847 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 135 con una masa molecular calculada de aproximadamente 94 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 134 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales con liberacion de a-D-glucosa.
El polinucleotido de 1359 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 137 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 452 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 138 con una masa molecular calculada de aproximadamente 50 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 137 revela que esta secuencia produce la protema de a-glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa unidos a (1->4), sin reduccion, terminales con liberacion de a-D-glucosa.
El polinucleotido de 1734 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 140 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 577 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 141 con una masa molecular calculada de aproximadamente 63 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 140 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 1341 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 143 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 446 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 144 con una masa molecular calculada de aproximadamente 49 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 143 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 1251 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 146 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 416 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 147 con una masa molecular calculada de aproximadamente 46 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 146 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-3-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 885 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 149 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de glucan-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 294 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 150 con una masa molecular calculada de aproximadamente 32 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 149 revela que esta secuencia produce la protema de glucan-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 921 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 152 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de glucan-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 306 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 153 con una masa molecular calculada de aproximadamente 33 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 152 revela que esta secuencia produce la protema de glucan-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 1242 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 155 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-peta-glucanasa protema que exhibe un marco de lectura abierto que codifica un polipeptido de 413 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 156 con una masa molecular calculada de aproximadamente 46 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 155 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p- glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D- glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 2757 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 158 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 918 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 159 con una masa molecular calculada de aproximadamente 105 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 158 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 2334 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 161 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 777
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aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 162 con una masa molecular calculada de aproximadamente 86 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 161 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 2529 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 164 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de exo-1,3-p-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 842 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 165 con una masa molecular calculada de aproximadamente 91 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 164 revela que esta secuencia produce la protema de exo-1,3-p-glucanasa que se hidroliza sucesivamente de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
El polinucleotido de 3363 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 167 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,4-glucan liasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 1120 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 168 con una masa molecular calculada de aproximadamente 127 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 167 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,4-glucan liasa que cataliza la degradacion secuencial de (1->4)-a-D-glucanos del extremo sin reduccion con la liberacion de 1,5-anhidro-D-fructosa y D-glucosa.
El polinucleotido de 3345 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 170 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,4-glucan liasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 1114 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 171 con una masa molecular calculada de aproximadamente 128 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 170 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,4-glucan liasa que cataliza la degradacion secuencial de (1->4)-a-D-glucanos del extremo sin reduccion con la liberacion de 1,5-anhidro-D-fructosa y D-glucosa.
El polinucleotido de 2025 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 173 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 674
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 174 con una masa molecular calculada de aproximadamente 76 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 173 revela que esta secuencia produce la protema de a-xilosidasa que cataliza, la hidrolisis de cadenas laterales de xiloglucano y elimina residuos de D-xilosa no sustituidos adheridos a la glucosa ubicada en el terminal sin reduccion. Esta enzima se involucra en la degradacion de oligosacaridos de xiloglucano.
El polinucleotido de 2316 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 176 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 771
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 177 con una masa molecular calculada de aproximadamente 86 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 176 revela que esta secuencia produce la protema de a-xilosidasa que cataliza, la hidrolisis de cadenas laterales de xiloglucano y elimina residuos de D-xilosa no sustituidos adheridos a la glucosa ubicada en el terminal sin reduccion. Esta enzima se involucra en la degradacion de oligosacaridos de xiloglucano.
El polinucleotido de 1236 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 179 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 411 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 180 con una masa molecular calculada de aproximadamente 45 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 179 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que cataliza la liberacion hidrolftica de acidos glucuronicos insaturados a partir de oligosacaridos producidos por las reacciones de polisacarido liasas.
El polinucleotido de 1143 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 182 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 380 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 183 con una masa molecular calculada de aproximadamente 44 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 182 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que cataliza la liberacion hidrolftica de acidos glucuronicos insaturados a partir de oligosacaridos producidos por las reacciones de polisacarido liasas.
El polinucleotido de 1248 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 185 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 415 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 186 con una masa molecular calculada de aproximadamente 47 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 185 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que cataliza la liberacion hidrolftica de acidos glucuronicos insaturados a partir de oligosacaridos producidos por las reacciones de polisacarido liasas.
El polinucleotido de 1158 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 188 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 385 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 189 con una masa molecular calculada de aproximadamente 43 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 188 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucuronil
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El polinucleotido de 1113 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 191 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 370 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 192 con una masa molecular calculada de aproximadamente 39 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 191 revela que esta secuencia produce la protema de p-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada que cataliza la liberacion hidrolftica de acidos glucuronicos insaturados a partir de oligosacaridos producidos por las reacciones de polisacarido liasas.
El polinucleotido de 1683 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 194 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de glucan 1,4-a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 560 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 195 con una masa molecular calculada de aproximadamente 61 kD. El
analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 194 revela que esta secuencia produce la protema de glucan 1,4-a-
glucosidasa que se hidroliza de residuos de a-D-glucosa (1->4)-unida terminales sucesivamente desde extremos no reductores de las cadenas con liberacion de p-D-glucosa.
El polinucleotido de 1917 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 197 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de glucan 1,4-a-glucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 638 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 198 con una masa molecular calculada de aproximadamente 68 kD. El
analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 197 revela que esta secuencia produce la protema de glucan 1,4-a-
glucosidasa que hidroliza los residuos de a-D-glucosa (1->4)-unida terminales sucesivamente desde extremos no reductores de las cadenas con liberacion de p-D-glucosa.
El polinucleotido de 2670 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 200 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 889 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 201 con una masa molecular calculada de aproximadamente 95 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 200 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 2361 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 203 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 786 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 204 con una masa molecular calculada de aproximadamente 85 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 203 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 2382 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 206 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 793 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 207 con una masa molecular calculada de aproximadamente 88 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 206 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 2415 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 209 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 804 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 210 con una masa molecular calculada de aproximadamente 88 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 209 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 2289 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 212 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 762 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 213 con una masa molecular calculada de aproximadamente 83 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 212 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 2484 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 215 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,2-manosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 827 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 216 con una masa molecular calculada de aproximadamente 92 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 215 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,2-manosidasa que elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
El polinucleotido de 1485 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 218 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 494 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 219 con una masa molecular calculada de aproximadamente 52 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 218 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1,3-glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como
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El polinucleotido de 1533 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 221 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 510
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 222 con una masa molecular calculada de aproximadamente 56 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 221 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1344 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 224 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 447
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 225 con una masa molecular calculada de aproximadamente 49 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 224 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1365 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 227 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 454 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 228 con una masa molecular calculada de aproximadamente 49 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 227 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 765 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 230 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 254 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 231 con una masa molecular calculada de aproximadamente 29 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 230 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1485 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 233 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 494
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 234 con una masa molecular calculada de aproximadamente 55 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 233 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1503 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 236 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 500
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 237 con una masa molecular calculada de aproximadamente 54 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 236 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 810 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 239 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 269
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 240 con una masa molecular calculada de aproximadamente 29 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 239 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 783 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 242 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 260
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 243 con una masa molecular calculada de aproximadamente 29 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 242 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
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El polinucleotido de 1251 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 245 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 416 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 246 con una masa molecular calculada de aproximadamente 45 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 245 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1350 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 248 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 449 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 249 con una masa molecular calculada de aproximadamente 50 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 248 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 1485 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 251 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-1,3-glucanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 494 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 252 con una masa molecular calculada de aproximadamente 55 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 251 revela que esta secuencia produce la protema de a-1,3-glucanasa que degrada a-
1.3- glucanos y tambien tiene la habilidad de eliminar placas dentales. Por lo tanto, esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
El polinucleotido de 2349 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 254 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-L-fucosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 782 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 255 con una masa molecular calculada de aproximadamente 86 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 254 revela que esta secuencia produce la protema de a-L-fucosidasa que es responsable de hidrolizar la fucosa a-1,6-ligada unida a la N-acetilglucosamina del extremo de reduccion de las fracciones de carbohidrato de las glicoprotemas. Por lo tanto, esta a-L-fucosidasa esta involucrada en la degradacion de xiloglucanos fucosilados.
El polinucleotido de 2208 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 257 es el clon ADNc de longitud completa que codifica a-L-fucosidasa protema que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 735 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 258 con una masa molecular calculada de aproximadamente 81 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 257 revela que esta secuencia produce la protema de a-L-fucosidasa que es responsable de hidrolizar la fucosa a-1,6-ligada unida a la N-acetilglucosamina del extremo de reduccion de las fracciones de carbohidrato de las glicoprotemas. Por lo tanto, esta a-L-fucosidasa esta involucrada en la degradacion de xiloglucanos fucosilados.
El polinucleotido de 1491 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 260 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 496 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 261 con una masa molecular calculada de aproximadamente 56 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 260 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1548 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 263 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 515 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 264 con una masa molecular calculada de aproximadamente 56 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 263 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1560 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 266 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 519 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 267 con una masa molecular calculada de aproximadamente 56 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 266 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 2403 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 269 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 800 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 270 con una masa molecular calculada de aproximadamente 87 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 269 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
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El polinucleotido de 2916 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 272 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 971
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 273 con una masa molecular calculada de aproximadamente 104 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 272 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 978 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 275 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 325
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 276 con una masa molecular calculada de aproximadamente 36 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 275 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1731 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 278 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 576
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 279 con una masa molecular calculada de aproximadamente 63 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 278 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1737 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 281 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 578
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 282 con una masa molecular calculada de aproximadamente 63 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 281 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1731 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 284 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 576
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 285 con una masa molecular calculada de aproximadamente 64 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 284 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1764 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 287 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 587
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 288 con una masa molecular calculada de aproximadamente 64 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 287 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 1623 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 290 es el clon ADNc de longitud completa que
codifica la protema de p-1,4-xilosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 540
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 291 con una masa molecular calculada de aproximadamente 60 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 290 revela que esta secuencia produce la protema de p-1,4-xilosidasa que hidroliza los (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
El polinucleotido de 960 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 293 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,5-a-L-arabinosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 319 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 294 con una masa molecular calculada de aproximadamente 35 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 293 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,5-a-L- arabinosidasa que cataliza la hidrolisis de la estructura principal de L-arabinofuranosida a-1,5-unida en (1->5)- arabinanos.
El polinucleotido de 1056 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 296 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,5-a-L-arabinosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 351 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 297 con una masa molecular calculada de aproximadamente 38 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 296 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,5-a-L- arabinosidasa que cataliza la hidrolisis de la estructura principal de L-arabinofuranosida a-1,5-unida en (1->5)- arabinanos.
El polinucleotido de 957 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 299 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,5-a-L-arabinosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 318 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 300 con una masa molecular calculada de aproximadamente 34 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 299 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,5-a-L- arabinosidasa que cataliza la hidrolisis de la estructura principal de L-arabinofuranosida a-1,5-unida en (1->5)- arabinanos.
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El polinucleotido de 972 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 305 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-xilanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 323 aminoacidos, como en la SEQ iD NO. 306 con una masa molecular calculada de aproximadamente 34 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 305 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-xilanasa que cataliza de la endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-xilosfdicos en xilanos y producen xilosa. Esta enzima es crucial para despolimerizacion de hemicelulosas y tiene una aplicacion industrial potencial, tal como en bioblanqueo, fabricacion de papel y en las industrias de alimentacion y alimentacion animal. Otras aplicaciones potenciales incluyen la conversion de xilano en residuos de las industrias agncolas y alimenticias en xilosa, y la produccion de materias primas qmmicas y de combustible.
El polinucleotido de 987 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 308 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-xilanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 328
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 309 con una masa molecular calculada de aproximadamente 35 kD. El analisis
bioinformatico de la SEQ ID NO. 308 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-xilanasa que cataliza de la endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-xilosfdicos en xilanos y producen xilosa. Esta enzima es crucial para despolimerizacion de hemicelulosas y tiene una aplicacion industrial potencial, tal como en bioblanqueo, fabricacion de papel y en las industrias de alimentacion y alimentacion animal. Otras aplicaciones potenciales incluyen la conversion de xilano en residuos de industrias agncolas y alimenticios en xilosa, y la produccion de materias primas qmmicas y de combustible.
El polinucleotido de 1353 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 311 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-xilanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 450
aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 312 con una masa molecular calculada de aproximadamente 48 kD. El analisis
bioinformatico de la SEQ ID NO. 311 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-xilanasa que cataliza de la endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-xilosfdicos en xilanos y producen xilosa. Esta enzima es crucial para despolimerizacion de hemicelulosas y tiene una aplicacion industrial potencial, tal como en bioblanqueo, fabricacion de papel y en las industrias de alimentacion y alimentacion animal. Otras aplicaciones potenciales incluyen la conversion de xilano en residuos de industrias agncolas y alimenticios en xilosa, y la produccion de materias primas qmmicas y de combustible.
El polinucleotido de 1518 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 314 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-xilanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica un polipeptido de 505 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 315 con una masa molecular calculada de aproximadamente 54 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 314 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-xilanasa que cataliza de la endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-xilosfdicos en xilanos y producen xilosa. Esta enzima es crucial para despolimerizacion de hemicelulosas y tiene una aplicacion industrial potencial, tal como en bioblanqueo, fabricacion de papel y en las industrias de alimentacion y alimentacion animal. Otras aplicaciones potenciales incluyen la conversion de xilano en residuos de industrias agncolas y alimenticios en xilosa, y la produccion de materias primas qmmicas y de combustible.
El polinucleotido de 1149 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 317 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-arabinofuranosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 382 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 318 con una masa molecular calculada de aproximadamente 43 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 317 revela que esta secuencia produce la protema de a-arabinofuranosidasa que cataliza la hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida terminales no reductores en a-L-arabinosidas.
El polinucleotido de 1116 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 320 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-arabinofuranosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 371 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 321 con una masa molecular calculada de aproximadamente 41 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 320 revela que esta secuencia produce la protema de a-arabinofuranosidasa que cataliza la hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida no reductores terminales en a-L-arabinosidas.
El polinucleotido de 990 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 323 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-arabinofuranosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 329 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 324 con una masa molecular calculada de aproximadamente 36 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 323 revela que esta secuencia produce la protema de a-arabinofuranosidasa que cataliza la hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida no reductores terminales en a-L-arabinosidas.
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El polinucleotido de 1527 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 329 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-arabinofuranosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 508 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 330 con una masa molecular calculada de aproximadamente 57 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 329 revela que esta secuencia produce la protema de a-arabinofuranosidasa que cataliza la hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida no reductores terminales en a-L-arabinosidas.
El polinucleotido de 2145 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 332 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de a-arabinofuranosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de a 714 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 333 con una masa molecular calculada de aproximadamente 80 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 332 revela que esta secuencia produce la protema de a-arabinofuranosidasa que cataliza la hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida no reductores terminales en a-L-arabinosidas.
El polinucleotido de 2994 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 335 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p- galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 997 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 336 con una masa molecular calculada de aproximadamente 108 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 335 revela que esta secuencia produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-galactosidas y a-L-arabinosidas. p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 1932 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 338 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 643 aminoacidos, como en la sEq ID NO. 339 con una masa molecular calculada de aproximadamente 71 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 338 revela que esta secuencia produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-gatactosidas y a-L-arabinosidas. p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 3135 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID No. 341 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 1044 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 342 con una masa molecular calculada de aproximadamente 118 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 341 revela que esta secuencia produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-galactosidas y a-L-arabinosidas. p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 2070 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 344 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 689 aminoacidos, como en la sEq ID NO. 345 con una masa molecular calculada de aproximadamente 78 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 344 revela que esta secuencia produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-galactosidas y a-L-arabinosidas. p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 2994 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID No. 347 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 997 aminoacidos, como en la sEq ID NO. 348 con una masa molecular calculada de aproximadamente 108 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 347 revela que esta secuencia produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-galactosidas y a-L-arabinosidas. La p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 2985 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 350 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de p-galactosidasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 994 aminoacidos, como en la sEq ID NO. 351 con una masa molecular calculada de aproximadamente 109 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 350 revela que esta secuencia
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produce la protema de p-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de p-D-galactosidas y a-L-arabinosidas. p-galactosidasa tiene propiedad catalftica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias. El polipeptido de 1068 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID No. 353 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-galactanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 355 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 354 con una masa molecular calculada de aproximadamente 38 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 353 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-galactanasa que lleva a cabo o provoca endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-galactosfdicos presentes en arabinogalactanos.
El polinucleotido de 1065 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 356 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-galactanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 354 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 357 con una masa molecular calculada de aproximadamente 38 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 356 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-galactanasa que lleva a cabo o provoca endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-galactosfdicos presentes en arabinogalactanos
El polinucleotido de 1146 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 359 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-galactanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 381 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 360 con una masa molecular calculada de aproximadamente 42 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 359 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-galactanasa que lleva a cabo o provoca endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-galactosfdicos presentes en arabinogalactanos.
El polinucleotido de 1281 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 362 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,6-p-galactanasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 426 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 363 con una masa molecular calculada de aproximadamente 48 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 362 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,6-p-galactanasa que cataliza de la hidrolisis aleatoria de enlaces (1->6) en (1->6)-p-D-glucanos.
El polinucleotido de 1110 bp de longitud ilustrado en la SEQ ID NO. 365 es el clon ADNc de longitud completa que codifica la protema de endo-1,4-p-mananasa que exhibe un marco de lectura abierto que codifica el polipeptido de 369 aminoacidos, como en la SEQ ID NO. 366 con una masa molecular calculada de aproximadamente 40 kD. El analisis bioinformatico de la SEQ ID NO. 365 revela que esta secuencia produce la protema de endo-1,4-p-mananasa que cataliza la hidrolisis aleatoria de enlaces (1->4)-p-D-mannosfdicos en mananos, galactomananos y glucomananos.
Las secuencias proporcionadas por la divulgacion tambien se pueden utilizar como materiales preparatorios para la modificacion racional o el diseno de enzimas novedosas con caractensticas que permiten que las enzimas se desempenen mejor en procesos exigentes.
Se proporciona un resumen de las enzimas de la divulgacion en la Tabla 1.
Tabla 1. Divulgacion superficial.
Enzima
SEQ ID Funcion
p-1,4- endoglucanasa
SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45 y 48. Divide los enlaces internos de la cadena de celulosa.
Celobiohidrolasa
SEQ ID NOs. 51, 54 y 57. Divide el polfmero de celulosa y produce un dfmero de glucosa, celobiosa.
p-glucosidasa
SEQ ID NOs. 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114 y 117. Hidrolisis de la celobiosa y en algunos casos los celooligosacaridos a glucosa.
a-glucosidasa
SEQ ID NOs. 120, 123, 126, 129, 132, 135 y 138. Hidrolisis de residuos de a-D-glucosa (1-> 4)-unidos no reductores, terminales con liberacion de a-D- glucosa.
Exo-1,3-p-glucanasa
SEQ ID NOs. 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162 y 165. Hidrolisis sucesiva de unidades de p-D-glucosa de los extremos no reductores de (1->3)-p-D-glucanos, que liberan a-glucosa.
a-1,4-glucan liasa
SEQ ID NOs. 168 y 171. Degradacion secuencial de (1->4)-a-D-glucanos desde el extremo no reductor con la liberacion de 1,5-anhidro-D-fructosa y D-glucosa.
a-xilosidasa
SEQ ID NOs. 174 y 177. Hidrolisis de cadenas laterales de xiloglucano y
Enzima
SEQ ID Funcion
elimina residuos de D-xilosa no sustituidos adheridos a la glucosa ubicada en el terminal sin reduccion.
p-glucuronil hidrolasa d-4,5- insaturada
SEQ ID NOs. 180, 183, 186, 189 y 192. Liberacion hidrolftica de acidos glucuronicos insaturados a partir de oligosacaridos producidos por las reacciones de polisacarido liasas.
Glucan 1,4-a-glucosidasa
SEQ ID NOs. 195 y 198. Hidrolisis de residuos de a-D-glucosa (1->4)-unida terminales sucesivamente desde extremos no reductores de las cadenas con liberacion de p-D- glucosa.
a-1,2-manosidasa
SEQ ID NOs. 201, 204, 207, 210, 213 y 216. Elimina residuos de manosa a-1,2- de Man(9)(GlcNAc)(2) mediante hidrolisis.
a-1,3-glucanasa
SEQ ID NOs. 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249 y 252. Degrada a-1,3-glucanos y tambien se habilita para eliminar placas dentales. Esta enzima se puede aplicar como ingredientes activos en enjuague bucal, pasta dental, gel dental o goma de mascar para evitar la acumulacion de biopolfmeros de glucosa y tambien pueden ser utiles en todas las otras formas de higiene bucal preventiva.
a-L-fucosidasa
SEQ ID NOs. 255 y 258. Hidrolizar la fucosa a-1,6-ligada unida a la N- acetilglucosamina de extremo reductor de las fracciones de carbohidrato de las glicoprotemas.
Xilano p-1,4-xilosidasa
SEQ ID NOs. 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288 y 291. Hidrolisis de (1->4)-p-D-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de los terminales no reductores.
Endo-1,5-a-L-arabinosidasa
SEQ ID NOs. 294, 297, 300 y 303. Hidrolisis de la estructura principal de L- arabinofuranosida a-1,5-unida en (1->5)- arabinanos.
Endo-1,4-p-xilanasa
SEQ ID NOs. 306, 309, 312 y 315. Endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-xilosfdicos en xilanos y producen xilosa. Esta enzima es crucial para despolimerizacion de hemicelulosas y tiene una aplicacion industrial potencial, tal como en bioblanqueadores, fabricacion de papel y en las industrias de alimentacion y alimentacion animal. Otras aplicaciones potenciales incluyen la conversion de xilano en residuos de industrias agncolas y alimenticios en xilosa, y la produccion de materias primas qrnmicas y de combustible.
a-arabinofuranosidasa
SEQ ID NOs. 318, 321, 324, 327, 330 y 333. Hidrolisis de residuos de a-L-arabinofuranosida no reductores terminales en a- L-arabinosidas.
p-galactosidasa
SEQ ID NOs. 336, 339, 342, 345, 348 y 351. p-galactosidasa tiene propiedad catalttica para hidrolizar lactosa en glucosa y galactosa. Asf que esta enzima se ha utilizado para elaborar leche y productos lacteos fermentados. Se ha utilizado para evitar cristalizacion de lactosa, para mejorar dulzura, para aumentar la solubilidad del producto lacteo en las industrias de lacteos. Mas aun, se ha utilizado para producir productos alimenticios que contienen bajo contenido de lactosa para personas con baja tolerancia a la lactosa. Por lo tanto, el uso de p-galactosidasa es una de las aplicaciones mas prometedoras de enzimas para las industrias alimenticias.
Endo-1,4-p-galactanasa
SEQ ID NOs. 354, 357 y 360. Endohidrolisis de enlaces (1->4)-p-D- galactosfdicos en arabinogalactanos.
Endo-1,6-p- galactanasa
SEQ ID NO. 363. Hidrolisis de enlaces (1->6) en (1->6)-p-D-glucanos.
Endo-1,4-p-mananasa
SEQ ID NO. 366. Hidrolisis de enlaces (1->4)-p-D-mannosfdicos en mananos, galactomananos y glucomananos
La presente invencion y divulgacion tambien se refiere a (a) vectores de acido nucleico que comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende cualquiera de las secuencias anteriores de los genes y/o sus complementos; (b) construcciones de expresion que comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende cualquiera de las 5 anteriores secuencias de codificacion de los genes unida operablemente con un elemento regulador que dirige la expresion de las secuencias de codificacion; y (c) celulas anfitrionas recombinantes que comprenden cualquiera de las
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anteriores secuencias del gen, que incluyen las regiones de codificacion unidas operativamente con un elemento regulador que dirige la expresion de las secuencias de codificacion en las celulas anfitrionas.
Las tecnicas para modificar secuencias de polinucleotidos utilizando metodos de ADN recombinante son bien conocidas en la tecnica. Las diversas secuencias se pueden unir de acuerdo con tecnicas conocidas, tales como restriccion, union de sitios de restriccion complementarios y ligadura, terminacion roma al rellenar salientes y ligadura roma o similares. Los enlaces y adaptadores poli se pueden emplear, cuando sea apropiado, e introducir o eliminar mediante tecnicas conocidas para facilitar el ensamble de los vectores de ADN y construcciones de expresion. Una gran cantidad de vectores esta disponible para clonacion y manipulacion genetica. Normalmente, la clonacion se puede realizar en E. coli.
En otra realizacion de la invencion, los vectores que comprenden una secuencia de genes enzimaticos de la invencion pueden comprender adicionalmente funciones de replicacion que permiten la transferencia, mantenimiento y propagacion de los vectores en una o mas especies de celulas anfitrionas, que incluyen, pero no se limitan a, celulas de E. coli, celulas fungicas filamentosas, celulas de levadura y celulas de Bacillus. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la celula anfitriona, se integra en el genoma y de replica junto con el (los) cromosoma(s) en el que se ha(n) integrado. La eleccion del vector dependera normalmente de la compatibilidad del vector con la celula anfitriona en la que se va a introducir el vector.
La construccion de expresion de la invencion comprende un promotor, una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de genes de la invencion, una secuencia de terminacion de transcripcion y un marcador seleccionable (opcional). Se puede utilizar cualquier metodo conocido en la tecnica para introducir esta construccion de expresion en una celula anfitriona. Las celulas fungicas se pueden transformar mediante un proceso que involucra la formacion de protoplastos, la transformacion de los protoplastos y la regeneracion de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformacion de celulas anfitrionas de Aspergillus y Trichoderma se describen en los documentos EP 238 023 y Yelton MM, Hames JE, Timberlake WE. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. PNAS,1984; 81(5):1470-1474. Los metodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier L, Daboussi MJ, Julien J, Roussel F, Scazzocchio C, Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 1989; 78:147-156, y el documento WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker Dm, Guarente L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. In: Abelson JN and Simon MI (eds), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1991; 194:182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology, 1983;153: 163-168 and Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. Transformation of yeast. PNAS, 1978; 75 (4):1929-1933.
Para aplicaciones industriales, las enzimas de la presente invencion se producen por una celula fungica. Preferiblemente, la expresion celula anfitriona es una celula fungica filamentosa que se ha utilizado en fermentacion industrial a gran escala. Se pueden elegir estirpes celulares o sistemas anfitriones apropiados para garantizar la correcta modificacion y procesamiento de la protema extrana expresada. Preferiblemente, se selecciona un anfitrion de expresion que sea capaz de secrecion eficiente de sus protemas endogenas. Una celula anfitriona tambien se puede elegir por deficiencias en las actividades de proteasa extracelular ya que la enzima secretada se puede degradar en el medio de cultivo.
La presente invencion tambien se refiere a metodos para producir un polipeptido de la presente invencion, que comprende y/o consiste en: (i) cultivo de una celula, que en su forma silvestre es capaz de producir el polipeptido, bajo condiciones propicias para la produccion del polipeptido; y (ii) recuperacion del polipeptido. En un aspecto preferido, la celula es de M. phaseolina.
En otra realizacion de la invencion tambien se refiere a metodos para producir un polipeptido de la presente invencion, que comprende y/o que consiste de: (i) cultivo de una celula anfitriona bajo condiciones conductoras para la produccion del polipeptido, en las que la celula anfitriona comprende una secuencia de nucleotidos o el complemento de dichas secuencias de la SEQ Id No. 2, en las que la secuencia de nucleotidos codifica un polipeptido que comprende y/o consiste de cualquiera de los polipeptidos maduros de la SEQ ID No. 3, y (ii) recuperacion del polipeptido. La divulgacion tambien se refiere a metodos para producir un polipeptido de la divulgacion, que comprende y/o que consiste de: (i) cultivo de una celula anfitriona bajo condiciones conductoras para la produccion del polipeptido, en el que la celula anfitriona comprende una secuencia de nucleotidos o el complemento de dichas secuencias de las SEQ ID Nos. 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239,

242, 245, 248, 251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311,
314, 317, 320, 323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362, 365, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115,

118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187,

190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259,

262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286, 289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331,
334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358, 361 o 364, en los que la secuencia de nucleotidos codifica un polipeptido
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que comprende y/o consiste de cualquiera de los polipeptidos maduros de las SEQ ID Nos. 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117,

120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189,

192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261,

264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333,
336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363 o 366, y (ii) recuperacion del polipeptido.
En otra realizacion de la presente invencion, las celulas anfitrionas de expresion o transformantes se cultivan en un medio nutriente adecuado para el crecimiento y la expresion de protemas utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la celula se puede cultivar mediante el cultivo en matraz de agitacion y en fermentacion a pequena escala o gran escala (que incluyen fermentaciones continuas, en tanda, discontinuas o en estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipeptido se exprese y/o aisle. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrogeno y sales inorganicas, utilizando procedimientos conocidos en la tecnica (vease En: More Gene Manipulations in Fungi. Bennett J W, Lasure L., (eds). 1991; Academic Press, San Diego, CA). Si el polipeptido se secreta en el medio nutriente, el polipeptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipeptido no se secreta en el medio, se puede recuperar de los lisados celulares.
Los polipeptidos se pueden detectar utilizando metodos conocidos en la tecnica que son espedficos para los polipeptidos. Estos metodos de deteccion pueden incluir el uso de anticuerpos espedficos, la formacion de un producto enzimatico o la desaparicion de un sustrato enzimatico. Se puede utilizar un ensayo enzimatico para determinar la actividad del polipeptido.
El polipeptido producido se puede recuperar utilizando metodos conocidos en la tecnica. El polipeptido se puede recuperar en diversos metodos del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, filtracion, centrifugacion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion y precipitacion o una combinacion de los mismos.
Los polipeptidos de la presente invencion se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos que son bien conocidos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, el metodo de cromatograffa (tal como intercambio ionico, afinidad, hidrofobico, cromatofocus y exclusion de tamano), procedimientos electroforeticos (tales como enfoque isoelectrico), solubilidad diferencial (tal como precipitacion con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extraccion para obtener polipeptidos sustancialmente puros (vease los detalles en Protema Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. Janson JC, Ryden L. (eds(). 1989; VCH Publishers Inc., New York).
La presente invencion tambien se refiere a productos genicos (por ejemplo, ARN o protemas) que se codifican por las secuencias de genes establecidas en las SEQ ID Nos. 2. La divulgacion tambien se refiere a aquellos productos genicos (por ejemplo, ARN o protemas) que se codifican por las secuencias de genes establecidas en las SEQ ID Nos. 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 95, 98, 101, 104, 107, 110, 113, 116, 119, 122, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176,
179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 230, 233, 236, 239, 242, 245, 248,
251, 254, 257, 260, 263, 266, 269, 272, 275, 278, 281, 284, 287, 290, 293, 296, 299, 302, 305, 308, 311, 314, 317, 320,
323, 326, 329, 332, 335, 338, 341, 344, 347, 350, 353, 356, 359, 362 y 365. Los productos genicos enzimaticos de la divulgacion tambien incluye aquellos ARN o protemas que se codifican por las secuencias genomicas de los genes como se establece en las SEQ ID Nos. 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97, 100, 103, 106, 109, 112, 115, 118, 121, 124, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214,
217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 238, 241, 244, 247, 250, 253, 256, 259, 262, 265, 268, 271, 274, 277, 280, 283, 286,
289, 292, 295, 298, 301, 304, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325, 328, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 358,
361 y 364. Las enzimas de la invencion comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionados del grupo que comprende y/o que consiste de la SEQ ID No. 3. Las enzimas de la divulgacion comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que comprende y/o que consiste de las SEQ ID Nos. 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117,

120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189,

192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261,

264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333,
336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363 y 366.
Las enzimas de la presente invencion exhiben por lo menos una de las actividades de una enzima seleccionada del grupo que comprende y/o que consiste de p-1,4-endoglucanasa, celobiohidrolasa , p-glucosidasa, a-glucosidasa, Exo- 1,3-p-glucanasa, a-glucan liasa, a-xilosidasa, b-glucuronil hidrolasa d-4,5-insaturada, amiloglucosidasa, a-1,2- manosidasa, a-1,3-glucanasa, a-fucosidasa, xilano 1,4-p-Xilosidasa, endo-1,5-a-arabinosidasa, Endo-1,4-p-xilanasa, a- arabinofuranosidasa, p-galactosidasa, Endo-1,4-p-galactanasa, Endo-1,6-p-glucanasa y endo-p-1,4-mananasa. Los productos genicos enzimaticos de la invencion se pueden producir facilmente, por ejemplo, mediante tecnicas sinteticas o por metodos de tecnologfa de ADN recombinante utilizando tecnicas que son bien conocidas en la materia (Vease, Creighton TE. Proteins: Structures and Molecular Principles, 1983; W. H. Freeman and Co., N.Y.)
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En otra realizacion, los metodos y composiciones de la divulgacion tambien incluyen protemas y polipeptidos que representan productos genicos funcionalmente equivalentes. Dichos productos genicos funcionalmente equivalentes incluyen, pero no se limitan a, variantes naturales de los polipeptidos que tienen una secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID Nos. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153,

156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225,

228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297,

300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363 y 366.
Dichos productos genicos equivalentes pueden contener, por ejemplo, supresiones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoacidos dentro de las secuencias de aminoacidos codificadas por las secuencias de genes de enzimas descritas anteriormente, pero que resultan en un cambio silencioso, produciendo de esta manera un producto funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoacidos se pueden hacer sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos involucrados.
Se pueden hacer otras modificaciones de las secuencias de codificacion del producto genico descritas anteriormente para generar polipeptidos que son mas adecuados, por ejemplo, para expresion, para ampliacion, etc. en una celula anfitriona elegida. Por ejemplo, los residuos de cistema se pueden eliminar o sustituir con otro aminoacido con el fin de eliminar puentes de disulfuro.
Otra realizacion de la presente invencion incluye adicionalmente enzimas de la presente invencion en forma solida. Las enzimas en forma solida o granulado enzimatico se pueden utilizar, por ejemplo, en detergentes solidos y en alimentos para animales. Los metodos para fabricar formas solidas de enzimas son bien conocidos en la tecnica, tales como, pero no se limitan a perlado (enfriamiento por pulverizacion en un material ceroso), extrusion, aglomeracion o granulacion (dilucion con un material inerte y aglutinantes). Se contemplan composiciones enzimaticas solidas que comprenden una forma solida de una enzima de la invencion, en la forma de polvo mixto, comprimidos y similares.
Ejemplo
El siguiente ejemplo pretende ilustrar adicionalmente la invencion, sin ninguna intencion de que la invencion se limite a las realizaciones espedficas descritas en la misma.
Ejemplo 1 Aislamiento de ADN genomico de M. phaseolina
El ADN genomico se aislo de la cepa ms6 de M. phaseolina utilizando los procedimientos descritos por Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208. Brevemente, se rasparon micelios de una placa de Petri de reserva utilizando un bucle de inoculacion y se inocularon en un medio lfquido de dextrosa de papa en un matraz conico. El matraz conico se incubo sin agitacion durante aproximadamente 72 horas a 30°C. Los micelios crecen sobre la superficie en la interfaz aire-medio. Los micelios se recogieron utilizando un palillo de dientes esteril y se colocaron entre toallas de papel esteriles y se lavaron varios con solucion fisiologica (tampon de fosfato de sodio, pH 7.0). Los micelios se exprimieron para eliminar el exceso de lfquido y los micelios recogidos se dejaron secar al aire durante 30 minutos. Los micelios semisecos se colocaron en nitrogeno lfquido y se trituraron para generar polvo fino y finalmente aislar el ADN siguiendo el protocolo descrito en Kieser T, Bibb Mj, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208.
Ejemplo 2 Diseno y smtesis de cebadores
Los cebadores utilizados en el estudio se disenaron a partir del transcriptoma curado manualmente y los “modelos geneticos” predichos a partir de las secuencias genomicas de la cepa ms6 de M. phaseolina, al seleccionar las secuencias manualmente con ORF completos o utilizando bases de datos en las que genes similares se hayan aislado con exito de otras plantas. El analisis bioinformatico comparativo de las secuencias de nucleotidos obtenidas del transcriptoma se llevo a cabo utilizando NCBI BLAST, BLASTP, RPS-BLAST, BLASTX y PSI-BLAST para identificar homologos de los genes relacionados y para la correcta identificacion del gen. Las alineaciones de secuencias de nucleotidos se realizaron utilizando clustalW version 1.82 cuando se encontraron secuencias multiples del “agrupamiento de genes”. Luego se edito la alineacion. Los cebadores espedficos de gen (tanto hacia adelante como hacia atras) se seleccionaron manualmente o mediante la herramienta Primer 3 plus y los cebadores se sintetizaron a la medida.
Todos los oligonucleotidos utilizados en este estudio se sintetizaron y se purificaron en HPLC por el proveedor y se adquirieron de Integrated DNA Technologies (lDT). La solucion madre de 100 pmol se preparo en ddH2O de autoclave y se almaceno a aproximadamente -20°C, en alfcuotas para uso. Se utilizaron secuencias de oligonucleotidos como cebadores para PCR.

Claims (14)

  1. 5
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    15
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    50
    1. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que es: por lo menos 90% identica a una secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID No. 2, en la que dicha molecula de acido nucleico codifica una p-1,4-endoglucanasa.
  2. 2. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que dicha molecula tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleotidos establecida en la sEq ID No. 2.
  3. 3. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1, en la que dicha molecula tiene por lo menos 98% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleotidos establecida en la sEq ID No. 2.
  4. 4. La molecula de acido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es de cadena sencilla.
  5. 5. Una molecula de acido nucleico que comprende la molecula de acido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ininterrumpida por un codon de parada dentro una secuencia de codificacion que codifica una protema o peptido heterologo.
  6. 6. Una construccion reivindicaciones 1 a 3.
    recombinante que comprende la molecula de acido nucleico aislada de cualquiera de las
  7. 7. Una construccion
    de expresion que comprende la molecula de acido nucleico aislada de cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a
    3, en la que la secuencia de nucleotidos se asocia operativamente con una secuencia de
    nucleotidos reguladora que contiene senales reguladoras transcripcionales o traduccionales, o ambas, que controlan la expresion de la secuencia de nucleotidos en una celula anfitriona.
  8. 8. Una celula anfitriona disenada geneticamente que comprende la molecula de acido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  9. 9. Un metodo para elaborar un polipeptido que comprende las etapas de:
    i. cultivar una celula transformada con la construccion de expresion de la reivindicacion 7 bajo las condiciones apropiadas para producir el polipeptido; y
    ii. aislar el polipeptido.
  10. 10. Un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 95% identica a una secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID No. 3, y exhibe la actividad catalftica de p-1,4-endoglucanasa.
  11. 11. El polipeptido de la reivindicacion 10, en el que dicho polipeptido tiene por lo menos 98% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID No. 3.
  12. 12. Una protema quimerica que comprende el polipeptido aislado de la reivindicacion 10 o reivindicacion 11 se fusiona a traves de un enlace covalente a una secuencia de aminoacidos de un segundo polipeptido.
  13. 13. Una celula anfitriona, transformada con la construccion de expresion de la reivindicacion 7, en la que dicha celula anfitriona produce una enzima que acelera la degradacion celulolttica.
  14. 14. Un hongo transgenico de M. phaseolina con degradacion celulolttica mejorada, que comprende la construccion de expresion de la reivindicacion 7.
    imagen1
    LrdDpiucanasa, rampe enlaces sr'erros para inlerrumpir
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2018003617A1 (es) * 2018-12-14 2019-03-22 Univ Santiago Chile Polipéptido con actividad xilanasa, secuencia nucleotídica que lo codifica, ingrediente y proceso que comprende dicho ingrediente para la preparación de un producto alimenticio

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
WO2001025406A1 (en) * 1999-10-01 2001-04-12 University Of Victoria Innovation & Development Corporation Mannosidases and methods for using same
EP2277997B1 (en) * 2001-06-26 2013-09-18 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase I activity and polynucleotides encoding same
US7572950B2 (en) 2002-07-04 2009-08-11 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Methods for obtaining pathogen resistance in plants
WO2005007869A2 (en) 2003-07-10 2005-01-27 Third Wave Technologies, Inc. Assays for the direct measurement of gene dosage
JP2008508868A (ja) * 2004-08-06 2008-03-27 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ボトリオスファエリア・ロジナのポリペプチド
FI122029B (fi) 2008-12-30 2011-07-29 Ab Enzymes Oy Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö

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